Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik der endothelialen Differenzierung für kardiale Vorläuferzellen. Es konzentriert sich besonders auf wie Serum-Konzentration und Dichte Zelle Aussaat der endothelialen Differenzierung Potenzial auswirken.
Abstract
Kardialen Vorläuferzellen (CPCs) möglicherweise therapeutisches Potenzial zur kardialen Regeneration nach Verletzungen. Mitten in Erwachsenen Säugetier intrinsische CPCs sind extrem selten, aber erweiterte CPCs nützlich sein könnte für Zelltherapie. Voraussetzung für die Nutzung ist ihre Fähigkeit, in einer kontrollierten Weise in die verschiedenen kardialen Linien mit definierten und effiziente Protokolle zu differenzieren. Darüber hinaus auf in-vitro- Erweiterung CPCs von Patienten isoliert oder präklinischen Krankheitsmodelle können fruchtbare Recherche-Tools für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen anbieten.
Aktuelle Studien mit, dass verschiedene Marker CPCs bestimmt werden kann. Jedoch sind nicht alle von ihnen beim Menschen geäußert, beschränkt die translationale Auswirkungen einiger präklinischen Studien. Differenzierung-Protokolle, die unabhängig von der Isolation Technik und Marker Ausdruck gelten ermöglicht den standardisierten Ausbau und Grundieren der CPC-Gebote für Zelle Therapie Zweck. Hier beschreiben wir, dass die Grundierung des CPCs unter einer niedrigen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration und niedrigen Zelle Dichte Bedingungen erleichtert die endotheliale Differenzierung des CPCs. mit zwei verschiedenen Subpopulationen von Maus und Ratte CPCs, wir zeigen, dass Laminin a mehr geeignetes Substrat als Fibronektin zu diesem Zweck unter das folgende Protokoll: nach Kultivierung für 2-3 Tage in Medium einschließlich Ergänzungen, dass Multipotenz behaupten mit 3,5 % FBS, CPCs sind ausgesät und auf Laminin an < 60 % Zusammenfluss und kultiviert in Ergänzung-freies Medium mit niedrigen Konzentrationen des FBS (0,1 %) für 20-24 Stunden vor der Differenzierung in endothelialen Differenzierung Medium. Da CPCs eine heterogene Bevölkerung sind, Serumkonzentrationen und Inkubationszeiten möglicherweise je nach den Eigenschaften der jeweiligen CPC Subpopulation angepasst werden. Vor diesem Hintergrund kann auch auf andere Arten von CPCs sowie die Technik und bietet eine nützliche Methode, um das Potenzial und die Mechanismen der Differenzierung und wie sie von der Krankheit betroffen sind, bei CPCs isoliert vom jeweiligen Krankheitsmodelle zu untersuchen.
Introduction
Neuere Studien unterstützen die Existenz von resident kardialen Vorläuferzellen (CPC) in den Erwachsenen Säugetier-Herz1,2,3könnte, und CPCs eine nützliche Quelle für die Zelltherapie nach kardialen Schädigung4, 5. Darüber hinaus erweiterte CPCs können eine fruchtbare Modell vorsehen, dass Drogen-Screening und die Untersuchung der Krankheitsmechanismen bei Patienten mit seltenen Kardiomyopathien, oder vom jeweiligen Krankheit isoliert Modelle6,7.
CPCs isoliert aus dem Erwachsenen Herzen besitzen Stamm/Stammvater Zelle Eigenschaften1,2,3,8 , sind multipotent, klonogenen, und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Allerdings gibt es viele verschiedene (Teil-) Populationen des CPCs präsentiert verschiedene Oberfläche Marker Profile, einschließlich, zum Beispiel c-Kit, Sca-1 und andere, oder von unterschiedlichen Isolierungstechniken (Tabelle 1) abgerufen. Verschiedene Kultur und Differenzierung Protokolle wurden etablierte1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Diese Protokolle unterscheiden sich vor allem in Bezug auf den Wachstumsfaktor und Serum Inhalte, die nach dem Zweck der Kultivierung angepasst sind und zu unterschiedlichen Ergebnisse und Ergebnisse, einschließlich Differenzierung Effizienz führen kann.
Marker-basierte Isolationstechniken:
CPC-Gebote können isoliert werden, basierend auf einer bestimmten Oberfläche Marker Ausdruck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Frühere Studien deuten darauf hin, dass c-Kit und Sca-1 der beste Marker resident CPCs1,11,14,19,20isoliert werden kann. Da keiner dieser Marker für CPC-Gebote wirklich spezifisch ist, sind Kombinationen von verschiedenen Markern in der Regel angewendet. Z. B. während CPCs niedrige Konzentrationen von c-Kit21auszudrücken, ist c-Kit auch andere Zelltypen, einschließlich Mastzellen22, Endothelzellen23und hämatopoetischen Stammzellen/Progenitor Zellen24zum Ausdruck. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, dass nicht alle Markierungen auf allen Arten ausgedrückt werden. Dies ist der Fall für Sca-1, die Maus aber nicht in menschlichen25zum Ausdruck bringt. Daher kann die Protokolle verwendet, die unabhängig von der Isolierung Marker sind vorteilhaft im Hinblick auf klinische Studien und Untersuchungen mit humanen Proben sein.
