Summary
Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.
Abstract
Kardiyak progenitör hücre (TBM) kalp yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma için tedavi potansiyeli olabilir. Yetişkin memeli kalbinde, içsel TBM'leri son derece kıt, ama genişletilmiş TBM'leri hücre tedavisi için yararlı olabilir. Yeteneklerini denetimli bir biçimde tanımlanmış ve etkin iletişim kuralları kullanılarak çeşitli kardiyak soy ayırt etmek için onların kullanmak için bir önkoşuldur. Ayrıca, vitro genişleme, üzerine TBM'leri hastalardan izole veya preklinik hastalık modelleri hastalığı mekanizmaları incelenmesi için verimli araştırma araçları sunabilir.
Mevcut çalışmalar farklı işaretleri TBM'leri tanımlamak için kullanın. Ancak, tüm bunların hangi preklinik bazı çalışmalar translasyonel etkisini sınırlar insanlarda, ifade edilir. Ne olursa olsun yalıtım tekniği ve marker ifade tabidir farklılaşma protokolleri için standart genişleme ve TBM astar hücre terapisi amaç için izin verir. Burada biz tarif endotel farklılaşma TBM'leri. fare ve sıçan TBM'leri iki farklı altgrupları kullanarak TBM'leri astar düşük fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyon ve düşük hücre yoğunluğu koşullar altında kolaylaştırır, bir daha o laminin olduğunu göstereceğiz fibronektin aşağıdaki protokol altında bu amaçla daha uygun substrat: 2-3 gün içinde takviyeleri de dahil olmak üzere orta multipotency korumak için sonra kültür ve % 3,5 ile FBS, TBM laminin üzerinde numaralı seribaşı < % 60 izdiham ve kültürlü içinde Ek içermeyen orta FBS (% 0,1) düşük konsantrasyonlarda farklılaşma endotel farklılaşma orta önce 20-24 saat ile. TBM türdeş olmayan bir nüfus olduğundan, serum konsantrasyonları ve kuluçka süreleri ilgili TBM subpopulation özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Göz önüne alındığında bu, teknik diğer türleri TBM için de uygulanabilir ve potansiyel ve farklılaşma ve nasıl onlar hastalığı ile ilgili hastalık modellerden izole TBM'leri kullanırken etkilenen mekanizmaları araştırmak için yararlı bir yöntem sağlar.
Introduction
Son yıllarda yapılan çalışmalarda yetişkin memeli kalp1,2,3' te ikamet kardiyak progenitör hücre (TBM) varlığını desteklemek ve TBM'leri Kalp zedelenmesini4sonra, hücre tedavisi için yararlı bir kaynak olabilir 5. Buna ek olarak, genişletilmiş TBM'leri uyuşturucu tarama için verimli bir model sağlayabilir ve modellerinin nadir kardiyomiyopatiler hastalarda veya ilgili hastalık izole zaman hastalık mekanizmaları araştırma6,7.
Yetişkin yürekten izole TBM'leri sahip kök/progenitor hücre özellikleri1,2,3,8 multipotent, oldukları gibi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar, ve kendini yenilemesinin kapasitesine sahiptir. Ancak, birçok farklı (alt) nüfus dahil olmak üzere, farklı yüzey marker profillerini, örneğin, c-kit, ani kalp durması-1 ve diğerleri, sergilenmesi veya farklı yalıtım teknikleri (Tablo 1) tarafından alınan TBM'leri vardır. Bazı kültür ve farklılaşma protokollerine kurulan1,2,8,9,10,11,12oldunuz. 13,14,15,16,17,18. Bu protokoller çoğunlukla büyüme faktörü ve hangi kültürü çalışmalarının amacı göre ayarlanır ve bunun sonuçları ve sonuçları da farklılaşma verimliliği dahil olmak farklılıkları için açabilir serum içerik ile ilgili olarak değişir.
İmleç tabanlı yalıtım teknikleri:
TBM bir belirli yüzey marker ifade1,2,8,9,10,11,12,13 tarihinde bağlı izole olabilir ,14,15,16,17,18. Önceki çalışmalar, c-kit ve ani kalp durması-1 ikamet TBM'leri1,11,14,19,20yalıtmak için en iyi işaretleri olabilir öneririz. Bu işaretleri hiçbiri TBM için gerçekten özel olduğundan, kombinasyonları farklı işaretleri genellikle uygulanır. Örneğin, c-kit21seviyesinin düşük TBM'ler hızlı ise, c-kit Ayrıca mast hücreleri22, endotel hücreleri23ve hematopoetik kök/progenitor hücreler24de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerine göre ifade edilir. Ek bir sorun tüm işaretleri tüm türler arasında ifade edilir olmasıdır. Ani kalp durması-1, fare ama insan25içinde ifade için durum böyle. Bu nedenle, yalıtım işaretleri bağımsız iletişim kuralları kullanılarak klinik çalışmalarda ve insan numuneleri kullanılarak çalışmalar içinde görüş-in avantajlı olabilir.
