Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.
Abstract
Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all'espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l'indagine sui meccanismi della malattia.
Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l'impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall'espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l'espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l'innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.
Introduction
Gli studi recenti sostengono l'esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.
CPC isolate da cuore adulto possiedono cellule staminali/progenitrici delle cellule caratteristiche1,2,3,8 come sono multipotenti, clonogeniche, e hanno la capacità di auto-rinnovamento. Tuttavia, ci sono molti differenti (sotto) popolazioni di CPC che presentino profili marcatore di superficie differenti, tra cui, ad esempio, c-kit, Sca-1 e altri, o estratto mediante tecniche di isolamento diverso (tabella 1). Diversi protocolli di differenziazione e cultura sono stati stabiliti1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Questi protocolli variano soprattutto per quanto riguarda il fattore di crescita e il contenuto di siero, che vengono regolati in base allo scopo della coltura e che possono causare differenze nei risultati e risultati, compresa l'efficienza differenziazione.
Tecniche di isolamento basati su marker:
CPC può essere isolato basato su un indicatore della superficie specifica espressione1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Gli studi precedenti suggeriscono che il c-kit e Sca-1 può essere i migliori marcatori per isolare residente CPCs1,11,14,19,20. Perché nessuno di questi indicatori è veramente specifica per CPCs, solitamente vengono applicate le combinazioni di marcatori diversi. Ad esempio, mentre CPCs esprimono bassi livelli di c-kit21, c-kit è espressa anche da altri tipi di cellule, tra cui mastociti22, cellule endoteliali23e di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche24. Un ulteriore problema è il fatto che non tutti gli indicatori sono espressi in tutte le specie. Questo è il caso per Sca-1, che si esprime nel topo ma non nell'umano25. Pertanto, utilizzando protocolli che sono indipendenti di marcatori di isolamento può essere vantaggioso in considerazione studi clinici e studi utilizzando campioni umani.
Tecniche di isolamento di marcatore indipendente:
Ci sono diverse tecniche principali di isolamento CPC, che sono principalmente indipendenti dell'espressione dei marker di superficie, ma che può essere affinata dalla selezione consecutiva di specifici marcatori positivi subfractions come necessario (vedere anche tabella 1). (1) la tecnica di popolazione (SP) lato originalmente è stata caratterizzata in una primitiva popolazione di cellule staminali ematopoietiche basato sulla capacità di deflusso il colorante DNA Hoechst 3334226 di ATP-binding cassette (ABC) trasportatori27. Cellule cardiache SP sono state isolate da diversi gruppi e segnalate per esprimere una varietà di indicatori con alcune lievi differenze tra rapporti2,8,13,14. (2) le cellule del fibroblasto unità formazione di colonie (CFU-Fs) originalmente sono state definite basato su una cellula stromal mesenchymal (MSC)-come il fenotipo. MSCs isolato sono coltivate su piatti per indurre la formazione della Colonia. Tale formazione di colonie MSC-come CFU-Fs possono essere isolate da cuore adulto e sono in grado di differenziarsi in lignaggi cardiaco15. (3) cellule cardiosfere (CDC) sono singole cellule derivate da aggregati di cellule coltivate da biopsie dei tessuti o espianti28,29,30,31. Recentemente è stato dimostrato che per lo più il CD105+/CD90 frazione di cellule /c-kit– –esibisce cardiomiogenici e potenziale rigenerativo32.
Qui, utilizzando SP-CPCs isolate da topi, forniamo un protocollo per l'induzione efficiente di stirpe endothelial basato su uno studio precedente in ratto CPCs e mouse SP-CPCs33. Il protocollo contiene specifici adattamenti alla cultura e tecnica di espansione per quanto riguarda la densità delle cellule, il contenuto di siero del mezzo e il substrato. Esso può essere applicato non solo al mouse SP-CPC ma di diversi tipi di CPC per lo scopo di indurre un interruttore di destino da un'amplificazione di un CPC endoteliale commesso, sia esso in considerazione il trapianto di queste cellule o dal loro impiego per gli studi meccanicistici in vitro .
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Protocol
L'uso di topi per scopo di isolamento cellulare era in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con la legge di protezione animale Svizzera ed è stato approvato dalle autorità cantonali svizzere.