Marker-unabhängige Isolierungstechniken:
Es gibt mehrere Haupttechniken der CPC-Isolation, die in erster Linie unabhängig von Surface Marker Ausdruck, aber das kann durch die aufeinander folgenden Auswahl der spezifischen Marker-positiven Unterfraktionen verfeinert werden, je nach Bedarf (siehe auch Tabelle 1). (1) die Seite Bevölkerung (SP) Technik wurde ursprünglich in einer primitiven Bevölkerung von hämatopoetischen Stammzellen, die auf der Fähigkeit basiert, Ausfluss der DNA-Farbstoff Hoechst 3334226 von ATP-bindende Kassette (ABC) Transporter27gekennzeichnet. Herzmuskelzellen SP wurden durch verschiedene Gruppen isoliert und berichtet, dass eine Vielzahl von Markern mit einigen kleinen Unterschieden zwischen Berichte2,8,13,14zum Ausdruck bringen. (2) koloniebildenden Einheit Fibroblastenzellen (KBE-Fs) ursprünglich definiert wurden basierend auf einer mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC)-wie Phänotyp. Isolierte MSCs sind auf Speisen induzieren Kolonie Bildung kultiviert. Koloniebildenden MSC-wie KBE-Fs kann von Erwachsenen Herzen getrennt werden und sind in der Lage, in kardialen Linien15zu unterscheiden. (3) Cardiosphere-abgeleitete Zellen (CDC) sind einzelne Zellen aus Gruppen von Zellen aus Gewebebiopsien gewachsen oder explants28,29,30,31. Es wurde kürzlich gezeigt, die meist die CD105+/CD90–/c-kit– Zelle Bruchteil Exponate, Cardiomyogenic und regenerative potenzielle32.
Hier bieten mit SP-CPCs von Mäusen isoliert, wir ein Protokoll zur effizienten Einarbeitung von endothelialen Linie basierend auf einer früheren Studie CPCs Ratte und Maus SP-CPCs33. Das Protokoll enthält spezifische Anpassungen an die Kultur und Ausbau Technik in Bezug auf die Zelldichte, der Serum-Inhalt des Mediums und dem Substrat. Es kann nicht nur auf Maus SP-CPCs angewendet werden, aber zu verschiedenen Arten von CPC-Gebote für den Zweck, einen Schicksal Wechsel von einer Verstärkung zu einer endothelialen begangen CPC zu induzieren, sei es im Hinblick auf die Transplantation dieser Zellen sowie deren Nutzung für mechanistische in-vitro- Studien.
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Protocol
Die Verwendung von Mäusen zu Zelle Isolierung Zweck wurde gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit dem Schweizer Tier-Schutz-Gesetz und wurde von den Schweizer Kantonen genehmigt.
Hinweis: Die Isolation der Sca-1+/CD31– SP-CPCs aus dem Herzen der Maus erfolgte im Wesentlichen als zuvor beschriebenen34 mit einigen Änderungen. Die Materialien und Reagenzien verwendet finden Sie unter Tabelle der Materialien. Für alle Experimente wurden kardiale SP-CPCs von Mäusen isoliert verstärkt passagiert und verwendet in einer Zelle Zeile-Manier. 7-20 Passagen wurden für diese Studie verwendet.
(1) Gewebe-Vorbereitung
Hinweis: Alle Experimente mit Mäusen müssen gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. Dieses Protokoll verwendet vier Mäuse. Kultur-Platten, die 100 mm Durchmesser sind, sind als P100 und Kultur-Platten, die 60 mm Durchmesser sind, als P60 für die folgenden Teile des Protokolls beschrieben sind.
- Jede Maus mit 200 mg/kg von Pentobarbital intraperitoneal zu injizieren (i.p.) und warten Sie, bis es vollständig betäubt ist, durch die Überprüfung ihrer Antwort kneifen bis Fuß.
- Wischen Sie die Brust mit 70 % Ethanol. Schneiden Sie die Haut und Brustwand mit einer Schere, der Brusthöhle verfügbar zu machen.
- Heben Sie das Herz mit der Pinzette und an der Basis mit einer Schere abschneiden. Setzen Sie das Herz in einem P100 mit 25 mL (5 mL für P60) kalt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (drei bis fünf Herzen pro P100) oder ein bis zwei Herzen pro P60.
- Pumpen Sie, das Herz mit der Pinzette, das Blut aus den Hohlräumen (Abbildung 1A) auszuwerfen.
- Setzen Sie das Herz in einem P100 mit 25 mL (5 mL für P60) von kaltem PBS zum Waschen. Entfernen Sie die Vorhöfe mit einer kleinen Schere. Schneiden Sie das Herz in zwei längliche Stücke und waschen Sie sie wieder in eiskaltem PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Übertragen Sie die Stücke auf eine neue P100 mit 25 mL (5 mL für P60) kaltem PBS. Schneiden Sie die Stücke in kleinere Stücke, die mit einer kleinen Schere (Abbildung 1 b). Geben Sie einen Tropfen 1 mg/mL Kollagenase B in Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) verdünnt und Hackfleisch Kleinteile gründlich mit einer sterilen Rasierklinge (Abbildung 1).
(2) Verdauung
- Fügen Sie der Kollagenase B Lösung 1 mg/mL 10 mL (2,5 mL für P60) in die Schale aus Schritt 1.6.