Marker bağımsız yalıtım teknikleri:
TBM tecrit, öncelikle yüzey marker ifade bağımsız olan ama (Ayrıca bkz: Tablo 1) gerektiği gibi belirli işaret-pozitif subfractions ardışık seçime göre rafine birkaç önemli teknikler vardır. (1 yan nüfus (SP) tekniği aslında hematopoetik kök hücre ATP-bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılar27tarafından sızma DNA boya Höchst 3334226 yeteneği dayanan ilkel bir popülasyondaki karakterize. Kardiyak SP hücreler farklı gruplar tarafından izole ve işaretleri raporları2,8,13,14arasında bazı küçük farklılıklar ile çeşitli ifade etmek için bildirdi. (2) koloni oluşturan birim fibroblast hücreleri (CFU-Fs) başlangıçta belirlediğiniz dayalı mezenkimal stromal hücre (MSC) üzerinde-fenotip gibi. İzole MSCs koloni oluşumu ikna etmek için bulaşık sırası kültürlü. Bu koloni oluşturan-MSC benzeri CFU-Fs yetişkin yürekten ayrılmış olabilir ve kardiyak soy15ayırt etmek yeteneğine sahiptirler. (3) Cardiosphere kaynaklı hücreler (CDC) doku biyopsisi yetiştirilen hücre kümeleri elde tek hücrelerdir veya28,29,30,31explants. Son zamanlarda bu çoğunlukla CD105 gösterildi+/CD90-/c-kit- hücre kesir sergileyen cardiomyogenic ve rejeneratif potansiyel32.
Burada, SP-TBM'leri fareler izole kullanarak, biz bir protokol endotel lineage önceki çalışmada sıçan TBM'leri ve fare SP-TBM'leri33verimli indüksiyon için sağlar. Protokol kültürüne özgü uyarlamalar ve genişleme tekniği ile ilgili hücre yoğunluğu, orta sınıf ve substrat serum içeriğini içerir. Sadece fare SP-TBM'leri uygulanabilir ancak farklı TBM'leri amaç için bir endotel kaydedilmiş bir TBM yükseltecek üzerinden bir kader anahtarı ikna etmek için o içinde görüş-in bu hücreler veya kullanımları için mekanik vitro çalışmalar nakli olmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare kullanımı için hücre izolasyon amaçlı ve bakım ve kullanmak, Laboratuvar hayvanları ve İsviçre hayvan koruma kanunu ile Kılavuzu olduğunu ve Swiss Kanton yetkilileri tarafından kabul edildi.
Not: Ani kalp durması-1+/CD31 yalıtım- SP-TBM'leri fare kalp aslında yapıldı olarak yukarıda açıklanan34 bazı değişikliklerle. Malzemeler ve kullanılan reaktifler için Malzemeler tablobakın. Tüm deneyler için kardiyak SP-TBM'leri fareler izole güçlendirilmiş, pasajlı ve hücre satırı gibi vermez. Pasajlar 7-20 Bu çalışma için kullanılmıştır.
1. doku hazırlık
Not: tüm deneylerin fare kullanma yönergeleri ve yönetmeliklere göre yapılmalıdır. Bu protokol dört fareler kullanır. 100 mm çapında çoğu kültür plakaları P100 açıklanan ve 60 mm çapında çoğu kültür plakaları P60 iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için olarak açıklanmaktadır.
- Her fare 200 mg/kg Fentobarbital intraperitoneally enjekte (IP) ve tamamen onun yanıt pinching baştan aşağı kontrol ederek anestezi kadar bekleyin.
- % 70 etanol ile göğüs silin. Cilt ve torasik duvarın göğüs boşluğuna maruz makasla kesme.
- Kalp forseps ile kaldırın ve makas kullanarak tabanında kesti. Soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) (3-5 kalpler P100 başına) ya da bir iki kalpleri P60 başı P100 25 mL (5 mL için P60) ile kalbinde koymak.
- Kan boşluklar (Şekil 1A) dışarı çıkarmak için forseps ile kalp pompa.
- P100 25 mL (5 mL için P60) ile kalbinde yıkama soğuk PBS koymak. Küçük makas kullanarak kulakçık kaldırın. Kalp iki boyuna parçalar halinde kesilmiş ve yine buz gibi PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60) yıkayın.
- Parçaları yeni P100 25 mL (5 mL P60 için) soğuk PBS ile aktarın. Parçaları küçük makas (Şekil 1B) kullanarak daha küçük parçalar halinde kesin. 1 mg/mL collagenase B Hank'in dengeli tuz solüsyonu içinde (HBSS) seyreltilmiş bir damla ekleyin ve küçük parçalar steril jilet (Şekil 1 c) ile iyice kıyma.
2. sindirim
- 10 mL (P60 için 2.5 mL) 1 mg/mL collagenase B çözümü adım 1.6 yemek için ekleyin.
- Kıyılmış kalp parçalar halinde bir eğik (yaklaşık 30 °) içeren collagenase B çözüm koymak 37 ° C kuluçka (Şekil 1 d) P100 (veya P60).
- En fazla 30 dk kıyılmış kalp adet kuluçkaya; Art arda onları kuluçka (Şekil 1E) sırasında bir Pasteur pipet her 10 min geçen lunaparkçı.
Not: Bu, toplam adım 1.3 için kuluçka 30 dk aşmayacak şekilde önemlidir.