Nota: L'isolamento di Sca-1+/CD31– SP-CPCs dal cuore del mouse essenzialmente è stato fatto come descritto in precedenza34 con alcune modifiche. Per i materiali e i reagenti utilizzati, Vedi Tabella materiali. Per tutti gli esperimenti, SP-CPCs cardiaci isolati da topi erano amplificati, attraversate e utilizzate in modo linea-come delle cellule. Per questo studio sono stati utilizzati passaggi 7-20.
1. tessuto preparazione
Nota: Tutti gli esperimenti utilizzando topi devono essere eseguiti secondo le linee guida e regolamenti. Questo protocollo utilizza quattro topi. Piastre di coltura che sono 100 mm di diametro sono descritti come P100 e piastre di coltura che sono di 60 mm di diametro sono descritti come P60 per le seguenti parti del protocollo.
- Iniettare ogni mouse con 200 mg/kg di pentobarbital intraperitonealmente (i.p.) e attendere fino a quando esso è completamente anestetizzato controllando la sua risposta per pizzicare le dita.
- Pulire il petto con etanolo al 70%. Tagliare la pelle e la parete toracica con le forbici per esporre la cavità toracica.
- Sollevare il cuore con il forcipe e tagliarlo alla base con le forbici. Mettere il cuore in un P100 con 25 mL (5 mL per P60) di freddo tampone fosfato salino (PBS) (tre-cinque cuori per P100) o uno o due cuori al P60.
- Pompare il cuore con il forcipe per espellere il sangue fuori le cavità (Figura 1A).
- Mettere il cuore in un P100 con 25 mL (5 mL per P60) di PBS freddo per il lavaggio. Rimuovere gli atrii utilizzando piccole forbici. Tagliare il cuore in due pezzi longitudinali e lavarli nuovamente in PBS ghiacciata (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Trasferire i pezzi a un nuovo P100 con 25 mL (5 mL per P60) di PBS freddo. Tagliare i pezzi in pezzi più piccoli utilizzando piccole forbici (Figura 1B). Aggiungere una goccia di collagenasi di 1mg/mL B diluito in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e tritare i piccoli pezzi accuratamente con una lama di rasoio sterile (Figura 1).
2. la digestione
- Aggiungere 10 mL (2,5 mL per P60) di soluzione 1 mg/mL collagenosi B al piatto dal punto 1.6.
- Mettere la soluzione di collagenasi B contenente i pezzi di cuore macinate in un inclinato (circa 30°) P100 (o P60) in un incubatore a 37 ° C (Figura 1).
- Incubare i pezzi di cuore macinate per un massimo di 30 min; omogeneizzare ripetutamente passandoli attraverso una pipetta di Pasteur ogni 10 minuti durante l'incubazione (Figura 1E).
Nota: È importante non superare i 30 minuti di incubazione in totale al punto 1.3.
3. filtrazione
- Aggiungere 10 mL (5 mL per P60) di freddo HBSS completata con 2% FBS per i pezzi di cuore macinate e omogeneizzato.
Nota: HBSS completati con 2% FBS Placa collagenosi attività B. - Filtrare i pezzi di cuore attraverso 100 μm, per rimuovere tessuto non digerito e centrifugare a 470 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA) (Figura 1F, filtri gialli).
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL (3 mL per P60) di tampone di lisi delle cellule di anima rosse e incubare il pellet per 5 minuti con agitazione occasionale sul ghiaccio.
- Aggiungere 10 mL (5 mL per P60) di PBS (per fermare la reazione di lisi) e filtrare il campione attraverso un filtro di 40 µm per escludere le celle più grandi, tra cui residuali cardiomiociti (Figura 1F, filtri blu).
- Centrifugare la provetta a 470 x g per 5 min a RT (senza freno). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di DMEM compreso 10% FBS.
- Contare le celle in una parte aliquota con un emocitometro. Risospendere le cellule con DMEM compreso 10% FBS, mirando ad una concentrazione di cella finale di 1 x 106 cellule/mL.
Nota: Circa 5 x 106 cellule del cardiomyocyte - e dell'eritrocito-esaurito possono essere stimate per topo. - Distribuire le cellule in due tubi (Figura 2): nel tubo A, aggiungere 1,5 mL per la Hoechst 33342 macchiatura con verapamil; in tubo B, aggiungere mL 18,5 per la macchiatura di Hoechst 33342 e procedere alla macchia e ordinare le cellule cardiache di SP (punti 4.1 e 4.2) tramite flusso cytometry.