- Setzen Sie die Kollagenase B-Lösung mit Hackfleisch / Herz-Stück in eine schräge (ca. 30°) P100 (oder P60) in einem Inkubator 37 ° C (Abbildung 1).
- Inkubieren Sie die Hackfleisch / Herz-Stücke für maximal 30 min; homogenisieren Sie, indem man sie immer wieder durch eine Pasteurpipette alle 10 Minuten während der Inkubation (Abbildung 1E).
Hinweis: Es ist wichtig, 30 min Inkubation für Schritt 1.3 insgesamt nicht überschreiten.
(3) filtration
- Fügen Sie 10 mL (5 mL für P60) des kalten HBSS ergänzt mit 2 % FBS, Hackfleisch und homogenisierte Herz Stücke.
Hinweis: HBSS mit 2 % FBS Quenchen Kollagenase B Aktivität ergänzt. - Filtern Sie die Herz-Stücke durch 100 µm-Filter, unverdaute Gewebe und Zentrifuge bei 470 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) (Abb. 1F, Gelbfilter) zu entfernen.
- Verwerfen Sie den Überstand Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL (3 mL für P60) der roten Blutzelle Lysis Puffer und inkubieren Sie die Tablette für 5 min mit gelegentlichen schütteln auf Eis.
- Fügen Sie 10 mL (5 mL für P60) von PBS (um die Lyse Reaktion zu stoppen) und filtern die Probe durch einen 40 µm-Filter, größere Zellen, einschließlich residuale Kardiomyozyten (Abb. 1F, blaue Filter) auszuschließen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 470 X g für 5 min bei RT (ohne Bremse). Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 1 mL DMEM mit 10 % FBS.
- Zählen der Zellen in einem aliquoten mit einem Hemocytometer. Aufschwemmen der Zellen mit DMEM mit 10 % FBS, mit dem Ziel einer endgültigen Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL.
Hinweis: Etwa 5 x 106 Cardiomyocyte und Erythrozyten erschöpft Zellen per Mausklick abgeschätzt werden. - Verteilen Sie die Zellen in zwei Röhren (Abbildung 2): Add-in Rohr A, 1, 5 mL für Hoechst 33342 Färbung mit Verapamil; in Rohr B18,5 mL für Hoechst 33342 Färbung und zu färben und Durchflusszytometrie SP Herzmuskelzellen (Stufen 4.1 und 4.2) sortieren.
(4) Sortierung der kardialen SP-Zellen durch Durchflusszytometrie
Hinweis: Verapamil hemmt Hoechst Efflux von multidrug-Resistenz (MDR) ABC-Transporter-Aktivität blockiert. Hoechst 33342 ist ein DNA-Bindung-Farbstoff, der in lebenden Zellen verwendet werden kann, um den Zellzyklus zu erkennen, wie es mit der DNA-Gehalt korreliert. Hoechst 33342 Extrudieren Zellen erscheinen im unteren Teil der beiden Kanäle Emission Hoechst (450 nm, Hoechst blau; 650 nm, Hoechst rot), das heißt, abgesehen von der Hoechst-Beibehaltung "Bevölkerung", geben sie ihren Namen "Seite Bevölkerung". SP Zellen in Zellen mit Stammvater Eigenschaften angereichert sind und zeigen eine hohe Expression von multiresistenten ABC-Transporter (z. B. MDR1 und ABCG2). Hoechst 33342 wird als Hoechst für die folgenden Teile des Protokolls geschrieben. Es ist wichtig zum Schutz der lichtempfindlichen Materialien für optimale Ergebnisse.
-
Färbung mit Hoechst in an- und Abwesenheit von verapamil
- Verapamil (mit einer Endkonzentration von 83,3 µM) und Hoechst (mit einer Endkonzentration von 5 µg/106 -Zellen) der Zelle Projektmappe hinzufügen. Verwenden Sie für Schlauch AVerapamil und Hoechst; Verwenden Sie für Rohr BHoechst nur. In einem Wasserbad (bei 37 ° C) für 90 min inkubieren Sie und wieder die Schläuche alle 20 min (Abbildung 1).
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 470 X g für 5 min bei RT. verwerfen der Überstand und Aufschwemmen Sie jedes Pellet in HBSS (1 x 106 Zellen/mL).
- Nehmen Sie eine 1,5 mL aliquoten für einzelne Färbungen und Negativkontrolle aus Rohr B (Abbildung 2): (i) Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugierten Anti-Sca-1; (Ii) Allophycocyanin (APC)-konjugierten Anti-CD31; (Iii) nonstained Zellen (Negativkontrolle).
Hinweis: Isotype Steuerelemente werden hier für den Aufbau der Isolierung-Protokoll verwendet. - Zentrifugieren Sie Röhren A und B und die Single-Färbung und eine negative Kontrolle Aliquote 470 X g für 5 min bei RT für Hoechst und Verapamil auswaschen.
- Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie die Pellets Schlauch A und (Iii) die negativ-Kontrolle in 250 µL HBSS und halten sie auf dem Eis im Dunkeln bis zu sortieren.
- Dem Pellet Rohr B in 200 µL HBSS und das Pellet (i, Ii) der einzelnen Färbung Aliquote in 100 µL HBSS Aufschwemmen. FITC-konjugierten Anti-Sca-1 (0,6 µg/107 Zellen) und APC-konjugierten Anti-CD31 (0,25 µg/107 Zellen) hinzufügen. Brüten Sie die Pellets für 30 min auf Eis, und schütteln Sie sie von Zeit zu Zeit im Dunkeln.