3. filtrasyon
- Soğuk HBSS %2 ile desteklenmiş, 10 mL (5 mL P60 için) eklemek FBS kıyılmış ve homojenize kalbi paramparça.
Not: HBSS % 2 FBS quenches collagenase B aktivite ile desteklenmiştir. - Sindirilmemiş doku ve 470 x g , santrifüj (RT) (Şekil 1F, sarı filtreleri) Oda sıcaklığında 5 min için kaldırmak için 100 µm filtresi ile kalp adet filtre.
- Süpernatant atın ve Pelet 5 mL (P60 için 3 mL) kırmızı kan hücre lizis arabellek resuspend ve zaman zaman buz üzerinde sallayarak ile 5 min için Pelet kuluçkaya.
- 10 mL (5 mL P60 için) PBS (lizis reaksiyonu önlemek için) eklemek ve kalan cardiomyocytes (Şekil 1F, mavi filtreler) dahil olmak üzere büyük hücreleri dışlamak için 40 µm filtreden örnek filtre.
- Santrifüj tüpü, 470 x g (olmadan fren) RT, 5 min için kapasitesi. Süpernatant atmak ve pelet 1 mL % 10 da dahil olmak üzere DMEM resuspend FBS.
- Bir aliquot bir hemasitometre ile hücreleri saymak. Hücrelerin % 10 da dahil olmak üzere DMEM ile resuspend FBS, 1 x 106 hücre/mL bir son hücre konsantrasyonu amaçlayan.
Not: Yaklaşık 5 x 106 cardiomyocyte ve eritrosit tükenmiş hücreleri fare tahmin edilebilir. - Hücreleri iki tüpler (Şekil 2) içine dağıtmak: Höchst 33342 verapamil ile; boyama için 1,5 mL tüp AEkle tüp B, Höchst 33342 boyama için 18,5 mL ekleyin ve leke ve akış sitometresi tarafından (adım 4.1 ve 4.2) kardiyak SP hücreleri sıralamak için devam edin.
4. kardiyak SP hücreleri tarafından akış sitometresi sıralanması
Not: Verapamil Höchst sızma tedavisine direnç (MDR) ABC ışınlama aktivitesi engelleyerek engeller. Höchst 33342 yaşayan hücrelerde DNA içeriği ile ilişkili olan gibi hücre döngüsü algılamak için kullanılan bir DNA'ya bağlanıcı boya var. Höchst-33342-ekstrüzyon hücreler her iki emisyon kanal Höchst düşük bölümünde görünür (450 nm, Höchst mavi; 650 nm, Höchst kırmızı), diğer bir deyişle, bir kenara Höchst-adı "yan nüfusları" vererek istinat "ana nüfus",. SP hücreler hücreleri yaratıcı özellikleri ile zenginleştirilmiş ve kökenlerinin dayanıklı ABC taşıyıcılar (MDR1 ve ABCG2 gibi) yüksek bir ifade gösterir. Höchst 33342 iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için Höchst olarak bulunmakta. Işığa duyarlı malzemeler için ideal sonuçları korumak önemlidir.
-
Verapamil ile Höchst ile boyama
- Verapamil (ile son bir konsantrasyon 83,3 µM) ve Höchst (5 µg/106 hücre son bir konsantrasyon ile) hücre ekleyin. Tüp Aiçin Verapamil ve Höchst tüp Biçin sadece Höchst kullanın. 90 dakika (37 ° C'de) bir su banyosunda kuluçkaya ve tüpler her 20 dk (Şekil 1G) dönmek.
- 470 x g RT. atma süpernatant, 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve her Pelet HBSS (1 x 106 hücre/mL) resuspend.
- 1.5 mL aliquot tek stainings ve tüp B (Şekil 2) negatif kontrol için al: (i) floresein isothiocyanate (FITC)-Birleşik anti-ani kalp durması-1; (II) allophycocyanin (APC)-Birleşik anti-CD31; (III) nonstained hücreleri (negatif kontrol).
Not: İzotip denetimleri burada yalıtım Protokolü ayarlamak için kullanılır. - A ve B kanalları ve 470 x g RT, 5 min için de tek boyama ve negatif kontrol aliquots Höchst ve verapamil yıkama için santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak ve granül tüp A ve (III) HBSS 250 µL negatif kontrol resuspend ve sıralama kadar buz karanlıkta tut.
- Tüp B Pelet HBSS 200 µL ve Pelet (ı, II), HBSS 100 µL tek boyama aliquots resuspend. FITC Birleşik anti-ani kalp durması-1 (0.6 µg/107 hücreleri) ve APC Birleşik anti-CD31 (0,25 µg/107 hücreleri) ekleyin. Buz üzerinde 30 dk için granül kuluçkaya ve onları zaman zaman karanlıkta sallamak.
- HBSS 2 mL tüpler için ekleyin. 470 x g RT., 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve 1 mL HBSS ve yukarıda olarak santrifüj ile tüm parçaları resuspend. Supernatants atın. Tek boyama aliquots Pelet HBSS 200 µL içinde resuspend. Tüp B Pelet HBSS (20 x 106 hücre/mL) resuspend.
- Buz üzerinde örnekleri tutmak ve sıralama kadar ışıktan korunan.