4. l'ordinamento delle cellule cardiache SP tramite flusso Cytometry
Nota: Verapamil inibisce l'efflusso di Hoechst bloccando la resistenza del multidrug attività di trasportatore di ABC (MDR). Hoechst 33342 è una tintura di legame al DNA che può essere utilizzata in cellule viventi per rilevare il ciclo cellulare, come correla con il contenuto di DNA. Estrusione di Hoechst 33342 cellule appaiono nella parte bassa di Hoechst dei due canali di emissione (450 nm, Hoechst blu; 650 nm, Hoechst rosso), vale a dire mettere da parte la Hoechst-conservando "principale della popolazione", dando loro il loro nome "lato della popolazione". SP cellule sono arricchite in cellule con proprietà progenitore e mostrano un'alta espressione dei trasportatori di ABC multidrug-resistente (come MDR1 e ABCG2). Hoechst 33342 viene scritto come Hoechst per le seguenti parti del protocollo. È importante proteggere i materiali sensibili alla luce per risultati ottimali.
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Colorazione con Hoechst in presenza ed assenza di verapamil
- Aggiungere alla soluzione di cella verapamil (con una concentrazione finale di 83,3 µM) e Hoechst (con una concentrazione finale di 5 µ g/106 cellule). Per tubo A, utilizzare Verapamil e Hoechst; solo per tubo B, uso la Hoechst. Incubare a bagnomaria (a 37 ° C) per 90 min e ripristinare i tubi ogni 20 min (Figura 1).
- Centrifugare le provette a 470 x g per 5 min a RT. scartare il supernatante e risospendere ogni in HBSS (1 x 106 cellule/mL).
- Prendere un 1,5 mL aliquota per singolo stainings e controllo negativo dal tubo B (Figura 2): (i) isotiocianato di fluorescina (FITC)-coniugato anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-coniugato anti-CD31; (iii) nonstained cellule (controllo negativo).
Nota: Controlli di isotipo vengono utilizzati qui per impostare il protocollo di isolamento. - Centrifugare i tubi A e B e le aliquote di controllo singolo-macchiatura e negativo a 470 x g per 5 min a RT per il lavaggio, la Hoechst e verapamil.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di tubo A e (iii) il controllo negativo in 250 µ l di HBSS e tenerli sul ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento.
- Risospendere il pellet del tubo B in 200 µ l di HBSS e il pellet (i, ii) le aliquote di singolo-macchiatura in 100 µ l di HBSS. Aggiungere FITC Coniugato anti-Sca-1 (0,6 µ g/107 cellule) e APC-coniugato anti-CD31 (0,25 µ g/107 cellule). Incubare i pellet per 30 min in ghiaccio e agitare loro di volta in volta nel buio.
- Aggiungere 2 mL di HBSS ai tubi. Centrifugare le provette a 470 x g per 5 minuti a TA.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet tutti con 1 mL di HBSS e centrifuga come sopra. Eliminare i sovranatante. Risospendere il pellet delle aliquote singolo-macchiatura in 200 µ l di HBSS. Risospendere il pellet del tubo B in HBSS (20 x 106 cellule/mL).
- Mantenere i campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce fino a quando l'ordinamento.
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Ordinamento con citometria a flusso
- Preparare sterili da 1,5 mL ordinamento tubi con 500 µ l di HBSS cui 2% FBS.
- Macchia le celle con 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µ g/106 cellule) in ghiaccio per 10 min per escludere le cellule morte.
- Ordinare la SP cardiaca utilizzando le seguenti impostazioni: eccitare Hoechst con 350 nm (UV) eccitazione, raccogliere l'emissione di fluorescenza con un filtro passa-banda di 450/50 nm (Hoechst blu) e un filtro passa-banda di 670/30 nm (Hoechst rosso) e utilizzare un ugello di 100 µm e pressione di 15 psi.
- Per l'analisi, registrare 5x105 eventi per gli esempi di ordinamento e 1 x 105 eventi per il controllo negativo, controllo di verapamil e singolo-macchiatura campioni.
Nota: Il cardiaco SP è circa 0,5% - 2% (Figura 1 H), ma può variare tra i laboratori e gli isolati. La Sca-1+/CD31– frazione è di circa 1% - 11% del totale SP cardiaca (Figura 1I) ma possono variare tra i laboratori e gli isolati. SCA-1+/CD31– SP-CPC vengono scritti come SP-CPC per le seguenti parti del protocollo.