- Die Rohre 2 mL HBSS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 470 X g für 5 min bei RT
- Den Überstand verwerfen und erneut alle Pellets mit 1 mL HBSS und Zentrifuge als oben. Entsorgen Sie die Überstände. Das Pellet Single-Färbung Aliquote in 200 µL HBSS aufzuwirbeln. Aufschwemmen der Pellet Schlauch B in HBSS (20 x 106 Zellen/mL).
- Halten Sie die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden, bis zu sortieren.
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Sortieren mit Durchflusszytometrie
- Bereiten Sie sterile 1,5 mL Sortierung Rohre mit 500 µL HBSS einschließlich 2 % FBS.
- Färben Sie die Zellen mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 Zellen) für 10 min auf Eis, abgestorbenen Zellen auszuschließen.
- Sortieren die kardialen SP mit folgenden Einstellungen: Hoechst mit 350 nm (UV) Erregung zu begeistern, Fluoreszenzemission mit einem 450/50 nm Bandpass-Filter (Hoechst blau) und 670/30 nm Bandpass-Filter (Hoechst rot) sammeln und verwenden eine Düsengröße von 100 µm und Druck 15 Psi.
- Für die Analyse, aufzeichnen, 5 x 105 Ereignisse für die Sortierung Proben und 1 x 105 Ereignisse für die Negativkontrolle, Verapamil Kontrolle und Single-Färbung Proben.
Hinweis: Die kardialen SP liegt bei etwa 0,5 % - 2 % (Abbildung 1 H) aber kann variieren zwischen Labors und Isolate. Die Sca-1+/CD31– Bruch liegt bei etwa 1 % - 11 % der gesamten kardiale SP (Abbildung 1I) aber variieren zwischen Labors und Isolate. SCA-1+/CD31– SP-CPCs sind als SP-CPC-Gebote für die folgenden Teile des Protokolls geschrieben.
(5) Primärkultur von isolierten SP-CPC-Gebote
Hinweis: In diesem Protokoll wurden drei verschiedene Arten von Medien verwendet. Sie werden als Medium 1 (gemäss Noseda Et Al.) bezeichnet 8, Medium 2 und Medium 3 und sind in der Tabelle der Werkstoffe hinsichtlich ihrer Zusammensetzung beschrieben.
- Warm up Medium 1 bis 37 ° C vor dem Gebrauch und der Zentrifuge auf 4 ° c abkühlen Die Sortierung Rohre bei 4 ° C und 470 X g für 6 min Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen im Medium 1.
- Setzen Sie die Zellen auf einem gasdurchlässigen P60 Teller mit 4 mL Medium 1. Das Medium jeder 3-d zu ändern, bis die Zellen Zusammenfluss von 70-80 % erreicht haben.
Hinweis: Schritt 5.2 kann etwa 2-3 Wochen dauern.
6. Erweiterung und Differenzierung der SP-CPC
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Zellkultur
- 3 x 105 SP-CPCs in 8 mL Medium 1 in ein Auffanggefäß T75-Kultur.
- Inkubieren Sie SP-CPCs bei 37 ° C mit 5 % CO2 bis 70-80 % Zusammenströmen, ändern des Mediums alle 2-3-d.
Hinweis: Die Anzahl von Zellen sollten nach der Art des CPCs verwendet, die Verdopplungszeit und Größe der Zellen geändert werden.
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SP-CPC Wachstum und Rentabilität unter unterschiedlichen Serumkonzentrationen
- Kultur SP-Kooperationssystem für 2-3-d in T75 Fläschchen mit 8 mL Medium 1. Vorsichtig aspirieren Sie das Medium und sanft mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS abspülen.
- Behandlung der Zellen mit 5 mL Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator, fügen Sie 5 mL Medium 1, die Trypsin-Aktivität zu stoppen und übertragen die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT
- Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 1 Medium oder Medium 2 (Linie Induktion Mittel) und Platte 2,5 x 105 SP-CPCs P60 Gerichte mit 3 mL Medium mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen.
- Sammeln Sie das Medium aus der Schale des Schrittes 6.2.4 für die Sammlung von abgestorbenen Zellen in ein 15 mL Röhrchen nach 2 d der Kultivierung in Medium 1 oder 2 Medium.
- Trypsinize adhärente Zellen wie in Schritt 6.2.2 und sammeln Sie die Zellsuspension in der 15 mL Tube von Schritt 6.2.5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 840 X g für 5 min bei RT
- Aspirieren Sie überstand und 1 mL Medium 1 oder 2 Medium für Zellzählung. Führen Sie SP-CPCs mit Trypan blau (0,4 %) und Graf Trypan blau-positiv (tot) und Trypan blau-negativ (praktikable) Zellen zu Flecken.
Hinweis: Der Zellviabilität (Schritt 6.2.7) wird als Trypan blau negative Zellzahl in Bezug auf die gesamte Zelle Nummer gegeben.
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Induktion der endothelialen Differenzierung
- Precoat eine (6-Well) Kultur-Platte mit 10 µg/mL Laminin (LN) oder Fibronektin (FN).