-
Akış sitometresi ile sıralama
- Steril 1,5 mL tüpler 500 µL % 2 de dahil olmak üzere HBSS ile sıralama hazırlamak FBS.
- Ölü hücreleri dışlamak için 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0.15 µg/106 hücreleri) 10 dakika buzda hücrelerle leke.
- Aşağıdaki ayarları kullanarak kalp SP sıralamak: 350 nm (UV) uyarma kullanarak Höchst heyecanlandırmak, toplamak 450/50 nm bant geçiren filtresi (Höchst mavi) ve 670/30 nm bant geçiren filtresi (Höchst kırmızı) ile floresan emisyon ve 100 µm meme boyutunu ve basınç kullanın 15 psi.
- 5 x 105 olaylar için sıralama örnekleri ve negatif kontrol, verapamil kontrol ve tek boyama için 1 x 105 olayları analiz için kayıt örnekleri.
Not: SP olduğunu yaklaşık % 0.5 - kalp %2 (Şekil 1 H) ama olabilir laboratuvarları ve yalıtır arasında değişmektedir. Ani kalp durması-1+/CD31- kesir % 1-11 toplam kalp SP (Şekil 1I) % civarındadır ancak laboratuvarları ve yalıtır arasında değişebilir. Ani kalp durması-1+/CD31- SP-TBM'leri SP-TBM'leri iletişim kuralı aşağıdaki bölümleri için olarak yazılır.
5. birincil izole SP-TBM'leri kültürünün
Not: Bu protokol için medya üç farklı türde kullanılmıştır. Onlar orta 1 (Noseda vd.göre) denir 8, Orta 2 ve orta 3 ve are açıklanan kendi kompozisyon ile ilgili Malzemeler tablo .
- 1-37 ° C kullanmadan önce Orta kadar sıcak ve sakin santrifüj ile 4 ° c 4 ° C ve 470 x g 6 min için sıralama tüpler santrifüj kapasitesi ve orta 1 hücrelerde resuspend.
- Hücreleri orta 1 4 mL ile gaz geçirgen bir P60 yemek koymak. Hücreleri % 70-%80 izdiham gelinceye orta her 3 d değiştirin.
Not: Adım 5.2 yaklaşık 2-3 hafta sürebilir.
6. genişleme ve SP-TBM'leri farklılaşma
-
Hücre kültürü
- 3 x 105 SP-TBM'leri orta 1'bir T75 şişesi 8 ml kültür.
- SP-TBM'leri %5 CO2 37 ° C'de % 70-%80 izdiham kadar her 2-3 d orta değişen kuluçkaya.
Not: Cep numarasını kullanılan TBM'leri türünü, katlama zaman ve hücre boyutunu göre değiştirilmesi gerekir.
-
SP-TBM büyüme ve canlılığı farklı serum konsantrasyonları altında
- Kültür T75 şişeler 8 mL orta 1 ile 2-3 d için SP-TBM'ler. Dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve sıcak (37 ° C) HBSS yavaşça 5 mL ile durulayın.
- Tripsin-EDTA 5 mL 5 min hücre kuluçka için hücrelerle tedavi, orta tripsin etkinliği durdurmak için 1 5 mL ekleyin ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarın.
- 470 x g RT., 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
- Orta 1 veya orta 2'yi (lineage indüksiyon orta) ve plaka 2.5 x 105 SP-TBM'leri P60 yemekleri ile farklı serum konsantrasyonları içeren orta 3 mL hücrelerde resuspend.
- Orta Orta 1 veya orta 2 kültür 2 d sonra adım 6.2.4 ölü hücreleri koleksiyonuna bir 15 mL tüp için çanak toplamak.
- Trypsinize olduğu gibi adım 6.2.2 yapışık hücreleri ve hücre süspansiyon adım 6.2.5 15 mL tüp içine toplamak. 840 x g RT., 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi
- Süpernatant Aspire edin ve hücre sayımı için 1 mL orta 1 veya orta 2 ekleyin. SP-TBM'leri ile trypan mavi (% 0,4) ve Kont trypan mavi pozitif (ölü) ve trypan mavi-negatif () hücrelerin leke.
Not: Hücre canlılığı (adım 6.2.7) Toplam cep numarası ile ilgili olarak trypan-mavi negatif hücre sayı olarak verilir.
-
İndüksiyon endotel farklılaşma
- (6-de) kültür plaka 10 µg/mL laminin (LN) veya fibronektin (FN) ile precoat.
- 10 µg/mL LN veya FN ile F12 Orta (veya PBS) içeren bir substrat çözeltisi olun. Her şey için 2 mL substrat çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 30 dk plaka korumak
- Plaka çözümden Aspire edin ve istimal o kadar her şey için PBS 2 mL ekleyin.
- Adım 6.1.2 hücrelerden ortamından Aspire edin, yavaşça 5 mL sıcak (37 ° C) HBSS yıka, onları tripsin-EDTA 5 mL 5 min hücre kuluçka için ile tedavi, orta tripsin etkinliği durdurmak için 1 5 mL ekleyin ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarın.
- 470 x g RT. aspiratı süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve Orta 2 hücre sayımı için ekleyin.