5. primaria cultura di isolato SP-CPC
Nota: Tre diversi tipi di media sono stati utilizzati in questo protocollo. Si riferiscono a come Medium 1 (secondo Noseda et al.) 8, 2 medio e medio 3 e sono descritte nella Tabella materiali per quanto riguarda la loro composizione.
- Warm up medio 1 a 37 ° C prima dell'uso e raffreddare la centrifuga a 4 ° C. Centrifugare le provette ordinamento a 4 ° C e 470 x g per 6 min e risospendere le cellule in media 1.
- Mettere le cellule su un piatto di P60 gas-permeabili con 4 mL di Medium 1. Modificare il mezzo ogni 3 d fino a quando le cellule hanno raggiunto la confluenza di 70-80%.
Nota: Passaggio 5.2 potrebbe richiedere circa 2-3 settimane.
6. espansione e differenziazione di SP-CPC
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Coltura cellulare
- 3 x 105 SP-CPC in 8 mL di Medium 1 in una boccetta di T75 della coltura.
- Incubare SP-CPCs a 37 ° C con 5% CO2 fino al 70% - 80% confluenza, cambiando il mezzo ogni 2-3 d.
Nota: Il numero di cellulare deve essere modificato secondo il tipo di CPC utilizzato, il tempo di raddoppiamento e le dimensioni della cella.
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SP-CPC crescita e redditività sotto le concentrazioni nel siero differenti
- Cultura SP-CPC per 2-3 d in T75 boccette con 8 mL di Medium 1. Attentamente aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS.
- Trattare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice cella, aggiungere 5 mL di Medium 1 per interrompere l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 minuti a TA.
- Risospendere le cellule in Medium 1 o 2 Medium (lignaggio induzione Media) e piastra 2.5 x 105 SP-CPC il P60 piatti con 3 mL di terreno contenenti concentrazioni differenti.
- Raccogliere il mezzo dal piatto di passaggio 6.2.4 per la raccolta di cellule morte in una provetta da 15 mL dopo 2 d di coltura in media 1 o 2 Medium.
- Tripsinizzano cellule aderenti come descritto al punto 6.2.2 e raccogliere la sospensione cellulare nel tubo da 15 mL del punto 6.2.5. Centrifugare le cellule a 840 x g per 5 minuti a TA.
- Aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di Medium 1 o 2 Medium per il conteggio delle cellule. Macchia SP-CPC con trypan blu (0,4%) e conteggio trypan blu-positivo (morti) e trypan blu-negativo cellule (vitali).
Nota: L'attuabilità delle cellule (passo 6.2.7) è dato come il numero di trypan blu-negativo delle cellule in relazione al numero totale delle cellule.
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Induzione di differenziazione endoteliale
- Precoat una piastra di coltura (6-bene) con 10 µ g/mL di laminina (LN) o fibronectina (FN).
- Fare una soluzione di substrato contenente 10 µ g/mL di LN o FN con F12 medio (o PBS). Aggiungere 2 mL di soluzione di substrato in ciascun pozzetto. Mantenere la piastra per 30 min a 37 ° C.
- Aspirare la soluzione dalla piastra e aggiungere 2 mL di PBS in ciascun pozzetto fino a usarlo.
- Aspirare il mezzo dalle cellule dal punto 6.1.2, sciacquare delicatamente con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS, li trattano con 5 mL di tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice cella, aggiungere 5 mL di Medium 1 per interrompere l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min a RT. aspirare il supernatante e aggiungere 2 Medium per il conteggio delle cellule.
- Cellule di4 seme 8 x 10 per bene sulla piastra rivestita con 3 mL di Medium 2 e tenerlo a 37 ° C per 20-24 h. cambiamento medio a 3 mL di Medium 3.
Nota: Si consiglia di utilizzare mezzo contenente una concentrazione bassa nel siero — e senza supplementi — per i primi 20-24 h. Si consiglia di utilizzare < confluenza di 60% delle cellule (cioè, il numero di cellulare del passo 6.3.4 deve essere regolata a seconda del tasso di dimensione e la crescita delle cellule). - Coltura delle cellule per 21D e sostituire il terreno ogni 3 d.
- Verificare la natura endothelial delle cellule differenziate dalla macchiatura li con un indicatore endothelial come von Willebrand Factor (vWF) e performanti microscopia di fluorescenza.
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS e fissare le cellule in formaldeide del 3,7% per 2 minuti a TA.
- Permeabilize le cellule con 0.1% Triton X in ddH2O (o PBS) per 30 min e bloccarlo con 10% siero di capra per 1 h a TA.