- Machen Sie eine Substratlösung enthält 10 µg/mL LN oder FN mit F12 Medium (oder PBS). Jede Vertiefung 2 mL Substratlösung hinzufügen. Pflegen Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C.
- Aspirieren Sie die Lösung aus der Platte und 2 mL PBS in jede Vertiefung bis zu benutzen.
- Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen aus Schritt 6.1.2, spülen Sie sie vorsichtig mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS, behandeln sie mit 5 mL Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator, fügen Sie 5 mL Medium 1, die Trypsin-Aktivität zu stoppen und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube.
- Zentrifugieren der Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT Aspirat überstand und Medium 2 für Zellzählung hinzufügen.
- 8 x 104 Samenzellen pro gut auf die beschichtete Platte mit 3 mL Medium 2 und halten Sie es bei 37 ° C für 20-24 h Änderung des Mediums zu 3 mL Medium 3.
Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung eine niedrigen Serum-Konzentration-haltigem Medium – und ohne Zusätze – für die ersten 20-24 h. Wir empfehlen mit < 60 % Zelle Zusammenfluss (d. h., die Handynummer des Schritts 6.3.4 hat je nach Zelle Größe und Wachstum angepasst werden). - Kulturzellen für 21 d und das Medium alle 3 d verändern.
- Überprüfen die endotheliale Natur von differenzierten Zellen färben sie mit eine endotheliale Marker wie z. B. von-Willebrand-Faktor (vWF) und darstellende Fluoreszenz-Mikroskopie.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und befestigen Sie die Zellen in 3,7 % Formaldehyd für 2 min bei RT
- Permeabilize der Zellen mit 0,1 % Triton X in DdH2O (oder PBS) für 30 min und mit 10 % Ziegenserum für 1 h bei RT blockieren
- Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper (1: 100) für 48 h bei 4 ° C
- Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, für 10 Minuten jedes Mal. Inkubieren sie mit Alexa Fluor 546 Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Waschen wieder 3 X für jeweils 10 min mit 1 mL PBS. Färben Sie die Zellkerne mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI; 1: 500) für 5 min bei RT in der Dunkelheit.
- Waschen Sie die Zellen 3 X für jeweils 5 min mit 1 mL PBS. Montieren Sie die Zellen und bei 4 ° C lagern
Hinweis: Die Kultivierung Bedingungen (Substrat, Medium, zusätzliche Reagenzien und FBS Konzentration) Schritte 6.1 und 6.3 sind in Abbildung 3beschrieben.
- Precoat eine (6-Well) Kultur-Platte mit 10 µg/mL Laminin (LN) oder Fibronektin (FN).
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Rohr-Bildung-assay
- Vorbereiten eine Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel, im folgenden als Matrix bezeichnet) Platte.
- Die Matrix bei 4 ° C über Nacht Auftauen.
- Mantel einer 96-Well-Platte mit 100 µL der Matrix auf Eis.
Hinweis: Es ist wichtig, Luftblasen in der Matrix zu vermeiden. Die Platten müssen auf Eis zu vermeiden, die Jellification der Matrix beschichtet werden. - Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C für 30 Minuten.
- Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen (nach Abschluss von Schritt 6.3.5), sanft spülen Sie die Zellen mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS, und behandeln sie mit Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator. Fügen Sie Medium 3 um die Trypsin-Aktivität zu stoppen und die Zellsuspension auf eine 15 mL Tube übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT Aspirat überstand, fügen Sie 1 mL Medium 3 und Pipettieren sanft.
- Filtern Sie die Zellen mit 35 µm Zelle Sieb, wenn die Zellen aggregiert werden.
- Zählen der Zellen und 2 x 103 bis 4 x 103 Zellen in 100 µL Medium 3 in jeder Matrix-beschichtete gut Samen. Halten Sie die Platte bei 37 ° C in der Zelle-Inkubator für 16 h.
- Nehmen Sie ein Bild mit einem Hellfeld Mikroskop mit 2 X Vergrößerung.
Hinweis: Im Falle eines unvollständigen Trypsinization verlängern Sie die Belichtungszeit, Trypsin-EDTA bis maximal 7-8 min.
- Vorbereiten eine Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel, im folgenden als Matrix bezeichnet) Platte.
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Representative Results
Maus SP-CPC Isolation:
In dieser Studie verwendeten wir Maus CPCs isoliert nach SP Phänotypus, während Ergebnisse von Ratte CPCs sind geändert und aus einem früheren Bericht mit Erlaubnis (Abbildung 8)33hinzugefügt.
