Split grönt fluorescerande Protein System att visualisera effektorer levereras från bakterier vid infektion
Summary
Fluorescerande protein-baserade metoder för att övervaka effektorer utsöndras av bakterier in i värdceller är utmanande. Detta beror på inkompatibilitet mellan fluorescerande proteiner och i typ III sekretionssystemet. Här används en optimerad split superfolder GFP system för visualisering av effektorer utsöndras av bakterier in i växten värdcellen.
Abstract
Bakterier, en av den viktigaste smittämnen olika växtsjukdomar, utsöndrar en uppsättning effektor proteiner i växten värdcellen att undergräva immunsystemet växt. Under infektion levereras cytoplasmiska effektorer till värd cytosolen via en typ III-sekretionssystemet (T3SS). Efter leverans till cellen växt riktar effector(s) den specifika delar skall det ingå för att modulera cell värdprocesser för överlevnad och replikering av patogenet. Även om det varit lite forskning på subcellulär lokalisering av effektor proteiner i de mottagande cellerna att förstå deras funktion i patogenicitet med hjälp av fluorescerande proteiner, utredning av dynamiken i effektorer direkt sprutas från bakterier har varit en utmaning på grund av inkompatibilitet mellan T3SS och fluorescerande proteiner.
Här beskriver vi vår senaste metod av en optimerad split superfolder grönt fluorescerande protein system (sfGFPOPT) att visualisera localizationen av effektorer levereras via den bakteriella T3SS i värdcellen. SfGFP11 (11: e β-del av sfGFP)-märkta effektor utsöndras genom T3SS kan monteras med en viss organell riktade sfGFP1-10OPT (1-10th β-del av sfGFP) leder till fluorescens utsläpp på platsen. Detta protokoll ger en procedur för att visualisera ombildade sfGFP fluorescens signalen med en effektor protein från Pseudomonas syringae i en viss organell i Arabidopsis och Nicotiana benthamiana växter.
Introduction
Växter är oskaftade organismer som möter många invaderande patogener inklusive bakterier, svampar, virus, insekter och nematoder under hela deras livscykel. Bland phytopathogens, infektera de gramnegativa bakteriella patogenerna såsom Pseudomonas spp. och Ralstonia spp., deras värdväxter genom genom sår eller naturliga öppningar, såsom stomata och hydathode1. För att framgångsrikt kolonisera värdväxter, har bakteriella patogener utvecklats för att utveckla en mängd virulens faktorer2. När bakterier invaderar en värdväxt, de injicerar en serie av virulens proteiner — kallas effektorer — direkt in i växtcellerna att främja deras patogenicitet. Dessa effektorer undertrycka eller modulerar den växt medfödd immuniteten och manipulera de värd cellulära processerna för att resultera i bakteriell överlevnad3.
Patogena bakterier använder främst en T3SS för att leverera effektor proteiner direkt i host celler4. T3SS liknar en molekylär spruta med en nål-liknande kanal ansluter från en byggnadsställning proteinstruktur över inre och yttre bakteriell membranen till injektionsstället i den mottagande cell5. Denna T3SS-medierad effektor (T3E) sekretion mekanism är väl bevarade i olika gramnegativa bakteriella patogener av anläggningen samt mänskliga. En av de representativa växt patogenerna, P. syringae pv. Tomat DC3000 hrcC mutant som vanligtvis har en defekt T3SS, har begränsad tillväxt i växter sannolikt på grund av oförmågan av denna mutant att helt undertrycka den växt immunitet (genom att injicera effektor proteiner)6. Vid flyttning in i värdceller rikta effektorer olika värd proteiner som är viktiga för cell värdsystemet, inklusive växt försvar svaren, transkription av gener, celldöd, proteasom, vesikler människohandel och hormon vägar7 , 8 , 9 , 10. spårning av cellulära localizationen av effektor proteiner i de mottagande cellerna är därför ett attraktivt mål att förstå deras funktioner när det gäller modulering växt immunitet.