- Incubare le cellule con anticorpo di anti-von Willebrand fattore (1: 100) per 48 h a 4 ° C
- Lavare le cellule 3 x con 1 mL di PBS, per 10 minuti ogni volta. Incubare a loro con anticorpo secondario anti-coniglio di capra a Alexa Fluor 546 (1: 500) per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Lavare nuovamente 3x, per 10 minuti ciascuno, con 1 mL di PBS. Macchia i nuclei cellulari con 4'6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI; 1: 500) per 5 min a RT nel buio.
- Lavare le cellule 3 x, per 5 minuti ciascuno, con 1 mL di PBS. Montare le cellule e conservarli a 4 ° C
Nota: Le condizioni di coltura (substrato, media, reagenti supplementari e concentrazione di FBS) di passaggi 6.1 e 6.3 sono descritti nella Figura 3.
- Precoat una piastra di coltura (6-bene) con 10 µ g/mL di laminina (LN) o fibronectina (FN).
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Analisi di formazione del tubo
- Preparare una matrice della membrana basale (ad es., Matrigel, qui di seguito definita matrice) piastra.
- Scongelare la matrice a 4 ° C durante la notte.
- Cappotto in una piastra a 96 pozzetti con 100 µ l della matrice sul ghiaccio.
Nota: È importante evitare eventuali bolle nella matrice. Le piastre devono essere rivestiti sul ghiaccio per evitare la gelazione della matrice. - Mantenere la piastra a 37 ° C per 30 min.
- Aspirare il mezzo dalle cellule (dopo il completamento del passaggio 6.3.5), delicatamente lavare le cellule con 5 mL di caldo (37 ° C) HBSS e trattarli con tripsina-EDTA per 5 min in incubatrice delle cellule. Aggiungere 3 Medium per arrestare l'attività della tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min a RT. aspirare il supernatante, aggiungere 1 mL di Medium 3 e dispensare lentamente.
- Le celle filtranti con un colino di cella 35 µm, se le cellule vengono aggregate.
- Contare le celle e seme 2 x 103 a 4 x 103 celle in 100 µ l di taglia media 3 in ciascuna matrice rivestite bene. Tenere la piastra a 37 ° C nell'incubatore delle cellule per 16 h.
- Scattare una foto con un microscopio a campo chiaro a 2 ingrandimenti.
Nota: Nel caso di un'incompleta trypsinization, prolungare il tempo di esposizione di tripsina-EDTA ad un massimo di 7-8 min.
- Preparare una matrice della membrana basale (ad es., Matrigel, qui di seguito definita matrice) piastra.
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Representative Results
Isolamento di SP-CPC del mouse:
In questo studio, abbiamo usato del mouse CPCs isolato secondo il fenotipo di SP, considerando che risultati da ratto CPC sono modificati e aggiunto da una precedente relazione con autorizzazione (Figura 8)33.
Proliferazione delle cellule in cella ad alta e bassa densità e con le concentrazioni nel siero differenti:
Il nostro studio precedente ha mostrato che l'espressione del mRNA di marcatori cardiaci lignaggio cambiato entro le prime 24 ore di coltura passo. È noto che la matrice extracellulare influenza le decisioni di destino delle cellule, compreso differenziazione endoteliale35. Per esplorare le condizioni adatte per la facilitazione dell'impegno di derivazione endoteliale del CPCs, abbiamo usato FN e LN (entrambi 10 µ g/mL) su una piastra a 6 pozzetti (area di crescita: 9,6 cm2/bene) in questo studio. Perché le decisioni di destino delle cellule e del ciclo cellulare sono strettamente legate, stiamo cercando la condizione che presenta un tasso di proliferazione delle cellule basso in assenza di morte delle cellule, come tale condizione può riflettere la transizione da proliferazione delle cellule a differenziazione. Abbiamo, quindi, applicate le seguenti condizioni e tassi di proliferazione delle cellule di rispetto: per la densità delle cellule, confluency di alta (80% - 90%) e bassa (< 60%) confluenza e per la concentrazione di siero, condizioni di coltura normale (in questo studio 3,5% FBS) e basso del siero condizioni (≤ 0,1% FBS). In primo luogo, abbiamo testato la condizione di densità bassa delle cellule. Non c'erano differenze significative di attuabilità delle cellule e la proliferazione della densità bassa delle cellule con 3,5% FBS tra LN e FN, mentre una densità bassa delle cellule con 0,1% FBS ha mostrato una proliferazione delle cellule in diminuzione rispetto al FN, ma nessun aumento nella morte delle cellule ( LN Figura 4). Al contrario, sotto condizioni di cella ad alta densità, le concentrazioni nel siero di 3,5% e 0,1% non hanno evidenziato differenze nella proliferazione delle cellule e nella morte cellulare tra i due substrati (Figura 5).