Zellproliferation unter hohen und niedrigen Zelldichten und mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen:
Unsere früheren Studie zeigte, dass die mRNA Expression von kardialen Linie Markierungen innerhalb der ersten 24 Std. Kultivierung Schritt geändert. Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix Zelle Schicksal Entscheidungen, einschließlich der endothelialen Differenzierung35betrifft. Um geeignete Bedingungen für die Erleichterung der endothelialen Linie Engagement des CPCs zu erkunden, wir FN und LN (beide 10 µg/mL) auf eine 6-Well-Platte verwendet (Wachstumsbereich: 9,6 cm2/gut) in dieser Studie. Da Entscheidungen in den Zellzyklus und Zelle Schicksal eng miteinander verbunden sind, suchen wir die Bedingung, die eine niedrige Zelle Proliferationsrate in Ermangelung des Zelltods Exponate, als solche kann eine Bedingung den Übergang von Zellproliferation zur Differenzierung reflektieren. Wir daher folgenden Bedingungen angewendet und Zelle Verbreitung Tarife im Vergleich: für Zelldichte, Konfluenz hoch (80 % - 90 %) und Low (< 60 %) confluency, und für Serum-Konzentration, normalen Kulturbedingungen (in dieser Studie 3,5 % FBS) und niedrigen Serum Bedingungen (≤0.1 % FBS). Erstens haben wir den niedrigen Zelle Dichte Zustand getestet. Es gab keine signifikanten Unterschiede der Zellviabilität und Verbreitung in der niedrigen Zelldichte mit 3,5 % FBS zwischen LN und FN, während ein geringer Zelldichte mit 0,1 % FBS eine verminderte Zellvermehrung auf LN im Vergleich zu FN aber kein Anstieg der Zelltod ( zeigte Abbildung 4). Im Gegensatz dazu unter hohen Zelle Dichte Bedingungen, Serum-Konzentrationen von 3,5 % und 0,1 % zeigte keine Unterschiede in der Zellproliferation und Zelltod zwischen zwei Substraten (Abbildung 5).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine niedrige Zelldichte auf LN mit 0,1 % Serum Verbreitung sinkt ohne Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit des CPC.
Änderungen in Zellform Mittel-und endothelialen Differenzierung:
Obwohl weitere Studien zu verstehen, die Bedeutung und die zugrunde liegenden Mechanismen erfordern, werden Änderungen in der Zellform als Indikator der geeigneten Kulturbedingungen als spezifische Veränderungen frühzeitig in Kulturen, in denen endotheliale beobachtet werden können Differenzierung wird erfolgreich (Abbildung 6). Wie dargestellt in die weiße gestrichelte Kreise in Abbildung 6, innerhalb 7-14 d mittelfristig endothelialen Differenzierung enthaltenen erfolgreiche Kulturen Zellen, die größer und anders in der Morphologie auf die anderen Zellen. Interessanterweise, schlägt diese Zellen verschwand gegen Ende der Phase der Differenzierung und erschien auch in geringeren Stückzahlen und zu späteren Zeitpunkten in High-Density-Kulturen auf LN und Fn während wir diese Zellen nicht weiter charakterisieren, dieses Protokoll verfolgen die Zellform jeden 2-3-d bis etwa 14. Tag. Wenn keine solche Zellen angezeigt, sollte die Anzahl der Zellen ausgesät verringert werden.
Bewertung der endothelialen Fähigkeit mit einer Rohr-Bildung-Assay:
Die Rohr-Bildung-Assay ist eine nützliche Technik, um die Effizienz der endothelialen Differenzierung des CPCs bewerten durch Messung der Röhre Bildung Kapazität von differenzierten Zellen. Daher führten wir, die Rohr-Bildung-Assay mit Zellen differenziert nach den beschriebenen Bedingungen. Interessanterweise wurde erfolgreich Rohr Ausbildung konsequent durch Zellen überzogen mit geringer Dichte und differenziert auf LN, gezeigt, während Rohr Bildung vor allem in den Zellen überzogen auf LN bei einer hohen Dichte (Abb. 7A) nicht. In ähnlicher Weise Rohr Bildung war meist erfolglos in Zellen kultiviert auf FN unabhängig von Zelldichte, obwohl Zellen differenziert auf FN bei einer geringen Dichte manchmal rudimentäre Röhren, je nach dem Zustand der Zelle gebildet (z.B., isolieren und/oder Durchgang Nummer, Abbildung 7 b). Um die Endothelzellen Art der Zellen zu bestätigen, wurden Zellen überzogen auf Deckgläsern differenziert nach den beschriebenen Protokoll und gebeizt für vWF. Auch der vWF-Ausdruck war homogener und stärker ausgeprägt in CPCs differenziert auf LN im Vergleich zu FN (Abbildung 7D). Abbildung 8 zeigt, dass die Ergebnisse aus der Röhre Bildung Test wie bei früheren Studien mit Ratten CPCs unter das gleiche Protokoll wie hier33beschrieben. Diese Ergebnisse zeigen, dass Rohr Bildung effizienter in Zellen differenziert auf LN im Vergleich zu FN bei niedrigen Zelle Dichte Bedingungen und mit niedrigen Serum vernickelt (0,1 % FBS) für 20-24 h vor der Differenzierung in endothelialen Differenzierung Medium. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll könnte nützlich für die verschiedenen Zelltypen und unabhängig von der Spezies.