- Başına tohum 8 x 104 hücre Orta 2 3 mL ile kaplı plaka üzerinde iyi ve 20-24 h. değişiklik orta için 37 ° C'de orta 3 için 3 mL devam et.
Not: Düşük serum konsantrasyonu içeren orta kullanmanızı öneririz — ve takviyeleri olmadan — ilk 20-24 h için. Biz kullanma önerilen < % 60 cep izdiham (yani, adım 6.3.4 cep numarası vardır bağlı olarak hücre boyutu ve büyüme hızı ayarlanabilir). - 21 d için hücreleri kültür ve her 3 d orta değiştirin.
- Onları von Willebrand gibi endotel bir marker ile boyama farklılaşmış hücreler endotel doğası doğrulayın faktörü (vWF) ve performans gösteren floresans mikroskobu.
- PBS 1 mL hücrelerle yıkama ve % 3.7 formaldehit RT. 2 min için hücreleri tamir
- 30 dk için %0,1 Triton X GKD2O (veya PBS) içeren hücreleri permeabilize ve % 10 keçi serum RT. 1 h için ile blok
- Anti-von Willebrand faktör antikor (1: 100) 4 ° C'de 48 h hücrelerle kuluçkaya
- 3 hücreleri yıkama x ile PBS, 1 mL 10 dk her zaman için. Onları karanlıkta RT, 1 h için Alexa Fluor 546 keçi Anti-tavşan ikincil antikor ile (1:500) kuluçkaya.
- 10 dk her, yıkama tekrar 3 x 1 mL PBS ile. Karanlıkta RT, 5 min için 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) ile hücre çekirdeği leke.
- 3 hücreleri yıkama x, her, 5 min için PBS 1 mL ile. Hücreleri dağ ve onları 4 ° C'de depolayın
Not: Adım 6.1 ve 6,3 kodlamayla koşulları (substrat, orta, tamamlayıcı reaktifler ve FBS konsantrasyon) Şekil 3' te açıklanmıştır.
- (6-de) kültür plaka 10 µg/mL laminin (LN) veya fibronektin (FN) ile precoat.
-
Tüp oluşumu tahlil
- Bir membran matris (Örneğin, Matrigel, bundan böyle matris anılacaktır) hazırlamak plaka.
- 4 ° C'de matris gecede çözülme.
- Kat 100 µL buz Matrix ile bir 96-şey plaka.
Not: Herhangi bir kabarcıklar matris önlemek önemlidir. Tabakları matrisin jellification önlemek için buz kaplı olması gerek. - Plaka için 30 dk 37 ° C'de korumak.
- (Adım 6.3.5 tamamlandıktan sonra) hücreleri ortamından Aspire, yavaşça 5 mL sıcak (37 ° C) HBSS de hücrelerle durulama ve hücre kuluçka 5 min için tripsin-EDTA ile tedavi. Orta tripsin etkinliğini durdurur ve hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak için 3 ekleyin.
- 470 x g RT. aspiratı süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, 1 mL orta 3 ve damlalıklı yavaşça ekleyin.
- Hücreleri bir 35 µm hücre süzgeç ile filtre hücreleri toplanır.
- Hücreleri saymak ve 2 x 103 4 x 103 hücreleri orta 3 100 µL her matris kaplı de temel olarak belirler. Plaka 16 h hücre kuluçka 37 ° C'de tutun.
- Alan parlak mikroskop vasıl 2 X büyütme ile fotoğrafını çek.
Not: eksik bir trypsinization söz konusu olduğunda en fazla 7-8 dk tripsin-EDTA için pozlama süresi uzatmak.
- Bir membran matris (Örneğin, Matrigel, bundan böyle matris anılacaktır) hazırlamak plaka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare SP-TBM yalıtım:
Bu çalışmada, biz ise fare TBM'leri sonuçlarından değiştiren ve izni (Şekil 8)33ile önceki bir rapordan eklendi SP fenotip göre izole fare TBM kullanılır.
Hücre çoğalması yüksek ve en düşük hücre yoğunluğu altında ve farklı Serum konsantrasyonları ile:
Önceki çalışmamız kardiyak lineage işaretlerinin mRNA ifade adım kültür ilk 24 saat içinde değişti gösterdi. Bu hücre dışı matriks endotel farklılaşma35dahil olmak üzere hücre kader kararlar etkiler bilinmektedir. Endotel lineage taahhüdü TBM'leri kolaylaştırma için uygun koşullar keşfetmek için biz FN ve LN (her iki 10 µg/mL) 6-şey plaka üzerinde kullanılan (büyüme alanı: 9,6 cm2/de) Bu çalışmada. Hücre döngüsü ve hücre kader kararlar yakından bağlı olduğundan, biz düşük hücre proliferasyon hızı hücre ölümü yokluğunda sergileyen koşul arıyorlar, gibi bir koşul farklılaşma hücre çoğalması geçiş yansıtıyor olabilir. Biz, bu nedenle, aşağıdaki koşullar uygulanan ve hücre proliferasyonu oranları karşılaştırıldığında: hücre yoğunluğu, yüksek (% 80-%90) confluency ve düşük (< % 60) confluency ve serum konsantrasyonu, normal kültür koşulları için (Bu % 3,5 çalışma FBS) ve düşük serum koşullar (≤0.1% FBS). İlk olarak, düşük hücre yoğunluğu koşulu test ettik. Hücre canlılığı ve nükleer silahların yayılmasına karşı düşük hücre yoğunluğu % 3,5 ile hiçbir önemli farklılıklar vardı FBS LN ve FN, arasında ise düşük hücre yoğunluğu % 0.1 ile hücre ölümü ( hiçbir artış ama FN için karşılaştırıldığında LN bir azalma hücre çoğalması FBS gösterdi Şekil 4). Buna ek olarak, yüksek hücre yoğunluğu koşullar altında %3.5 ve % 0.1 serum konsantrasyonları hiçbir farkı yoktur hücre çoğalması ve hücre ölümü iki yüzeylerde (Şekil 5) arasında gösterdi.