Questi risultati indicano che una densità bassa delle cellule su LN con 0,1% di siero diminuisce la proliferazione senza colpire l'attuabilità CPC.
Cambiamenti nella forma delle cellule nel mezzo di differenziazione endoteliale:
Sebbene che richiedono ulteriori studi per capire il significato e i meccanismi di fondo, cambiamenti nella forma delle cellule appaiono un indicatore delle condizioni di coltura adatto come modifiche specifiche può essere osservato all'inizio nelle colture, in cui endoteliale differenziamento sara ' successo (Figura 6). Come mostrato nei cerchi bianchi tratteggiati in Figura 6, entro 7-14 d nel mezzo di differenziazione endoteliale, successo culture ha contenuto le cellule che erano più grandi e diversi nella morfologia alle altre celle. Interessante, queste cellule sono sparito verso la fine della fase di differenziazione e inoltre è comparso in numeri inferiori e intervalli di tempo successivi nelle colture ad alta densità su LN e FN. considerando che non abbiamo più ulteriormente caratterizzare queste cellule, questo protocollo suggerisce la forma delle cellule di rilevamento ogni 2-3 d fino a quando intorno al giorno 14. Se tali celle non vengono visualizzate, il numero delle cellule seminate deve essere diminuito.
Valutazione della capacità endoteliale con un saggio di formazione del tubo:
L'analisi di formazione del tubo è una tecnica utile per valutare l'efficienza della differenziazione endoteliale del CPCs misurando la capacità di formazione del tubo di cellule differenziate. Abbiamo, pertanto, eseguita l'analisi di formazione del tubo con cellule differenziate secondo le condizioni descritte. È interessante notare che, formazione del tubo successo costantemente è stata indicata dalle cellule placcato a bassa densità e differenziato su LN, mentre la formazione del tubo non riuscita per lo più nelle cellule piastrate su LN ad un'alta densità (figura 7A). Allo stesso modo, la formazione del tubo era principalmente infruttuosa in cellule coltivate su FN indipendentemente dalla densità cellulare, anche se cellule differenziate su FN a una bassa densità a volte formano tubi rudimentale, a seconda delle condizioni delle cellule (per esempio, isolare e/o passaggio numero, figura 7B). Per confermare la natura endothelial delle cellule, cellule piastrate su vetrini coprioggetti erano differenziate secondo il protocollo descritto e macchiate per la sindrome di Raynaud. Ancora una volta, l'espressione di sindrome di Raynaud era più omogeneo e più pronunciati nel CPCs differenziato su LN rispetto al FN (Figura 7D). Figura 8 Mostra i risultati del dosaggio di formazione del tubo come avviene per gli studi precedenti utilizzando ratto CPCs sotto lo stesso protocollo come qui descritto33. Questi risultati indicano che la formazione del tubo è più efficiente in cellule differenziate su LN rispetto al FN quando placcato in condizioni di densità bassa delle cellule e con il siero basso (0,1% FBS) per 20-24 h prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo potrebbe essere utile per vari tipi di cellule e indipendente delle specie.
