Summary
Este protocolo descreve uma técnica de diferenciação endotelial para células progenitoras cardíacas. Centra-se sobretudo em como concentração sérica e densidade de semeadura de célula afetam o potencial de diferenciação endotelial.
Abstract
Células progenitoras cardíacas (CPCs) podem ter um potencial terapêutico para regeneração cardíaca após lesão. No coração dos mamíferos adulto, CPCs intrínsecos são extremamente escassos, mas CPCs expandidas podem ser útil para terapia celular. Um pré-requisito para a sua utilização é a sua capacidade de se diferenciar de uma forma controlada nas várias linhagens cardíacas usando protocolos definidos e eficientes. Além disso, a expansão em vitro , CPCs isolaram de pacientes ou modelos pré-clínicos doença podem oferecer ferramentas de pesquisa proveitosa para a investigação dos mecanismos da doença.
Estudos atuais usam marcadores diferentes para identificar CPCs. No entanto, nem todos eles são expressos em seres humanos, que limita o impacto translacional de alguns estudos pré-clínicos. Protocolos de diferenciação que são aplicáveis independentemente da expressão técnica e marcador de isolamento permitirá a expansão padronizada e escorva do CPCs para efeito de terapia celular. Aqui descrevemos que escorva CPCs sob uma concentração baixa de soro fetal bovino (FBS) e as condições de densidade celular baixa facilita a diferenciação endotelial dos CPCs. usando dois diferentes subpopulações de rato e rato CPCs, mostramos que a laminina é uma mais substrato adequado que fibronectina para este fim, sob o seguinte protocolo: depois para 2-3 dias em média, incluindo os suplementos que manter multipotency de cultivo e com 3,5% FBS, CPCs são semeados na laminina em < 60% confluência e cultivadas em meio livre de suplemento com baixas concentrações de FBS (0,1%) por 20-24 horas antes de diferenciação num meio de diferenciação endotelial. Porque CPCs são uma população heterogénea, concentrações séricas e tempos de incubação podem precisar ser ajustada dependendo das propriedades da respectiva subpopulação de CPC. Considerando isso, a técnica pode ser aplicada a outros tipos de CPCs também e fornece um método útil para investigar o potencial e os mecanismos de diferenciação e como eles são afetados pela doença quando usando CPCs isoladas de modelos respectivos de doença.
Introduction
Estudos recentes suportam a existência de células progenitoras cardíacas residente (CPCs) no coração dos mamíferos adultos1,2,3, e CPCs poderiam ser uma fonte útil para terapia celular após lesão cardíaca4, 5. Além disso, CPCs expandidas podem fornecer um modelo frutífero para rastreio de drogas e a investigação dos mecanismos da doença quando isoladas de pacientes com miocardiopatias raras ou de doença respectiva modelos6,7.
PCC isolado do coração adulto possuem tronco/progenitoras célula características1,2,3,8 como eles são multipotentes, clonogenic, e têm a capacidade de auto-renovação. No entanto, há muitos diferentes (sub) populações CPCs exibindo perfis de marcador de superfície diferentes, incluindo, por exemplo, c-kit, Sca-1 e outros, ou obtida por técnicas de isolamento diferentes (tabela 1). Vários protocolos de cultura e diferenciação foram estabelecidas1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estes protocolos variam principalmente no que diz respeito a fator de crescimento e teor de soro, que são ajustadas de acordo com a finalidade do cultivo e que pode levar a diferenças nos resultados e as consequências, incluindo a eficiência de diferenciação.
Técnicas de isolamento baseados no marcador:
PCC pode ser isolados com base em um marcador de superfície específicos expressão1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudos anteriores sugerem que a c-kit e Sca-1 podem ser os melhores marcadores para isolar residente CPCs1,11,14,19,20. Porque nenhum desses marcadores é verdadeiramente específico para CPCs, combinações de diferentes marcadores são geralmente aplicadas. Por exemplo, Considerando que CPCs expressam baixos níveis de c-kit21, c-kit é expressa também por outros tipos de células, incluindo mastócitos22, células endoteliais23e de células tronco/progenitoras hematopoiéticas24. Um problema adicional é o fato de que nem todos os marcadores são expressos através de todas as espécies. Este é o caso da Sca-1, que se expressa no rato mas não no humano25. Portanto, usar os protocolos que são independentes dos marcadores de isolamento pode ser vantajoso, tendo em conta os ensaios clínicos e estudos usando amostras humanas.