Abbildung 1: Darstellung der spezifischen Isolierung Schritte um Cardiomyocyte erschöpft Zellsuspension aus isolierten Mäuseherzen und repräsentative Flow Cytometry Auslesen des kardialen SP. (A) dieses Panel zeigt das Auswerfen des restlichen Blut aus den Herzkammern durch leichten Druck mit kleinen Pinzette wiederholt. (B) dieses Panel zeigt die Herzen mit kleinen Schere in kleine Stücke schneiden. (C) dieser Bereich zeigt die hacken die Herz-Stücke mit einer Rasierklinge. (D) dieses Panel zeigt die Inkubation von Hackfleisch / Herzen mit Kollagenase B in geneigten Platten bei 37 ° C. (E) dieses Panel zeigt die Homogenisierung der Hackfleisch / Herzen mit einer Pasteurpipette während der Inkubationsschritt. (F) zeigt dieses Fenster die Filterung des verdauten Gewebes durch einen 100 µm-Filter (gelb) und 40 µm-Filter zur Entfernung von unverdauten Gewebe Rückstände (blau) und Herzmuskelzellen. (G) zeigt dieses Fenster die sanfte Umkehrung einer 50 mL konische Röhre, enthält die Cardiomyocyte erschöpft Zellsuspension und einwickeln in Alufolie für Lichtschutz nach Zugabe von Hoechst. (H) dieses Panel zeigt repräsentative Fluss Cytometry Auslesen der Hoechst-gefärbten Zellen in an- und Abwesenheit von der ABC-Transporter Inhibitor Verapamil für die Identifizierung des SP. (ich) dieses Panel einen repräsentative Dot Plot von SP zeigt Zellen nach CD31 und Sca-1 Positivität für die Identifizierung von Sca-1+/CD31– Untergruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Übersicht über die Probenvorbereitung im Vorfeld der kardialen SP sortieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Protokoll für Endothelzellen Abstammung Induktion und Differenzierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Maus SP-CPC Verbreitung, wenn bei einer niedrigen Zelle Dichte unter unterschiedlichen Serumkonzentrationen auf LN und Fn vergoldet (A und B) Diese Tafeln zeigen die Zellzahlen am 2. Tag. (C und D) Diese Tafeln zeigen die Lebensfähigkeit am 2. Tag. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM); ausgewiesen. N = 5; verschiedene Passagen; p < 0,05 von Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Maus SP-CPC Verbreitung, wenn bei einer hohen Zelldichte unter unterschiedlichen Serumkonzentrationen auf LN und Fn vergoldet (A und B) Diese Tafeln zeigen die Zellzahlen am 2. Tag. (C und D) zeigen diese Platten die Lebensfähigkeit am 2. Tag. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgewiesen; N = 5; verschiedene Passagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Zelle Morphologie um 14 und 17 bei den Differenzierungsprozess d. Diese Abbildung zeigt Hellfeld (BF), Bilder von Maus SP-CPCs ausgesät auf LN oder FN-beschichteten Gerichte mit ein Low (niedrig) oder eine hohe (High) Zelldichte und mit Medium 2 für 20 h, gefolgt von Medium 3 für 14 oder 17 d. weiß gestrichelte Kreise markieren die Bereiche mit runden Zellen Witz h eine größeren Zellengröße. Die Bildgebung erfolgte mit Hellfeld Mikroskopie. Die Vergrößerung = 2 X; die Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Tube Bildung und vWF Färbung nach endothelialen Differenzierung der SP-CPCs auf LN und Fn (A und B) Diese Tafeln zeigen die Rohr-Bildung. (C und D) Diese Tafeln zeigen die vWF-Färbung. Zellen wurden ausgesät auf 10 µg/mL LN oder FN-beschichteten Gerichte mit einem niedrigen oder hohen Zelldichte und Medium 2 für 20 h, gefolgt von Medium 3 für 21 d, und dann mit Trypsin geerntet und ausgesät auf der Basalmembran-Matrix. Alle Bilder wurden nach 16 h. Die Bildgebung erfolgte mit Hellfeld Mikroskopie und die Vergrößerung = 2 X für Panels A und B. Die Darstellung erfolgt mit Fluoreszenz-Mikroskopie und die Vergrößerung = 10 X für Paneele C und D. Panels A und C zeigen LN-beschichtete Gerichte. Platten B und D zeigen FN-beschichtete Gerichte. Die Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Tube Bildung nach der endothelialen Differenzierung der Ratte CPCs. Ratte CPCs wurden ausgesät bei geringer Zelldichte auf 10 µg/mL LN oder FN-beschichteten Gerichte mit 0,1 % FBS-haltigen F12 Medium für 20 h, gefolgt von einem anderen 21 d im Medium 3, und dann mit Trypsin geerntet. Auf der Basalmembran Matrix auf einer 96-Well-Platte wurden in 100 μl Medium 3 4 x 104 Zellen ausgesät. Die Bildgebung erfolgte mit Hellfeld Mikroskopie. Die Vergrößerung = 2 X; die Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wird anhand einer früheren Studie33geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Arten | Isolierung, Erkennung marker | Referenz |
| Mensch, Ratte, Maus | c-Kit+/Lin-, c-Kit+/CD45-, c-Kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, Zelle 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, Zelle 2013; Smith, Nat Protoc 2014; Vicinanza, Absterben von Zellen unterscheiden sich 2017 |
| Mischling Hunde | Lin-, plus: c-Kit+, MDR1+ oder Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Maus | SCA-1+ | Ach ja, PNAS 2003 |
| Maus | Seite Bevölkerung, plus: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Maus | Kolonie bildende Einheit-Fibroblasten, plus: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Maus, Ratte, Mensch | ISL-1+ *, plus: CD31-, c-Kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, Natur 2005; BU, Natur 2009 |
| * Isl-1 findet sich in der embryonalen oder fetalen Myokard nicht im Erwachsenen Herzen. | ||
Tabelle 1: Isolationstechniken und Markierungen von kardialen Progenitorzellen.