Figura 1: illustrazione di isolamento specifico passaggi per ottenere una sospensione di cellule di cardiomyocyte-vuotati dai cuori isolato mouse e rappresentanza flusso cytometry letture del cardiaco SP. (A), questo pannello spettacoli all'espulsione dei residui di sangue nella cavità del cuore attraverso ripetuti leggera pressione applicata utilizzando piccole pinze. (B), questo pannello mostra il taglio dei cuori in piccoli pezzi utilizzando piccole forbici. (C), questo pannello mostra la macinazione dei pezzi di cuore con una lama di rasoio. (D), questo pannello mostra l'incubazione dei cuori macinati con collagenasi B in piastre inclinate a 37 ° C. (E), questo pannello mostra l'omogeneizzazione dei cuori macinati utilizzando una pipetta Pasteur durante la fase di incubazione. (F) questo pannello mostra il filtraggio del tessuto digerito attraverso un filtro di 100 µm (giallo) e un 40 µm filtro (blu) per la rimozione dei residui di tessuto non digerito e cardiomiociti. (G) questo pannello mostra l'inversione delicata di una provetta conica da 50 mL contenente la sospensione delle cellule del cardiomyocyte-vuotati e avvolgere in carta stagnola per protezione dalla luce dopo l'aggiunta di Hoechst. (H), questo pannello mostra rappresentanza flusso cytometry letture di Hoechst-macchiato le cellule in presenza ed assenza di ABC transporter inibitore verapamil per l'identificazione del SP. (io) questo pannello mostra una trama punto rappresentativo di SP le cellule secondo CD31 e Sca-1 la positività per l'identificazione della Sca-1+/CD31– subfraction. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica schematica della preparazione del campione che conduce fino alla raccolta differenziata cardiaco SP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: protocollo per l'induzione di derivazione endoteliale e differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: proliferazione Mouse SP-CPC quando placcato con una densità bassa delle cellule sotto le concentrazioni nel siero differenti su LN e FN. (A e B) Questi pannelli mostrano i numeri di cellulari al giorno 2. (C e D) Questi pannelli mostrano la vitalità al giorno 2. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (SEM); N = 5; diversi passaggi; p < 0.05 mediante di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: proliferazione Mouse SP-CPC quando placcato a densità alta cella sotto le concentrazioni nel siero differenti su LN e FN. (A e B) Questi pannelli mostrano i numeri di cellulari al giorno 2. (C e D) questi pannelli mostrano la vitalità al giorno 2. I dati sono mostrati come media ± SEM; N = 5; diversi passaggi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: morfologia a 14 e 17 d durante il processo di differenziazione di Cell. Questa figura Mostra campo chiaro (BF) immagini del mouse SP-CPCs seminate su piatti LN - o FN-rivestito con un low (bassa) o una densità elevata delle cellule (alta) e con Medium 2 per 20 h, seguita dal medio 3 per 14 o 17 d. bianco cerchi tratteggiate contrassegno le zone contenenti wit di celle di forma circolare h una dimensione di cella più grande. L'imaging è stata eseguita con microscopia in campo chiaro. L'ingrandimento = 2 X; la barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Tube formazione e vWF colorazione dopo differenziazione endoteliale di SP-CPC il LN e FN. (A e B) Questi pannelli mostrano la formazione del tubo. (C e D) Questi pannelli mostrano la macchiatura del vWF. Cellule sono state seminate su 10 µ g/mL di piatti LN - o FN-rivestito con una densità di cella bassa o alta e medio 2 per 20 h, seguite da medio 3 per 21D e poi raccolte con tripsina e seminate sulla matrice della membrana dello scantinato. Tutte le foto sono state scattate dopo le 16h. L'imaging è stata eseguita con microscopia in campo chiaro e l'ingrandimento = 2 X per pannelli A e B. L'imaging è eseguito con microscopia fluorescente e l'ingrandimento = 10 X per pannelli C e D. Pannelli A e C mostrano piatti LN-rivestito. Pannelli B e D mostrano piatti rivestite con FN. La barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: formazione dopo la differenziazione endoteliale di ratto CPC del tubo. CPCs ratto erano seminate ad una densità bassa delle cellule su 10 µ g/mL di LN - o FN-coated piatti con 0,1% FBS-contenente F12 medio per 20 h, seguito da un altro 21D in medio 3 e poi raccolto con tripsina. Sulla matrice della membrana dello scantinato su una piastra a 96 pozzetti, 4 x 104 cellule sono state seminate in 100 μL di taglia media 3. L'imaging è stata eseguita con microscopia in campo chiaro. L'ingrandimento = 2 X; la barra della scala = 50 µm. Questa cifra viene modificata basato su un precedente studio33. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Specie | Isolamento, indicatore di rilevamento | Riferimento |
| Umano, ratto, mouse | c-kit+/Lin-, /CD45 di c-kit+-, c-kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, cella 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, celle 2013; Smith, Nat Protoc 2014; Vicinanza, morte delle cellule differiscono 2017 |
| Cani ibridi | Lin-, plus: c-kit+, MDR1+ o Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Mouse | SCA-1+ | Oh, PNAS 2003 |
| Mouse | Popolazione di lato, plus: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, /PDGFRa Sca-1++ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Mouse | Colonia che formano unità-del fibroblasto, plus: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Mouse, ratto, umano | ISL-1+ *, plus: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, NKX 2.5+ | Laugwitz, natura 2005; Bu, natura 2009 |
| * Isl-1 si trova nel miocardio embrionale o fetale, non nel cuore adulto. | ||
Tabella 1: Tecniche di isolamento e i marcatori delle cellule progenitrici cardiache.