Técnicas de isolamento de marcador independente:
Existem várias técnicas principais de isolamento do CPC, que são principalmente independentes da expressão do marcador de superfície, mas que pode ser refinado pela seleção consecutiva do específicos marcador positivo subfractions conforme necessário (Veja também a tabela 1). (1) a técnica de população (SP) lado originalmente tem sido caracterizada em uma população primitiva de células-tronco hematopoiéticas baseado na capacidade de efluxo o corante de ADN Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP foram isoladas por diferentes grupos e relatadas para expressar uma variedade de marcadores com algumas pequenas diferenças entre relatórios2,8,13,14. (2) células de fibroblastos de unidade formadoras de Colônia (CFU-Fs) originalmente foram definidas com base em uma célula do estroma mesenquimal (MSC)-como fenótipo. MSCs isoladas são cultivadas em pratos para induzir a formação de colônia. Tais formadoras MSC-como CFU-Fs podem ser isolado do coração adulto e são capazes de se diferenciarem em linhagens cardíaca15. (3) Cardiosphere-derivado de células (CDC) são células únicas, derivadas de aglomerados de células cultivadas a partir de biópsias do tecido ou explants28,29,30,31. Recentemente foi demonstrado que, na maior parte o CD105+/CD90–/c-kit– fração de célula exibe cardiomyogenic e potencial regenerativo32.
Aqui, usando SP-CPCs isolados de ratos, nós fornecemos um protocolo para a indução eficiente da linhagem endotelial com base em um estudo anterior em CPCs de rato e rato SP-CPCs33. O protocolo contém adaptações específicas à cultura e técnica de expansão em relação a densidade celular, o soro que integram o meio e o substrato. Isso pode ser aplicado não só ao rato SP-CPCs mas para diferentes tipos de CPCs para o propósito para induzir um interruptor de destino de uma amplificação para um CPC endotelial-cometeu, seja tendo em conta o transplante dessas células ou sua utilização para estudos mecanicistas em vitro .
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Protocol
O uso de ratos para efeito de isolamento de célula estava de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e com a lei Suíça de proteção Animal e foi aprovado pelas autoridades cantonais suíços.
Nota: O isolamento da Sca-1+/CD31– SP-CPCs do coração de rato foi essencialmente feito como descrito anteriormente34 com algumas modificações. Para os materiais e reagentes usados, consulte Tabela de materiais. Para todos os experimentos, SP-CPCs cardíacas isoladas de ratos foram amplificados, passadas e usados em uma maneira semelhante ao linha de celular. Passagens 7-20 foram utilizadas para este estudo.
1. tecido preparação
Nota: Todos os experimentos utilizando ratos devem ser efectuados de acordo com as diretrizes e regulamentos. Este protocolo usa quatro ratos. Placas de cultura que são de 100 mm de diâmetro são descritas como P100 e placas de cultura que são 60 mm de diâmetro são descritas como P60 para as seguintes partes do protocolo.
- Injetar cada rato com 200 mg/kg de pentobarbital intraperitonealmente (i.p.) e espere até que ele é totalmente anestesiado, verificando a sua resposta para toe beliscar.
- Limpe o peito com etanol a 70%. Corte a pele e a parede torácica com uma tesoura para expor a cavidade torácica.
- Levantar o coração com fórceps e cortá-la na base com uma tesoura. Colocar o coração em um P100 com 25 mL (5 mL para P60) de frio fosfato salino (PBS) (três a cinco corações por P100) ou um ou dois corações por P60.
- Bombear o coração com fórceps para ejetar o sangue para fora das cavidades (figura 1A).
- Colocar o coração em um P100 com 25 mL (5 mL para P60) de frio PBS para lavar. Remova os átrios com uma tesoura pequena. Corte o coração em dois pedaços longitudinais e lavá-los novamente em PBS gelado (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Transferi as peças para um novo P100 com 25 mL (5 mL para P60) de PBS frio. Corte os pedaços em pequenos pedaços com uma tesoura pequena (figura 1B). Adicionar uma gota de colagenase 1 mg/mL B diluída em solução salina do Hank, equilibrada (HBSS) e picar as pequenas peças cuidadosamente com uma lâmina de barbear estéril (Figura 1).
2. digestão
- Adicione 10 mL (2,5 mL para P60) da solução B colagenase 1 mg/mL para o prato da etapa 1.6.
- Colocar a solução de colagenase B contendo os pedaços de coração picada em um inclinado (cerca de 30°) P100 (ou P60) em uma incubadora de 37 ° C (Figura 1).