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Discussion
Vorteile dieses Protokolls:
Dieses Protokoll bietet eine Technik der endothelialen Differenzierung des CPCs. Wir fanden, dass eine niedrige Serumkonzentration und geringer Zelldichte die Effizienz der endothelialen Differenzierung, wobei LN erwies sich als ein geeigneter Substrat als FN unter diesen Bedingungen verbessern könnte. Wir haben zwei verschiedene Arten von CPCs: Ratte CPCs, die in einer Zelle der Zeile-Manier und Maus SP-CPCs verwendet wurden, die isoliert und erweitert wurden. Vor allem das Protokoll war für beide Arten des CPCs. aktuelle Techniken ermöglichen Wissenschaftlern zu isolieren und primäre CPCs von genetisch veränderten Mäusen aus präklinischen Krankheitsmodelle, sowie von Menschen28,36zu erweitern. Unter Verwendung dieses Protokolls auf isolierte CPCs könnte hilfreich für die Untersuchung von nicht nur Krankheitsmechanismen, sondern auch für die Erforschung von neuartigen therapeutischen Ziele sein.
CPC-Gebote sind derzeit in der klinischen Erprobung für Zelle Therapie4,5, wobei Zellen nach in-vitro- Verstärkung von Patienten und transplantierten Rückseite isoliert sind. In dieser Hinsicht könnte das Protokoll hier vorgestellten Strategien, um das Potenzial der Differenzierung von solchen CPCs vor der Transplantation zu verbessern identifizieren. Allerdings leidet Zelltherapie noch begrenzte Wirksamkeit aufgrund niedriger Retention, überleben und Engraftment der transplantierten Zellen. Mechanistische in-vitro- Studien auf Basis dieses Protokolls oder Adaptionen davon haben das Potenzial, einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Differenzierung-Prozess-in Fahrt insbesondere Mechanismen im Zusammenhang mit Zelldichte , Substrat und Wachstumsfaktoren. Neuer Erkenntnisse aus solchen Studien abgerufen kann letztlich für Zelle Umprogrammierung genutzt und angewendet, um direkten Einfluss auf resident CPCs nach Verletzungen zu unterscheiden.
Einschränkungen dieses Protokolls:
Isolierte primäre CPCs sind heterogener Bevölkerungen, die unterschiedliche Phänotypen in Bezug auf die Zellengröße und Zelle Wachstumsrate abhängig von der Isolation zu zeigen, auch wenn die gleichen Markierungen und identische Isolation Technik verwenden. Daher müssen die folgenden drei Punkte definiert werden: (1) die Zelle Aussaat Zahlen je nach Zellengröße, (2) die ideale Serumkonzentration (< 0,5 %), und (3) die Inkubationszeit für den ersten Schritt (Induktion der Abstammung) mit einer sehr niedrigen Serumkonzentration. Hier zeigen wir die Unterschiede in der Effizienz der Differenzierung je nach Zelldichte. Aber obwohl wir niedrige Serum im Vergleich (0,1 % FBS) versus Kultur Serumkonzentrationen (3,5 % FBS), wir habe nicht geprüft, andere Konzentrationen innerhalb der < 0,5 % FBS-Bereich. Darüber hinaus variieren je nach verwendeten Isolierung-Marker und die Spezies, die Effizienz der Induktion von Lineage Engagement. Daher sollte das Protokoll für jeden Zelltyp optimiert werden.
Pharmakologische und genetische Hemmung/Induktion Techniken genutzt werden, für die Prüfung von Krankheitsmechanismen mit diesem Protokoll anstelle von gentechnisch veränderten oder tierische Krankheitsmodelle. In diesem Fall sollte das Protokoll neu gestaltet: vor der Behandlung mit niedrig-Serum-haltigen Medium, die Zellen mit bestimmten Reagenzien oder genetische Werkzeuge behandelt werden. Infolgedessen können die Zellen anfälliger als aufbereitetem Zellen sein. Mit niedrigen Serum im ersten Schritt ist der entscheidende Punkt in diesem Protokoll. Daher ist eine sorgfältige Validierung Serum Konzentration und Inkubation Zeit für den ersten Schritt zu ermöglichen für die Verlangsamung der Zellproliferation und gleichzeitig Rentabilität unter Serum Entbehrung kritisch, ob dieses Protokoll ein Erfolg oder nicht sein kann.
Zusammenfassung:
Zusammenfassend lässt sich sagen bieten isolierten CPCs von Tiermodellen ein wertvolles Werkzeug für kardiale Erkrankung und Regeneration Studien. Nach Erweiterung können menschliche CPCs auch direkt für die Zelltherapie verwendet werden. Hier bieten wir, ein Protokoll für die effiziente endotheliale Abstammung Induktion und Differenzierung des CPCs basierend auf sorgfältige Anpassungen der Zelle Dichte und Serum-Konzentrationen. Der Vorteil dieses Protokolls ist seine Anwendbarkeit auf verschiedene Arten von CPC und ihr Potenzial, eine Basis für das Studium der und/oder die Einrichtung von anderen Werkzeugen neuartige kardialen Regeneration beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Vera Lorenz für ihre hilfreiche Unterstützung während der Experimente und das Personal von der Flow Cytometry Einrichtung der Abteilung Biomedizin (DBM), Universität und Universitätsspital Basel. Diese Arbeit wurde durch den Aufenthalt auf Track-Programm an der Universität Basel (um Michika Mochizuki) unterstützt. Gabriela M. Kuster wird unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (Grant Nummer 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