Bu sonuçlar LN bir düşük hücre yoğunluğu % 0,1 serum ile TBM canlılığı etkilemeden nükleer silahların yayılmasına karşı azalır gösterir.
Hücre şekil endotel farklılaşma orta değişiklikler:
Her ne kadar daha fazla önemi ve temel mekanizmaları anlamak için çalışmalar gerektiren, belirli bir değişiklik olarak uygun kültür koşullardan bir göstergesi olarak erken kültürlerde, hangi endotel gözlenen hücre şekil değişikliklerin ortaya çıkacağını farklılaşma başarılı (Şekil 6) olacak. Beyaz kesikli çevrelerde Şekil 6, 7-14 d endotel farklılaşma Orta içinde gösterildiği gibi başarılı kültürleri daha büyük ve farklı morfoloji diğer hücrelere hücrelerin bulunan. İlginçtir, bu hücreler farklılaşma aşama sonuna doğru kayboldu ve ayrıca daha düşük sayıda ve daha sonra zaman noktalarda LN ve FN. biz değil daha fazla karakterize bu hücreler ise yüksek yoğunluklu kültürler içinde yer aldı, bu iletişim kuralını öneriyor hücre şekil her 2-3 d gün kadar 14 çevresinde izleme. Böyle bir hücre görünüyorsa, seribaşı hücre sayısı azalmıştır.
Endotel yeteneği bir tüp oluşumu tahlil ile değerlendirilmesi:
Tüp oluşumu tahlil tüp oluşumu kapasite farklılaştırılmış hücrelerin ölçerek TBM'leri endotel farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için kullanışlı bir yöntemdir. Biz, bu nedenle, açıklanan şartlara göre farklılaşmış hücreler tüp oluşumu tahlil yapılır. İlginçtir, hücrelerdeki LN üzerinde bir yüksek yoğunluklu (Şekil 7A) kaplama tüp oluşumu çoğunlukla başarısız oldu, ancak başarılı tüp oluşumu sürekli olarak düşük yoğunluklu kaplama ve LN üzerinde farklı hücreleri tarafından gösterildi. FN üzerinde düşük yoğunluklu bazen farklı hücreleri ilkel tüpler, hücre durumuna bağlı olarak kurulan, ancak benzer şekilde, tüp oluşumu çoğunlukla FN üzerinde hücre yoğunluğu ne olursa olsun, kültürlü hücrelerdeki başarısız oldu (Örneğin, ayrı tut ve/veya «««geçiş) sayı, rakam 7B. Hücreler endotel doğası onaylamak için coverslips üzerinde kaplama hücreleri açıklanan protokole göre farklılaşmış ve vWF için lekeli. Yine, vWF ifade daha homojen ve daha TBM telaffuz FN (Şekil 7CD) göre LN üzerinde farklı. Şekil 8 olarak burada sıçan TBM'leri altında aynı iletişim kuralını kullanarak önceki çalışmalar için seslendirilen tüp oluşumu tahlil sonuçlarından33açıklanan gösterir. Bu sonuçlar tüp oluşumu ile karşılaştırıldığında düşük hücre yoğunluğu koşullar altında ve düşük serum ile kaplama zaman FN LN Ayrıştırılan hücrelerdeki daha verimli olduğunu göstermek (% 0,1 FBS) 20-24 h farklılaşma endotel farklılaşma orta önce için. Bu sonuçlar bu protokolü ve bağımsız türlerin çeşitli hücre tiplerinin için yararlı olabilir öneririz.