- Incubar os pedaços de coração picada por um período máximo de 30 min; Homogeneizar por várias vezes, passando-os por meio de uma pipeta Pasteur cada 10min durante a incubação (Figura 1E).
Nota: É importante para não exceder 30 min de incubação no total para etapa 1.3.
3. filtração
- Adicionar 10 mL (5 mL para P60) de frio HBSS suplementado com 2% FBS em pedaços o coração picada e homogeneizado.
Nota: HBSS suplementado com 2% FBS sacia colagenase B atividade. - Filtre os pedaços de coração 100 µm filtro para remover tecido não digerido e centrifugar 470 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) (Figura 1F, filtros amarelos).
- Desprezar o sobrenadante e resuspenda o pellet em (3 mL para P60) de 5 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue e incubar a pelota por 5 min com agitação ocasional no gelo.
- Adicionar 10 mL (5 mL para P60) de PBS (para parar a reação de Lise) e filtrar a amostra através de um filtro de 40 µm para excluir células maiores, incluindo cardiomyocytes residual (Figura 1F, filtros azuis).
- Centrifugar o tubo a 470 x g durante 5 min à RT (sem freio). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de DMEM, incluindo 10% FBS.
- Conte as células em uma alíquota com um hemocytometer. Ressuspender as células com DMEM, incluindo 10% FBS, visando a uma concentração final de célula de 1 x 106 células/mL.
Nota: Aproximadamente 5 x 106 casos e eritrócitos-depleção de células podem ser estimadas por rato. - Distribuir as células em dois tubos (Figura 2): no tubo A, adicionar 1,5 mL para coloração de Hoechst 33342 com verapamil; no tubo B, adicionar 18,5 mL para coloração de Hoechst 33342 e proceder à mancha e classificar as células cardíacas de SP (etapas 4.1 e 4.2) por citometria de fluxo.
4. classificação das células cardíacas SP por citometria de fluxo
Nota: Verapamil inibe a Hoechst efluxo bloqueando multirresistência atividade de transporte do ABC (MDR). Hoechst 33342 é um corante de ligação a DNA que pode ser usado em células vivas para detectar o ciclo celular, como correlaciona com o conteúdo de DNA. Hoechst-33342-expulsando células aparecem na parte de baixo de Hoechst de ambos os canais de emissão (450 nm, Hoechst azul; 650 nm, Hoechst vermelho), isto é, aparte da Hoechst-fixação "principal população", dando-lhes o seu nome "lado população". SP, células são enriquecidas em células com propriedades de progenitor e mostram uma alta expressão de transportadores de ABC multirresistentes (como MDR1 e ABCG2). Hoechst 33342 é escrito como Hoechst para as seguintes partes do protocolo. É importante proteger os materiais sensíveis à luz, para obter resultados ideais.
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Coloração com Hoechst na presença e na ausência de verapamil
- Adicione o verapamil (com uma concentração final de 83,3 µM) e Hoechst (com uma concentração final de 5 µ g/106 células) para a solução de célula. Para o tubo A, usar Verapamil e Hoechst; para o tubo B, use somente Hoechst. Incubar em banho de água (a 37 ° C) por 90 min e reverter os tubos a cada 20 min (Figura 1).
- Centrifugar os tubos a 470 x g durante 5 min à RT. descartar o sobrenadante e ressuspender cada em HBSS (1 x 106 células/mL).
- Pegue um 1,5 mL alíquota para colorações única e o controlo negativo do tubo B (Figura 2): (i) isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugado anti-CD31; (iii) nonstained células (controle negativo).
Nota: Isotipo controles são usados aqui para configurar o protocolo de isolamento. - Tubos de centrifugação A e B e as alíquotas de controle único de coloração e negativo a 470 x g durante 5 min à RT para lavagem Hoechst e verapamil.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de tubo A e (iii) o controle negativo em 250 µ l de HBSS e mantê-los no gelo no escuro até a classificação.
- Resuspenda o pellet de tubo B em 200 µ l de HBSS e a pelota de (i, ii) as alíquotas single-coloração em 100 µ l de HBSS. Adicione FITC-Conjugado anti-Sca-1 (0,6 µ g/107 células) e APC-conjugado anti-CD31 (0,25 µ g/107 células). Incubar as bolinhas por 30 min no gelo e agitá-los de vez em quando no escuro.
- Adicione 2 mL de HBSS para os tubos. Centrifugar os tubos a 470 x g durante 5 min à RT
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender todos os chumbos com 1 mL de HBSS e centrífuga como acima. Descarte os sobrenadantes. Resuspenda o pellet das alíquotas single-coloração em 200 µ l de HBSS. Resuspenda o pellet de tubo B em HBSS (20 x 106 células/mL).