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Discussion
Vantaggi di questo protocollo:
Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l'efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati isolati e ampliato. In particolare, il protocollo era applicabile a entrambi i tipi di CPCs. corrente tecniche permettono agli scienziati di isolare ed espandere CPCs primario da topi geneticamente modificati e modelli di malattia preclinica, così come gli esseri umani28,36. Usando questo protocollo il CPCs isolato potrebbe essere utile per lo studio dei meccanismi di malattia non solo ma anche per l'esplorazione di nuovi bersagli terapeutici.
CPC sono attualmente in fase di test clinici per cella terapia4,5, per cui le cellule sono isolate da pazienti e retro trapiantato dopo amplificazione in vitro . A questo proposito, il protocollo presentato qui poteva contribuire ad identificare strategie per aumentare il potenziale di differenziazione di tali CPC prima di trapianto. Tuttavia, la terapia cellulare soffre ancora di efficacia limitata a causa della bassa ritenzione, la sopravvivenza e l'attecchimento delle cellule trapiantate. Gli studi meccanicistici in vitro basati su questo protocollo o sugli adattamenti della stessa hanno il potenziale per contribuire ad una migliore comprensione dei meccanismi molecolari di guida nel processo di differenziazione particolare, meccanismi correlati alla densità delle cellule , substrato e fattori di crescita. Nuove conoscenze Estratto da tali studi, infine, possono essere utilizzata per la riprogrammazione delle cellule e applicata per influenzare direttamente il CPCs residente per differenziare dopo la ferita.
Limitazioni del presente protocollo:
CPC primario isolato sono popolazioni eterogenee che mostrano fenotipi differenti rispetto alla cella dimensione e tasso di crescita delle cellule a seconda dell'isolamento, anche quando si utilizza la stessi marcatori e tecnica di isolamento identico. Pertanto, è necessario definire i seguenti tre punti: (1) la semina delle cellule numeri secondo la dimensione delle celle (2) la concentrazione nel siero ideale (< 0,5%) e (3) il tempo di incubazione per la prima fase (induzione di lignaggio) con una concentrazione molto bassa nel siero. Qui, ci mostrano le differenze di rendimento di differenziazione a seconda della densità delle cellule. Tuttavia, anche se abbiamo confrontato il siero basso (0,1% FBS) contro le concentrazioni nel siero cultura (3,5% FBS), abbiamo non esaminare altre concentrazioni all'interno il < 0,5% gamma FBS. Inoltre, variano a seconda la specie e i marcatori di isolamento utilizzati, l'efficienza dell'induzione dell'impegno di lignaggio. Di conseguenza, il protocollo deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula.
Tecniche di induzione/inibizione farmacologica e genetica potrebbero essere usati per esaminare i meccanismi di malattia con questo protocollo, anziché geneticamente modificati o modelli animali di malattia. In questo caso, il protocollo deve essere riprogettato: prima del trattamento con basso-siero-contenente medio, le cellule saranno trattate con reagenti specifici o strumenti genetici. Di conseguenza, le cellule possono essere più vulnerabili rispetto alle cellule non trattate. Usando il siero basso nel primo passaggio è il punto chiave in questo protocollo. Pertanto, una validazione accurata del tempo di concentrazione e l'incubazione del siero per il primo passo consentire per rallentare la proliferazione delle cellule, mantenendo attuabilità sotto privazione del siero è fondamentale per se questo protocollo può essere un successo o no.
Sommario:
In sintesi, CPCs isolato dai modelli animali forniscono un prezioso strumento per gli studi di rigenerazione e malattia cardiaci. All'espansione, CPCs umano può anche essere utilizzato direttamente per la terapia cellulare. Noi, qui, fornire un protocollo per l'induzione di derivazione endoteliale efficiente e differenziazione di CPC basato su un'attenta adattamenti delle concentrazioni del siero e della densità delle cellule. Il vantaggio di questo protocollo è la sua applicabilità ai diversi tipi di CPCs e le sue potenzialità di contribuire una base per lo studio della e/o la creazione di altri strumenti di romanzo rigenerazione cardiaca.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell'impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l'Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
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- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
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