De flesta lokalisering studier av T3Es har anställt Agrobacterium –medierad överuttryck med ett stort fluorescens protein i den mottagande anläggning9. Metoden heterologa uttryck för gener som introduceras i andra arter har dock visat sig vara mis lokaliserade eller ibland icke-funktionella11,12,13. Flera studier visade dessutom att bakteriell effektorer genomgår förändring för korrekt inriktning värd celler och14,15,16,17. Därför, övergående uttryckte effektorer i cytosolen av anläggningen celler inte kan vara funktionellt eller kvantitativt identisk med de effektorer som levereras av T3SS på patogen infektion18. Fusion av stora fluorescerande taggar till effektor proteiner kan dessutom störa korrekt effektor leverans och visualisering18,19. Dessa synsätt till assay funktionen T3E återspeglar därför inte fullt infödda localizationen av de T3SS-utsöndras effektorer.
Ett grönt fluorescerande protein (GFP) består av en 11-strängat β-fat omslutande en central strand som inkluderar en kromofor20. Waldo o.a. rapporterade en roman split-GFP-system som består av en liten komponent (GFP β strand 11; GFP11) och ett stort kompletterande fragment (GFP β programdel 1-10; GFP1-10)21. Fragmenten fluorescerar inte själva men fluorescerar vid sin egen förening när båda fragment finns i närheten med varandra. För optimering av protein fällbara effektivitet utvecklades därefter robusta hopfällbara varianter av GFP, dvs, sfGFP och sfGFPOPT, split GFP system20,21,22. Nyligen, enda aminosyra muterade varianter av sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT och sfCFP1-10OPT– som kan rekonstruera med sfGFP11 fragment och Visa gul och cyan fluorescens respektive, var genererade23 . Dessutom sfCherry, ett derivat av mCherry, kan delas in i sfCherry1-10 och sfCherry11 fragment på samma sätt som sfGFP23.
Detta system har anpassats för att märka och spåra de T3SS effektorer i HeLa cells under infektion med effektorer från Salmonella24. Det var dock tidigare inte optimerad för växt-bakterie patogen värdsystemet. Nyligen har optimerat vi split GFP systemet baserat på den förbättrade sfGFP1-10OPT att övervaka subcellulär lokalisering av de T3Es som levereras från P. syringae in växt celler25. För att underlätta lokalisering studierna av T3Es till olika subcellulär fack i växtcellerna, en uppsättning av transgena Arabidopsis thaliana genererades växter för att uttrycka sfGFP1-10OPT i de olika subcellulär fack 25. Dessutom plasmidsna transporterar en mängd organell-riktade sfGFP1-10OPT för den Agrobacterium-medierad övergående överuttryck och sfGFP11-taggade vektorer för leverans av T3SS-baserade effektor genererades också. Frön av olika transgena Arabidopsis linjer och plasmidsna att uttrycka T3Es av intresse kan erhållas från källor som nämns i Tabell av material26,27.
I följande protokoll beskriver vi ett optimerat system för att övervaka dynamiken i effektorer levereras av bakterier i de mottagande cellerna använder split sfGFP systemet. Infektion av växter som uttrycker sfGFP1-10OPT med transgena Pseudomonas transporterar rekombinant sfGFP11 plasmid resulterar i en leverans av den sfGFP11-taggade effektor från Pseudomonas i värdcellen. Därför dessa proteiner är färdigberett och translocate till den specifika effektor mål delar skall det ingå. Pseudomonas syringae pv. tomat CUCPB5500 stam där 18 effektorer raderas, användes eftersom denna stam visade låg eller ingen celldöd i både A. thaliana och N. benthamianas28. Alla material och steg som beskrivs här kan dock ersättas eller ändras för att anpassa split sfGFP systemet för undersökning av andra biologiska frågor eller optimering i de givna laboratorieförhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protokollet som beskrivs här används för övervakning exakt lokalisering av effektor proteinerna injiceras genom den bakteriella T3SS i värdcellen växt vid infektion. Tidigare, split GFP systemet användes som ett verktyg för att studera den subcellulär lokalisering av protein från däggdjur23,36, Salmonella T3E lokalisering och Agrobacterium VirE2 leverans via T4SS in i den Anläggningen celler37. Tillämpa det…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2018R1A2A1A05019892) för DC och ett bidrag från växten molekylär avel Center ( PMBC) för Nästa Generation Biogreen 21 program för landsbygdens utveckling administrationen (PJ013201) att EP. Vi tackar imaging mitten av National Instrumentation Center för miljöledning att tillhandahålla confocal Mikroskop för filmning.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
Referências
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, &. #. 1. 9. 3. ;. Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- . Addgene Available from: https://www.addgene.org (2018)
- . Arabidopsis Biological Resource Center Available from: https://abrc.osu.edu (2018)
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