- Mantenha as amostras no gelo e protegido da luz, até a classificação.
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Classificação com citometria de fluxo
- Preparar estéril 1,5 mL classificação tubos com 500 µ l de HBSS, incluindo 2% FBS.
- Manche as células com o 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µ g/106 células) no gelo por 10 min para excluir as células mortas.
- Classificar o SP cardíaco usando as seguintes configurações: excitar Hoechst usando 350 excitação nm (UV), coletar de emissão de fluorescência com um filtro de passa-faixa 450/50 nm (Hoechst azul) e um filtro de passa-faixa 670/30 nm (vermelho de Hoechst) e usar um tamanho de bico de 100 µm e pressão de 15 libras por polegada quadrada.
- Para análise, grave 5 x 105 eventos para a classificação de amostras e 1 x 105 eventos para o controle negativo, controle de verapamil e single-manchando amostras.
Nota: A cardíaca SP é de cerca de 0,5% - 2% (Figura 1-H), mas pode variar entre laboratórios e isolados. A Sca-1+/CD31– fração é de cerca de 1% e 11% do total SP cardíaca (Figura 1I) mas pode variar entre laboratórios e isolados. SCA-1+/CD31– SP-CPCs são escritos como SP-CPCs para as seguintes partes do protocolo.
5. principal cultura de SP-CPCs isolados
Nota: Três tipos diferentes de meios foram utilizados no presente protocolo. Eles são referidos como Medium 1 (de acordo com Noseda et al) 8, 2 médio e médio 3 e são descreveram na Tabela de materiais sobre sua composição.
- Aquecer médio 1 a 37 ° C antes do uso e arrefecer o centrifugador a 4 ° C. Centrifugar os tubos classificação a 4 ° C e 470 x g durante 6 min e ressuspender as células em média 1.
- Colocar as células em um prato P60 permeável ao gás com 4 mL de meio 1. Mude o cada 3 d médio até que as células têm alcançado confluência de 70-80%.
Nota: Passo 5.2 pode demorar cerca de 2-3 semanas.
6. expansão e diferenciação de SP-CPCs
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Cultura celular
- Cultura de 3 x 105 SP-CPCs em 8 mL de médio 1 num balão T75.
- Incube SP-CPCs a 37 ° C com 5% CO2 até 70% - 80% de confluência, alterando o meio d cada 2-3.
Nota: O número de células deve ser modificado de acordo com o tipo de CPCs usado, o tempo de duplicação e o tamanho da célula.
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SP-CPC crescimento e viabilidade sob concentrações séricas diferentes
- Cultura SP-CPCs para 2-3 d no T75 frascos com 8mL de médio 1. Cuidadosamente, Aspire o meio e lave delicadamente com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS.
- Tratar as células com 5 mL de Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora celular, adicionar 5 mL de meio 1 para evitar que a atividade de tripsina e transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
- Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT
- Ressuspender as células em médio 1 ou 2 médios (médio de indução de linhagem) e placa de 2.5 x 105 SP-CPCs em P60 pratos com 3 mL de meio contendo concentrações séricas diferentes.
- Recolha o meio do prato da etapa 6.2.4 para a coleção de células mortas em um tubo de 15 mL após 2 d de cultivo em médio 1 ou 2 médio.
- Trypsinize células aderentes como no passo 6.2.2 e coletar a suspensão de células dentro do tubo de 15 mL de passo 6.2.5. Centrifugar as células a 840 x g durante 5 min à RT
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio 1 ou 2 médio para a contagem de células. Mancha de SP-CPCs com azul de trypan (0,4%) e contagem trypan azul-positivo (mortos) e trypan azul-negativo (viável) células.
Nota: A viabilidade celular (passo 6.2.7) é dado como o número de células negativas trypan azul em relação ao número total de células.
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Indução de diferenciação endotelial
- Precoat uma placa de cultura (6-bem) com 10 µ g/mL de laminina (LN) ou fibronectina (FN).
- Fazer uma solução de substrato contendo 10 µ g/mL de LN ou FN com F12 médio (ou PBS). Adicione 2 mL de solução de substrato para cada poço. Manter a placa durante 30 min a 37 ° C.
- Aspirar a solução da chapa e adicione 2 mL de PBS a cada poço até usá-lo.