Şekil 1: belirli yalıtım çizimi adım cardiomyocyte tükenmiş hücre süspansiyon izole fare kalpleri ve temsilcisi akış sitometresi dökümanları kardiyak SP., elde etmek için (A) Bu panel gösterir küçük forseps kullanarak uygulanan hafif basınç kalp boşlukları ile kalan kan çýkartýlmasýný tekrarladı. (B) Bu panel kalpleri kesme küçük parçalara küçük makas kullanarak gösterir. (C) Bu panel bir jilet kullanarak kalp parçalarını kıyma gösterir. (D) Bu panel collagenase B ile kıyılmış kalplerin kuluçka 37 ° C'de eğik plakaları gösterir (E) Bu panel homojenizasyon kıyılmış kalplerin Pasteur pipet kuluçka adımı sırasında kullanarak gösterir. (F) Bu panel sindirilir dokusunun 100 µm filtre (sarı) ve sindirilmemiş doku artıkları kaldırılması için 40 µm filtre (mavi) ve cardiomyocytes yoluyla filtreleme gösterir. (G) Bu panel cardiomyocyte tükenmiş hücre süspansiyon içeren ve lamba koruma sonra Höchst eklenmesi için kalay folyo sarma 50 mL konik tüp nazik iptali gösterir. (H) Bu panel temsilcisi akış sitometresi dökümanları Höchst lekeli hücrelerinin varlığı ve yokluğu ABC ışınlama inhibitörü verapamil SP. Bu panel SP bir temsilcisi nokta Arsa gösterir (ben) tanımlanması için gösterir hücreleri CD31 ve ani kalp durması-1 pozitifliği Sca-1+/CD31 tanımlanması için göre- subfraction. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kadar önde gelen SP kardiyak sıralama için numune hazırlama şematik bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: endotel lineage indüksiyon ve farklılaşma için protokolü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: düşük hücre yoğunluğu farklı serum konsantrasyonları LN ve FN. altında kaplama ne zaman fare SP-TBM nükleer silahların yayılmasına karşı (A ve B) Bu paneller 2 gün cep numaralarını göster. (C ve D) Bu paneller canlılığı 2 gün göster. Veri ortalama ± standart hata ortalamaya (SEM); gösterilir N = 5; farklı geçişleri; p < 0,05 öğrenci t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: ne zaman yüksek hücre yoğunluğu farklı serum konsantrasyonları LN ve FN. altında kaplama fare SP-TBM nükleer silahların yayılmasına karşı (A ve B) Bu paneller 2 gün cep numaralarını göster. Bu paneller (C ve D) 2 gün canlılığı göster. Veri ortalama ± SEM gösterilir; N = 5; farklı pasajlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: hücre morfolojisi 14 ve 17 ayırt etme işlemi sırasında d. Bu rakam parlak-alan (BF) LN veya FN kaplı yemekleri bir low (düşük) veya yüksek (yüksek) hücre yoğunluğu ile fare SP-TBM'leri görüntülerini tohumlari ve orta 3 tarafından 14 veya 17 d beyaz için takip Orta 2 20 h, WITH mark kesikli daireler yuvarlak şekilli hücreler zekâ içeren alanları gösterir h daha büyük bir hücre boyutu. Görüntüleme alanı parlak mikroskobu ile gerçekleştirildi. Büyütme oranını = 2 X; ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: tüp oluşumu ve SP-TBM'leri LN ve FN. endotel farklılaşma sonra boyama vWF (A ve B) Bu paneller tüp oluşumu göster. (C ve D) Bu paneller vWF boyama göster. Hücreleri LN veya FN kaplı yemekleri düşük veya yüksek hücre yoğunluğu ve Orta 2 için 20 h 10 µg/mL üzerinde tohumlari, 21 d için orta 3 tarafından takip ve sonra tripsin ile hasat ve membran matris tohumlari. Tüm resimleri 16 h sonra çekildi. Görüntüleme alanı parlak mikroskobu ve büyütme ile gerçekleştirilen paneller A ve Biçin 2 X =. Görüntüleme floresan mikroskopi ve büyütme ile gerçekleştirilir = 10 X panelleri C ve Diçin. Paneller A ve C LN kaplı yemekleri göster. Panelleri B ve D FN kaplı yemekleri göster. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: tüp oluşumu sıçan TBM'leri endotel farklılaşma sonra. Sıçan TBM'leri 10 µg/mL LN veya FN kaplı yemekleri ile % 0,1 F12 FBS içeren orta 20 h başka bir 21 d orta 3 arkasından ve tripsin ile hasat için bir düşük hücre yoğunluğu, seribaşı. 96-şey plaka üzerinde membran matris üzerinde 4 x 104 hücreleri içinde 100 μL orta 3 numaralı seribaşı. Görüntüleme alanı parlak mikroskobu ile gerçekleştirildi. Büyütme oranını = 2 X; ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam bir önceki çalışmada33' te göre değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Türler | Yalıtım, algılama işareti | Başvuru |
| İnsan, fare, fare | c-Seti+/Lin-, c-Seti+/CD45-, c-Seti+/CD45-/CD31- | Beltrami, hücre 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, hücre 2013; Smith, Nat Protoc 2014; Vicinanza, hücre ölümü 2017 farklı |
| Melez köpekler | Lin-, artı: c-Seti+, MDR1+ veya ani kalp durması-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Fare | Ani kalp durması-1+ | Oh, PNAS 2003 |
| Fare | Yan nüfus, artı: Abcg2+, ani kalp durması-1+/CD31-, ani kalp durması-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS Letonyalı 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat komünist 2015 |
| Fare | Koloni oluşturan birim-fibroblast, artı: CD45-, CD31-, ani kalp durması-1+, PDGFRa+ | Res 2012 Pelekanos, kök hücre |
| Fare, sıçan, insan | ISL-1+ *, artı: CD31-, c-kit-, ani kalp durması-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, doğa 2005; Bu, doğa 2009 |
| ISL-1 Yetişkin kalbinde değil embriyonik veya fetal Miyokardiyum bulunur. | ||
Tablo 1: Yalıtım teknikleri ve kardiyak progenitör hücre işaretleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı avantajları:
Bu iletişim kuralı bir TBM endotel farklılaşma tekniği sağlar. Bulduğumuz bir düşük serum konsantrasyonu ve düşük hücre yoğunluğu endotel farklılaşma, mademki LN FN bu koşullar altında daha bir daha uygun substrat kanıtladı verimliliğini artırabilirsiniz. Biz TBM'leri iki ayrı türü kullanılır: fare hangi izole ve genişletilmiş bir hücre satırı benzeri şekilde ve fare SP-TBM'leri kullanılan, TBM,. Özellikle, protokol her iki türü için uygulanabilir TBM'leri. mevcut teknikleri bilim adamı izole ve birincil TBM'leri genetik fareler ve preklinik hastalık modelleri gibi insanlar28,36genişletmek izin. İzole TBM'leri bu iletişim kuralını kullanan sadece hastalık mekanizmaları incelenmesi için aynı zamanda roman tedavi hedefleri keşfi için yardımcı olabilir.
