Summary
ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.
Abstract
細胞小胞 (Ev) は、膜小胞の細胞外微小環境に様々 な細胞によって放出です。EVs は、異種の小胞の人口は 40 と 1,000 nm 間のサイズの範囲を表しています。蓄積された証拠は、EVs がホスト病原体の相互作用で重要な規制の役割を果たすことを示した。住血吸虫の EVs の深い理解は、住血吸虫ホスト相互作用、住血吸虫症に対する新しい戦略の開発を有効にするメカニズムに洞察力を提供しなければなりません。ここでは、さらにアダルト日本住血吸虫(S. ササユリ) から分離・同定 EVs のためのプロトコルを提示による住で EVs 機能を研究を目指しています。EVs は体外培養液遠心商業エキソソーム分離キットと組み合わせての使用から分離しました。分離されたs. ササユリEVs (SjEVs) は通常 100-400 nm の直径を持つし、透過電子顕微鏡と西部にしみが付くことによって特徴付けられます。PKH67 色素標識 SjEVs の使用は、SjEVs は受信者の細胞によって内面化を実証しています。全体として、我々 のプロトコルは大人住; から EVs を分離するための代替方法を提供します。分離 SjEVs の機能解析が適さない場合があります。
Introduction
細胞小胞 (Ev) は、様々 なタンパク質、脂質、核酸でカプセル化されます小さな膜結合型ベシクルの人口です。EVs が細胞間の情報伝達に重要な役割を果たして、細胞の分化、免疫調節、血管新生、セル移行2など多数の生理学的なプロセスの規則にかかわる最近の研究を実証 3,4,5。証拠の蓄積は、EVs を, 循環エクソソーム、および miRNA 貨物が特定疾患6の潜在的なバイオ マーカーを表すことを示します。
トリコモナス、 cruzi トリパノソーマの原因、リーシュ マニア属などのいくつかの原生動物、EVs; を分泌することができることが示されている。寄生虫が見つかってまた7をホストの生活に EVs を分泌します。寄生 EVs 感染、病原性8、および免疫調節9の維持に関与することが示されています。住での最近の調査は両方のマンソン住血吸虫(マンソン住血吸虫など) 10、11 S. ササユリ12アダルト住がありますエキソソームのような小胞を分泌することが示されています。特定の生物学的プロセスの機能の規則にかかわる。
日には、超遠心法、限外濾過法13イムノアフィニティーカラム分離、サイズ排除クロマトグラフィー, ポリマー ベースの試薬の使用など、細胞の小胞を分離するいくつかの方法を使用されています。これらの異なる方法では、独自の利点と制限14を所有しています。一般的に、遠心は小胞の分離のためのゴールド スタンダード メソッドと見なされます。ただし、このメソッドは、潜在的な EV 集計14の制限に苦しみます。
住、いくつかのメソッドは、EV の分離報告されている: 遠心11,12,10といくつかの段階 (卵16、商用 EV 分離キット16の利用が含まれますschistosomula11, アダルト住10,12,17)。ベンチの遠心分離機、限外濾過から EVs を分離するための市販 EV 分離キットの使用を組み合わせた代替法を開発した機構の解明は、1000 ナノメートル数百ナノメートルからのサイズの広い範囲が、アダルト日本住血吸虫。分離の EVs は、通常 100-400 nm の直径を所有し、正常に受信者の細胞によって内面化されました。
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Protocol
上海中国農業科学院獣医研究所倫理委員会で承認されたすべての動物実験 (許可番号: SHVRIAU-14-0101)。
1住の体外培養。
注:住は、バイオハザードを表しています。労働者は関連生物学的材料をワーム、感染後懸濁液、または他を処理する場合もすべてのラテックス手袋を着用ください。ニュージーランドのウサギは、腹部の被曝経由~ 2,000 セルカリアに感染していた。肝の段階で住は肝臓と腸間膜静脈の血流で 28 日後の感染症で米住血吸虫セルカリアに感染ウサギから収集されました。ワーム コレクションのプロシージャは、マウス18研究報告以前の出版物で参照されています。
- 500 mL ビーカーに寄生虫を収集します。それらを徹底的に洗浄し、200 ml の軽く 3 倍予熱 (37 ° C) PBS (pH 7.4)。
- 各 90 mm のシャーレの ~ 200 ワームのペアを区切ります。寄生虫を徹底的に洗うし、軽く 2 倍の 50 mL の予熱 (37 ° C) RPMI 1640 培養液中のペニシリンとストレプトマイシンの 100 mg/mL 100 U。
- 37 ° C 未満 5 %90 mm ペトリで h 2 〜 5 ワームのペア/mL の密度で CO2皿で抗生物質なし予熱した RPMI 1640 培養液 40 mL に寄生虫を維持します。
ノート:RPMI 1640 培地に血清を含めることはできません、それ以外の場合、外因性細胞小胞が導入されます。
2. 前処理条件メディア
- 培養液を収集し、2,000 × g の卵を削除し、被蓋の破片をワーム 30 分で 4 ° C にある媒体を遠心分離します。