- Aspire o meio das células da etapa 6.1.2, lave-as delicadamente com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS, tratá-los com 5 mL de Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora celular, adicionar 5 mL de meio 1 para evitar que a atividade de tripsina e transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
- Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT. Aspire o sobrenadante e adicionar 2 médio para a contagem de células.
- Células de4 sementes 8x10 por bem na placa revestida com 3 mL de meio de 2 e mantém-lo a 37 ° C por 20-24 h.. mudança do meio de 3 mL de meio 3.
Nota: Recomendamos o uso médio que contém uma concentração baixa de soro — e sem suplementos — para as primeiras 20-24 horas. É recomendável usar < confluência de célula de 60% (ou seja, o número de células da etapa 6.3.4 deve ser ajustado dependendo da taxa de crescimento e tamanho da célula). - Cultura de células para 21 d e mudar o meio de cada 3 d.
- Verificar a natureza endotelial de células diferenciadas pela coloração-los com um marcador endotelial, tais como a von Willebrand (vWF) de fator e realizando microscopia de fluorescência.
- Lavar as células com 1 mL de PBS e consertar as células em 3,7% formaldeído por 2 min em RT
- Permeabilize as células com 0.1% Triton X em ddH O2(ou PBS) por 30 min e bloqueá-lo com 10% de soro de cabra por 1h no RT
- Incube as celulas com anti-von Willebrand factor anticorpos (1: 100) 48 h a 4 ° C
- Lavar as células 3 x 1 ml de PBS, durante 10 minutos cada vez. Incube-os com Alexa Fluor 546 cabra anticoelho secundário de anticorpos (1: 500) 1 h no RT no escuro.
- Lave novamente 3x, durante 10 minutos cada, com 1 mL de PBS. Mancha o núcleo de células com 4'6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI; 1: 500) durante 5 min à RT no escuro.
- Lavar as células 3 x, por 5 min cada, com 1 mL de PBS. Montar as células e armazená-los em 4 ° C
Nota: As condições de cultivo (substrato, meio, reagentes complementares e concentração de FBS) dos passos 6.1 e 6.3 são descritas na Figura 3.
- Precoat uma placa de cultura (6-bem) com 10 µ g/mL de laminina (LN) ou fibronectina (FN).
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Ensaio de formação de tubo
- Preparar uma matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel, doravante referida como matriz) placa.
- Descongele a matriz a 4 ° C durante a noite.
- Revesti uma placa de 96 poços com 100 µ l da matriz no gelo.
Nota: É importante evitar quaisquer bolhas na matriz. As placas têm de ser revestido no gelo para evitar a geleificação da matriz. - Manter a placa a 37 ° C por 30 min.
- Aspire o meio das células (após a conclusão da etapa 6.3.5), suavemente enxaguar as células com 5 mL de quente (37 ° C) HBSS e tratá-los com Trypsin-EDTA por 5 min na incubadora de célula. Adicione 3 médio para parar a atividade de tripsina e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL.
- Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min à RT. Aspire o sobrenadante, adicionar 1 mL de meio 3 e pipetar suavemente.
- Filtre as células com um coador de célula de 35 µm, se as células são agregadas.
- Contar as células e semente de 2 x 103 a 4 x 103 células em 100 µ l de meio 3 em cada matriz-revestido bem. Manter a placa a 37 ° C, a incubadora de célula para 16 h.
- Tire uma foto com um microscópio de campo claro na ampliação de X 2.
Nota: No caso de uma tripsinização incompleta, prolonga o tempo de exposição para Trypsin-EDTA para um máximo de 7-8 min.
- Preparar uma matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel, doravante referida como matriz) placa.
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Representative Results
Isolamento do CPC-SP de mouse:
Neste estudo, nós usamos o CPCs de rato isolados de acordo com o fenótipo de SP, Considerando que os resultados do rato CPCs são modificados e adicionados de um relatório anterior com permissão (Figura 8)33.