TBM'ler Şu anda sayede hücreleri vitro amplifikasyon sonra hastalar ve transplante arka izole hücre terapisi4,5, klinik test vardır. Bu bağlamda, burada sunulan Protokolü nakli önce böyle TBM'leri farklılaşma potansiyeli geliştirmek için stratejilerini belirlemek yardımcı. Ancak, hücre tedavisi hala sınırlı etkinliği nedeniyle düşük tutma, hayatta kalma ve transplante hücre engraftment muzdarip. Bu iletişim kuralı veya bunların uyarlamalar temel mekanik vitro çalışmalar var daha iyi Farklılaşma süreci-sürüş moleküler mekanizmaları anlamak için katkıda bulunmak için potansiyel mekanizmaları belirli, hücre yoğunluğu ile ilgili , substrat ve büyüme faktörleri. Yeni bilgi bu tür çalışmalardan alındı sonuçta hücre yeniden programlama için kullanılan ve doğrudan yaralanma sonra ayırt etmek için ikamet TBM'leri etkisi uygulanır.
Bu iletişim kuralı sınırlamaları:
İzole birincil TBM'leri hücre boyutu ve hücre büyüme hızı yalıtım bağlı olarak farklı fenotipleri bile aynı işaretleri ve aynı yalıtım tekniği kullanırken göstermek türdeş olmayan nüfus are. Bu nedenle, aşağıdaki üç puan tanımlanması gerekir: (1 tohum hücre hücre büyüklüğüne göre (2) numaraları ideal serum konsantrasyonu (< % 0.5) ve (3) çok düşük serum konsantrasyonu ile ilk adım (İndüksiyon soyundan) için kuluçka süresi. İşte, farklılaşma verimliliği hücre yoğunluğu bağlı olarak farklılıklar göstermektedir. Ancak, her ne kadar biz düşük serum göre (% 0,1 FBS) karşı kültür serum konsantrasyonları (% 3,5 FBS), biz diğer konsantrasyonları içinde incelemek değil < % 0.5 FBS aralığı. Buna ek olarak, kullanılan yalıtım işaretleri ve türe bağlı olarak, soy taahhüt indüksiyon verimliliğini değişebilir. Bu nedenle, iletişim kuralı her hücre türü için optimize edilmelidir.
Farmakolojik ve genetik inhibisyon/indüksiyon teknikleri hastalık mekanizmaları bu protokol ile incelenmesi için kullanılabilir yerine genetiği değiştirilmiş veya hastalık hayvan modelleri. Bu durumda, protokol yeniden tasarlanmış: düşük serum içeren orta ile tedavi öncesi, hücreleri belirli reaktifler veya genetik araçları ile işlem görür. Sonuç olarak, hücrelerin daha nontreated hücre karşı daha da savunmasız olabilir. Düşük serum ilk adımı kullanarak bu protokolü anahtar noktasıdır. Bu nedenle, serum konsantrasyonu ve kuluçka zaman canlılık serum yoksunluğu altında korurken hücre çoğalması yavaşlama için izin vermek ilk adımı için dikkatli bir doğrulama olup bu iletişim kuralı bir başarı ya da değil olabilir için önemlidir.
Özeti:
Özetle, hayvan modellerinden izole TBM'leri kalp hastalığı ve yenilenme çalışmaları için değerli bir araç sağlar. Genişleme, insan TBM'ler de doğrudan hücre tedavisi için kullanılabilir. Biz, burada, verimli endotel lineage indüksiyon için bir protokol sağlar ve TBM farklılaşma hücre yoğunluğu ve serum konsantrasyonları dikkatli adaptasyonu dayalı. Bu iletişim kuralı onun uygulanabilirliği farklı TBM'leri ve çalışma ve/veya diğer roman kardiyak rejenerasyon araçları kurulması için bir temel olarak katkıda bulunma potansiyeli için avantajdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Vera Lorenz deneyler ve personel Biyomedikal bölümü (DBM), üniversite ve Üniversite Hastanesi Basel akış sitometresi tesisinden sırasında ona yardımcı destek için teşekkür ederiz. Bu eser Stay-on parça programından Basel Üniversitesi (için Michika Mochizuki) tarafından desteklenmiştir. Gabriela M. Kuster İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant sayı 310030_156953) hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