- 新鮮なチューブに上清を転送し、0.22 μ m シリンジ フィルターを使用して、ソリューションをフィルターします。
- 透析バッグ フィルタ リング ソリューションを収集 (分子量カットオフ: 3.5kD)、一晩 4 ° C で 8 %peg8000 溶液を使用して、ソリューションを dialyze と。
ノート:この手順は、SjEVs 分離の収量を高めるため SjEVs を豊かにすることが重要です。
3. SjEVs の単離
- 透析のソリューションを新しいチューブに転送し、0.5 合計エキソソーム分離試薬量を追加します。
- ボルテックスやソリューションの均一性を確保するため、上下ピペッティングでよくソリューションをミックスします。
- 2 の ° C ~ 8 ° C で混合物を一晩インキュベートします。
- 2 の ° C ~ 8 ° C で 1 時間 15,000 × g で混合物を遠心分離します。
- 吸引し、上澄みを廃棄します。
ノート:EVs は、(ほとんどの場合に表示されません) の管の下部にペレットに含まれています。 - 2 mL の PBS で EVs ペレットを再懸濁し、詳細な分析まで-80 ° C で EVs ソリューションします。
4 西部にしみが付くことによって Ev の特性
- 例えば、 BCA アッセイで SjEVs サンプルのタンパク質濃度を決定します。
- 22.5 μ L RIPA バッファー内の EVs の 10-20 μ g を準備します。バッファーおよび 95 ° C で 5 分間熱ロード x 4 の 7.5 μ L を追加します。
- SjEVs タンパク質を 12 %sds ページのゲルに区切ります。
- PVDF 膜に蛋白質を転送および抗うさぎ IgG HRP (1:5, 000 希釈) に調査続く反 CD63 抗体 (1:1, 000 の希釈) をプローブします。
- 膜開発の ECL 検出試薬を使用し、化学発光イメージング システムによって信号を検出します。
5. 電子顕微鏡による Ev の特性
- 200 メッシュ ホルムバール コーティング グリッドに孤立した SjEVs の 2 μ l 添加し、室温で乾燥すること。
- 1 分リンタングステン酸 2% で染色し、室温で乾燥します。
- 透過型電子顕微鏡の試料ホルダーの上にグリッドをロードし、イメージのキャプチャ用 80 kV 電子ビームにさらされています。
6. SjEVs ラベル PKH67 と細胞取り込みアッセイ
ノート:これ以降の手順は、特に明記しない限り周囲温度 (20-25 ° C) で行われました。
- 円錐底部ポリプロピレン チューブに 5 μ g SjEVs ソリューションを転送し、RPMI 1640 媒体を追加して 12 mL にボリュームを調整します。
- SjEVs のペレットへの 4 ° C で 90 分 110,000 × g で SjEVs を遠心します。
- 遠心分離の後上澄みを慎重に吸引します。
注:これは異種染色および減らされた細胞生存率になると、SjEV ペレットに直接 PKH67 アルコール染料を追加しないでください。 - SjEV ペレット; に 1 mL の希釈剤 C を追加して 2 x EV 停止ソリューションを準備します。完全な分散するように、穏やかなピペッティングで再懸濁します。
- 希釈ハ染色直前に希釈 C の 1 ml ポリプロピレン製遠心管に PKH67 エタノール色素溶液 2 μ L を追加し、分散させるためによく混合色素溶液 x 新鮮な 2 を準備します。
- EV 停止 (ステップ 6.4) 2 x の染料の解決 (手順 6.5) とすぐに 1 mL にピペットでサンプルをミックス 2 x の 1 mL を急速に追加します。
- 4 分間室温で混合物を孵化させなさい。
- FBS の 4 つの mL を追加することによって染色を停止し、1 分間インキュベートします。
- 12 mL にボリュームを調整して、90 分の 4 ° C で 110,000 × g で遠心分離 RPMI1640 培地を追加します。
- 上澄みを除去し、PKH67 ラベル SjEV ペレットを再懸濁しますに RPMI1640 培地を追加します。
- 90 分 1 回洗浄し、SjEVs ペレットを再懸濁しますに PBS を追加するための 4 ° C で 110,000 × g で遠心分離機します。
7. SjEVs 細胞取り込みアッセイ
- NCTC など種の哺乳類細胞 1469 セルまたは 6 ウェル プレート (2 × 105細胞/ウェル) HEK293T 細胞を複製し、一晩培養します。
- 5 μ g PKH67 ラベル SjEVs を追加し、37 ° C 2-4 h での細胞の培養します。
- インキュベーション後、メディアを取り出して、PBS のセルを 2 回洗います。
- 4% ホルムアルデヒド溶液中 15 分間とセルを修正し、PBS で 2 回洗浄します。
- 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と細胞核を染色します。
- 蛍光顕微鏡を用いた細胞を観察します。
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Representative Results