Proliferação de célula em célula de alta e baixa densidades e com concentrações diferentes de soro:
Nosso estudo anterior mostrou que a expressão de RNAm de marcadores cardíacos linhagem alterado dentro as primeiras 24 horas de cultivo passo. É sabido que a matriz extracelular afeta as decisões de destino de célula, incluindo diferenciação endotelial35. Para explorar as condições adequadas para a facilitação de compromisso linhagem endotelial dos CPCs, usamos FN e LN (ambos 10 µ g/mL) em uma placa de 6 (área de crescimento: 9,6 cm2/bem) neste estudo. Porque as decisões de ciclo celular e a célula de destino estão intimamente ligadas, estamos buscando a condição que apresenta uma taxa de proliferação celular baixa na ausência de morte celular, como tal, uma condição pode refletir a transição da proliferação das células de diferenciação. Nós, portanto, aplicar as seguintes condições e comparou taxas de proliferação celular: para densidade celular, confluência de alta (80-90%) e baixa (< 60%) confluencia e para a concentração de soro, condições de cultura normal (neste estudo 3,5% FBS) e baixo soro condições (0.1% FBS). Primeiro, testamos a condição de densidade celular baixa. Não havia diferenças significativas de viabilidade celular e proliferação da densidade celular baixa com 3,5% FBS entre LN e FN, Considerando que uma densidade celular baixa com 0,1% FBS mostrou uma proliferação celular diminuída na LN comparado a FN, mas sem aumento da morte celular ( Figura 4). Em contraste, sob condições de célula de alta densidade, concentrações séricas de 3,5% e 0,1% não mostraram nenhuma diferença na proliferação celular e na morte celular entre os dois substratos (Figura 5).
Estes resultados indicam que uma densidade celular baixa na LN com 0.1% de soro diminui proliferação sem afetar a viabilidade do CPC.
Mudanças na forma de célula no meio de diferenciação endotelial:
Embora necessitando de mais estudos para entender o significado e os mecanismos subjacentes, mudanças na forma celular aparecem ser um indicador das condições de cultura apropriado como alterações específicas pode ser observados desde o início em culturas, no qual endotelial diferenciação vai ser bem sucedido (Figura 6). Conforme os círculos brancos tracejados na Figura 6, dentro de 7-14 d no meio de diferenciação endotelial, culturas bem sucedidas continham células que eram maiores e diferentes na morfologia para as outras células. Curiosamente, estas células desapareceram no final da fase de diferenciação e também aparecem em números mais baixos e em pontos de tempo posteriores em culturas de alta densidade na LN e nota de rodapé Considerando que nós ainda não caracterizam estas células, este protocolo sugere seguindo a forma da célula cada 2-3 d até próximo dia 14. Se nenhuma dessas células aparecem, o número de células semeado deve ser diminuído.
Avaliação da capacidade endotelial com um ensaio de formação de tubo:
O ensaio de formação de tubo é uma técnica útil para avaliar a eficiência da diferenciação endotelial dos CPCs medindo a capacidade de formação de tubo de células diferenciadas. Portanto, realizamos o ensaio de formação de tubo com células diferenciadas de acordo com as condições descritas. Curiosamente, formação bem sucedida do tubo foi mostrada consistentemente por células chapeado em baixa densidade e diferenciados em LN, Considerando que a formação do tubo falhou principalmente nas células chapeadas na LN em uma densidade elevada (Figura 7A). Da mesma forma, formação do tubo fracassou principalmente em células cultivadas na FN, independentemente da densidade celular, embora as células diferenciadas na FN em uma baixa densidade por vezes formaram tubos rudimentares, dependendo da condição de célula (por exemplo, isolar e/ou passagem número, Figura 7B). Para confirmar a natureza endotelial das células, células chapeadas em lamelas foram diferenciadas de acordo com o protocolo descrito e manchadas por vWF. Novamente, a expressão de vWF era mais homogênea e mais pronunciado em CPCs diferenciados em LN comparado a FN (Figura 7D). A Figura 8 mostra os resultados do ensaio de formação de tubo como realizado por estudos anteriores, usando o rato CPCs sob o mesmo protocolo como aqui descritos33. Estes resultados mostram que a formação do tubo é mais eficiente nas células diferenciadas na LN em comparação com o FN quando banhado em condições de densidade celular baixa e com baixo soro (0,1% FBS) para 20-24 h antes de diferenciação num meio de diferenciação endotelial. Estes resultados sugerem que este protocolo pode ser útil para vários tipos de células e independente da espécie.
Figura 1: ilustração de isolamento específico de etapas para obter uma suspensão de células empobrecido casos de corações de rato isolado e representativo fluxo cytometry leituras do SP. cardíaca (A), este painel mostra a ejeção do sangue residual nas cavidades do coração através de repetidas ligeira pressão aplicada usando pequenas pinças. (B), este painel mostra o corte dos corações em pequenos pedaços com uma tesoura pequena. (C), este painel mostra a picagem das peças coração usando uma lâmina de barbear. (D), este painel mostra a incubação dos corações picadas com colagenase B em placas inclinadas a 37 ° C. (E), este painel mostra a homogeneização dos corações picadas com uma pipeta de Pasteur, durante a etapa de incubação. (F) este painel mostra a filtragem do tecido digerido através de um filtro de 100 µm (amarelo) e um filtro 40 µm (azul) para a remoção de resíduos de tecido não digerido e cardiomyocytes. (G) este painel mostra a inversão suave de um tubo cónico de 50 mL contendo a suspensão de eritrócitos casos empobrecido e embrulhar em papel alumínio para protecção leve após a adição da Hoechst. (H), este painel mostra representativo fluxo cytometry leituras de células manchadas de Hoechst na presença e na ausência do verapamil de inibidor de transportador ABC para a identificação do SP. (eu) este painel mostra uma trama de ponto representativo de SP células de acordo com CD31 e Sca-1 positividade para a identificação da Sca-1+/CD31 subfraction– . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visão geral esquemática da preparação amostra levando até a classificação de SP cardíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: protocolo para indução de linhagem endotelial e diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: proliferação de Mouse SP-CPC quando banhado em uma densidade celular baixa sob concentrações diferentes de soro no LN e nota de rodapé (A e B) Estes painéis mostram os números de celular no dia 2. (C e D) Estes painéis mostram a viabilidade no dia 2. Os dados são mostrados como a média ± erro padrão da média (SEM); N = 5; passagens diferentes; p < 0.05 por Student t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: proliferação de Mouse SP-CPC quando banhado em uma densidade elevada célula sob concentrações diferentes de soro no LN e nota de rodapé (A e B) Estes painéis mostram os números de celular no dia 2. (C e D) estes painéis mostram a viabilidade no dia 2. Os dados são mostrados como a média ± o SEM; N = 5; passagens diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: morfologia em 14 e 17 d durante o processo de diferenciação de células. Esta figura mostra brilhante-campo (BF), imagens do mouse SP-CPCs semearam em pratos LN - ou FN-revestido com um low (baixa) ou uma densidade elevada (alta) de célula e com meio 2 de 20 h, seguido por meio de 3 para 14 ou 17 d. branca círculos tracejados marcam as áreas contendo sagacidade de células redondas h um maior tamanho de célula. A imagem foi feita com microscopia de campo claro. A ampliação = 2 X; barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: formação e vWF coloração após diferenciação endotelial de SP-CPCs no LN e nota de rodapé de tubo (A e B) Estes painéis mostram a formação do tubo. (C e D) Estes painéis mostram a coloração do vWF. Células foram semeadas em 10 µ g/mL de pratos LN - ou FN-revestido com uma densidade celular baixa ou alta e média 2 para 20 h, seguidas por meio de 3 para 21 d, colhidas com tripsina e semeadas na matriz da membrana basal. Todas as fotos foram tiradas após 16 h. A imagem foi feita com microscopia de campo claro e a ampliação = 2 X para painéis A e B. A imagem é executada com microscopia fluorescente e a ampliação = 10 X para painéis C e D. Os painéis A e C mostram pratos LN-revestido. Os painéis B e D mostram pratos FN-revestido. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: tubo formação após a diferenciação endotelial de rato CPCs. Rato CPCs foram semeadas em uma densidade celular baixa em 10 µ g/mL de pratos LN - ou FN-revestido com meio de F12 FBS-contendo 0,1% de 20 h, seguido por outro d 21 em média 3 e então colhidas com tripsina. Na matriz da membrana basal em uma placa de 96 poços, 4 x 104 células foram semeadas em 100 μL de médio 3. A imagem foi feita com microscopia de campo claro. A ampliação = 2 X; barra de escala = 50 µm. Esta figura é modificada com base em um anterior estudo33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécies | Isolamento, marcador de deteção | Referência |
| Humano, rato, rato | c-kit+/Lin-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, célula, 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, célula 2013; Smith, Nat protocolo 2014; Vicinanza, morte celular diferem 2017 |
| Cães rafeiros | Lin-, e mais: kit-c+, MDR1+ ou Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Mouse | SCA-1+ | Ah, PNAS 2003 |
| Mouse | População de lado, e mais: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, /PDGFRa Sca-1++ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Mouse | Unidade formadora de colônia - fibroblasto, além de: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Rato, rato, humano | ISL-1+ *, e mais: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, natureza, 2005; Bu, natureza 2009 |
| * Isl-1 é encontrada no miocárdio embrionário ou fetal, não no coração adulto. | ||
Tabela 1: Técnicas de isolamento e marcadores de células progenitoras cardíacas.