記述のプロトコルを使用して孤立した SjEVs の収量を定量化するには、28 日アダルト住から分離された SjEVs の蛋白質の集中をアクセスするのに BCA タンパク質アッセイを使用しました。表 1に示すように、SjEV 蛋白質の集中は媒体 (表 1) の 100 mL あたり 250 μ g 208 μ g からであった。粒子サイズ モールヴァン ナノ粒子解析によって決定される表示分離 SjEVs が 100 であった nm ~ 400 nm、最高の人口約 220 nm の (図 1)。透過電子顕微鏡による SjEVs のさらなる特性 (図 2) の直径の約 100-200 nm の丸い小胞に EVs を明らかにしました。ウエスタンブロット分析表示、分離 SjEVs 認め CD63 抗体を用いた典型的な EV マーカー (図 3) であります。蛍光顕微鏡観察には、PKH67 ラベル SjEVs が NCTC クローン 1,469 細胞によって内面化されたことと、SjEVs が受信者細胞 (図 4) で主に配布されたことが示されます。
| サンプル | EVs/100 ml 培養液 |
| # 1 | 250 μ g |
| # 2 | 208 μ g |
| # 3 | 220 μ g |
表 1:SjEVs 蛋白質が培地から得られる; ~ 500 ワームのペアを含む培養液 100 mL あたり BCA アッセイによってアクセスされる SjEVs の量が表示されます。
図 1: 培地から SjEVs 孤立分布します。SjEVs 溶液 20 μ L 1000 μ L の PBS; で希釈しその後、混合物を高性能の 2 つの角度の粒子および分子サイズ アナライザーを使用して行った。結果は、3 つの独立した隔離からデータの代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 透過電子顕微鏡による SjEVs の特性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ウェスタンブロッティング CD63 抗体に対して分離 SjEVs の解析。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 動物細胞による SjEVs の取り込みします。SjEVs 標識 PKH が緑、表示され、細胞核が青で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Ev に関する最近の研究は、EVs は、宿主-病原体相互作用3,9,12,16で重要な役割を果たす、住血吸虫を実証しています。さらにアドレスに規制機能のそれは住から EVs を分離するため不可欠であります。ここでは、SjEV の分離のための代替方法をについて説明します。このメソッドは、100 から、SjEVs の広い範囲のサイズを生成 nm ~ 400 nm、アダルトs. ササユリ。次の細胞取り込みアッセイでは、EVs の記述の議定書の下で分離された正常に受信者の細胞によって内面化されたことと、関連付けられている Mirna が潜在的規制の役割17を再生を示されています。
EVs は、可能性がありますは、さまざまな種類の細胞によって分泌され、体液19の様々 な種類もあります。したがって、人工的に SjEV 分離のプロセス中に外因性の Ev を導入するを避けるために重要です。たとえば、培養液は血清を含めないでください。体外培養でワームの密度は、潜在的なストレス反応を最小限にし、ワームの死亡率を下げる合理的な必要があります。さらに、異なるホストから住やワームのさまざまな段階が異なる EVs を提示可能性がありますに注意してください。その結果、ホスト環境に近い培養環境で寄生虫を維持するために不可欠だし、分離を実行する SjEV の下で条件は同じでなければなりません。さらに、我々 は文化ストレスによる SjEVs に関連の差異の可能性を排除することができるは。
ここでは、大人の住文化メディア体外2 h からの SjEVs の隔離のためのプロトコルを提案する.このプロトコルの利点は、短い培養時間が非生理的 EV 分泌を引き起こす寄生虫は公開ストレスを最小限に抑えることです。さらに、これらの SjEVs は生物学的活性17ことを示唆している受信者の細胞によってこのプロトコルで説明されているように分離された SjEVs された内面がわかった。全体的にみて、この議定書でき大人から SjEVs の効率的な分離標準実験装置を使用してワームの西部にしみが付くことを使用して特性評価や細胞取り込みアッセイを有効に。分離の EVs は、さらに宿主-病原体相互作用を特徴付けるために使えます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、一部または全部、国家自然科学基金、中国の (31472187 および 31672550) および農業科学と中国農業科学院の技術革新プログラムでサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
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