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Discussion
Vantagens do presente protocolo:
Este protocolo fornece uma técnica de diferenciação endotelial do CPCs. Achamos que uma concentração sérica baixa e a densidade celular baixa podem melhorar a eficiência da diferenciação endotelial, pelo qual LN provou para ser um substrato mais adequado do que FN nestas condições. Nós usamos dois tipos distintos de CPCs: rato CPCs, que foram usados em uma maneira semelhante ao linha de celular e mouse SP-CPCs, que foram isoladas e expandido. Notavelmente, o protocolo foi aplicável para ambos os tipos de corrente CPCs. técnicas permitem que cientistas isolar e expandir CPCs primários de camundongos geneticamente modificados e de modelos pré-clínicos de doenças, bem como de seres humanos28,36. Usando este protocolo na CPCs isolados pode ser útil para a investigação dos mecanismos de doença não só mas também à exploração de novos alvos terapêuticos.
PCC está atualmente em testes clínicos para celular terapia4,5, segundo o qual as células são isoladas de pacientes e transplantada volta após amplificação em vitro . A este respeito, o protocolo apresentado aqui poderia ajudar a identificar estratégias para aumentar o potencial de diferenciação de tais CPCs antes do transplante. No entanto, a terapia celular ainda sofre de eficácia limitada devido à baixa retenção, sobrevivência e enxertia das células transplantadas. Mecanicista em vitro estudos com base no presente protocolo ou em adaptações respectivas têm o potencial de contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares a conduzir o processo de diferenciação-em particular, mecanismos relacionados à densidade celular , substrato e fatores de crescimento. Novo conhecimento Obtido em tais estudos, finalmente, pode ser usado para reprogramação celular e aplicado para influenciar diretamente o CPCs residentes para diferenciar após lesão.
Limitações do presente protocolo:
CPCs primárias isoladas são heterogêneas populações que mostram diferentes fenótipos em relação ao tamanho da célula e a taxa de crescimento celular dependendo do isolamento, mesmo quando usando a mesmas marcadores e a técnica de isolamento idênticas. Portanto, é necessário definir os seguintes três pontos: (1) a célula semeadura números de acordo com o tamanho da célula, (2) a concentração de soro ideal (< 0.5%) e (3) o tempo de incubação para a primeira etapa (indução de linhagem) com uma concentração muito baixa de soro. Aqui, nós mostramos as diferenças na eficiência de diferenciação dependendo da densidade da célula. No entanto, embora nós comparamos soro baixo (0,1% FBS) versus concentração sérica de cultura (3,5% FBS), não examinamos outras concentrações dentro o < série FBS de 0,5%. Além disso, dependendo dos marcadores de isolamento utilizados e as espécies, a eficiência da indução de compromisso linhagem pode variar. Portanto, o protocolo deve ser otimizado para cada tipo de célula.
Técnicas de inibição/indução farmacológica e genética poderiam ser usadas para examinar mecanismos de doença com este protocolo, em vez de geneticamente modificados ou modelos animais de doença. Neste caso, o protocolo deve ser redesenhado: antes do tratamento com média baixa-soro-contendo, as células serão tratadas com reagentes específicos ou ferramentas de genéticas. Como consequência, as células podem ser mais vulneráveis do que pilhas de folhas. Usar soro baixo na primeira etapa é o ponto chave no presente protocolo. Portanto, uma cuidado validação do tempo de incubação e concentração de soro para a primeira etapa permitir a abrandar a proliferação da célula, mantendo a viabilidade sob privação de soro é crítica se este protocolo pode ser um sucesso ou não.
Resumo:
Em resumo, CPCs isolados de modelos animais fornecem uma ferramenta valiosa para estudos de doença e regeneração cardíacos. Após expansão, CPCs humanas também podem ser usados diretamente para terapia celular. Nós, aqui, fornecer um protocolo para a indução de linhagem endotelial eficiente e diferenciação dos CPCs baseado em adaptações cuidadosos das concentrações de densidade e soro de célula. A vantagem deste protocolo é sua aplicabilidade aos diferentes tipos de CPCs e seu potencial para contribuir com uma base para o estudo da e/ou o estabelecimento de outras ferramentas de romance regeneração cardíaca.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Vera Lorenz seu apoio útil durante as experiências e o pessoal da instalação de citometria de fluxo do departamento de Biomedicina (DBM), University e University Hospital Basel. Este trabalho foi apoiado pelo programa estadia-na pista da Universidade da Basileia (para Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster é suportado por uma concessão do Swiss National Science Foundation (número de concessão de 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
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- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
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