Summary
I denne protokol, er metoder for udførelse af indavl krydser, og for at vurdere disse Kors, succes beskrevet for ant Vollenhovia emeryi. Disse protokoller er vigtige for eksperimenter med henblik på forståelse af det genetiske grundlag for sex bestemmelse systemer i hvepse.
Abstract
De genetiske og molekylære komponenter af sex-bestemmelse kaskade er blevet grundigt undersøgt i honningbien Apis mellifera, en hymenopteran model organisme. Dog er lidt kendt om sex-bestemmelse mekanismer findes i andre ikke-model hymenopteran taxa, som myrer. På grund af den komplekse karakter af livscyklus, der har udviklet sig i hymenopteran arter, er det vanskeligt at opretholde og gennemføre eksperimentelle krydsninger mellem disse organismer i laboratoriet. Her, beskriver vi metoder til at gennemføre indavl Kors og for at vurdere disse krydsninger succes i ant Vollenhovia emeryi. Inducerende indavl i laboratoriet ved hjælp af V. emeryi, er relativt enkel på grund af den unikke biologi af arten. Specifikt, denne art producerer androgenetic mænd, og kvindelige reproductives udviser wing polymorfi, hvilket forenkler identifikation af fænotyper i genetiske krydser. Desuden er evaluere succes af indavl ligetil, som mænd kan være fremstillet kontinuerligt af indavl Kors, mens normal handyr vises kun en veldefineret yngle i feltet. Vores protokol giver mulighed for at bruge V. emeryi som en model til at undersøge den genetiske og molekylære grundlag for sex bestemmelse system i myre arter.
Introduction
Eusocial Hymenopteran taxa, som myrer og bier, har udviklet en haplodiploid sex-fastsættelse system i som enkeltpersoner, der er heterozygous på en eller flere supplerende sex bestemmelse (CSD) loci blive hunner, mens dem, der er homo- eller hemizygous blive hanner (fig. 1A)1.
Genetiske og molekylære komponenter involveret i sex bestemmelse cascade er blevet godt undersøgt i honningbien Apis mellifera, en hymenopteran model organisme2,3,4. Seneste Komparativ genomforskning undersøgelser tyder på, at myrer og honningbier deler mange formodede homologs i sex bestemmelse pathway, såsom indledende sex bestemmelse gen, csd5. Beviser for den funktionelle bevarelse af disse homologs mangler dog stadig i myrer.
For at løse dette problem, skal indavl linjer udvikles, så de er afgørende for genetiske kortlægning og molekylære undersøgelser. Det er imidlertid vanskeligt at opretholde og gennemføre eksperimentelle krydsninger mellem disse organismer i laboratoriet på grund af den komplekse karakter af livscyklus, der har udviklet sig.
Her bruger vi Vollenhovia emeryi som en model til at undersøge den genetiske og molekylære grundlag for sex bestemmelse system i myrer6,7. Indavl linjer af denne art blev udviklet tidligere kobling kortlægning af kvantitative træk loci (QTL) for træk relateret til sex bestemmelse for første gang i myrer6. Derudover har den molekylære sex-bestemmelse kaskade været undersøgte7. Denne art har udviklet sig en usædvanlig reproduktion system, der anvender både gynogenesis og androgenesis (figur 1B)8,9. De fleste nye dronninger og hanner er clonally fremstillet af mødres og faderlige genomer, henholdsvis. Derudover arbejdstagere og nogle queens produceres seksuelt8. Denne reproduktion system er særlig velegnet til genetiske undersøgelser, fordi indavl krydser fremstillet ved hjælp af seksuelt produceret dronninger og hanner er genetisk svarende til en klassisk backcross. Da generativt produceret queens afviger morfologisk fra queens fremstillet af maternel genomer10 (figur 1B), er gennemføre og evaluere indavl Kors stærkt forenklet ved hjælp af denne metode.
I denne artikel, metoder til etablering af laboratoriet kolonier for passage test, krydser anvendelsen af indavl ved hjælp af fuld-sib par, og evaluere succesen med disse krydser ved hjælp af genotypebestemmelse af kolonien medlemmer og dissektion af mandlige afkom kønsorganer er beskrevet i V. emeryi.
Uanset reproduktion system ansat, er anvendelsen af indavl krydser ofte vigtige første skridt i enhver undersøgelse af sex bestemmelse systemer i hvepse. I Cardiocondyla obscuriorviser den næsten fuldstændige mangel på diploide hanner efter 10 generationer af fuld-sib parring i laboratoriet f.eks. fravær af CSD locus11. Det er muligt at forudsige antallet af CSD loci fra forholdet mellem hanner produceret i indavl krydser6,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. feltet samling og vedligeholdelse af V. Emeryi kolonier i laboratoriet
Bemærk: Reder af V. emeryi er fundet i rådnende logs og faldne rådnende træ branchesin sekundære skove over hele Japan. Denne art viser to typer af kolonier, dvs., (1) kolonier producerer kun lang-vingede dronninger og (2) kolonier hovedsageligt producerer kort-vingede dronninger ud over lille antal long-vingede dronninger8,14. I denne protokol samlet vi den sidstnævnte type kolonier i Ishikawa Præfekturet, Japan.
- Indsamle V. emeryi kolonier i løbet af forsommeren.
Bemærk: For at opnå tilstrækkelig antal seksuelle individer i yngleperioden, kolonier indeholdende mere end 300 personer er foretrukket. - Overføre ant prøver fra de indsamlede grene til en kunstig gips reden med et glas dækning ved hjælp af en betjent sug (figur 2, venstre).
- Vedligeholde kolonier i kunstige reden ved 25 ° C under en 16:8 h lys/mørke cyklus. Give vand fra hanen med en vaskeflaske til våd gips.
- Tilføje omkring 100 mg af tørre cricket pulver pakket ind i alufolie og en brun farin vandfyldte tip (20 µL tip) hver anden dag indtil nye reproductives (F1 vingede-dronninger og F1 hanner) opstår.
2. forsøgslaboratorium krydser
Bemærk: Nye reproductives begynder at dukke op fra sensommeren til efteråret (figur 3). Long-vingede dronninger er produceret seksuelt, og kort-vingede dronninger er produceret alsidighed og har det maternelle genomet (figur 1). Brug long-vingede dronninger og hanner for indavl Kors.
- For at forhindre personer i at bevæge sig, skal du placere kolonier i konstant miljø værelse på 4 ° C i 15 min.
- Fjerne midten af benene af 30 arbejdstagere ved hjælp af pincet under en stereoskopisk mikroskop og overføre dem til nye mindre gips reden (figur 2, højre) for indavl Kors.
Bemærk: Benene er fjernet for at skelne de nuværende arbejdstagere fra de arbejdstagere, der vil blive produceret af den efterfølgende indavl krydser. - Tilføje 3-4 larver eller pupper i en gips rede indeholdende arbejdstagere.
Bemærk: Arbejdstagere viser sonderende aktivitet i F0 queens-mindre koloni. Larver eller pupper kan effektivt tiltrække disse arbejdstagere og nye reproductives i midten af kolonien under passage test. Som et resultat, holde betingelser af de eksperimentelle koloni tæt på det normale koloni. - Overføre en lang-vinget dronning og en mand i en gips reden forberedt i trin 2.3 for indavl Kors.
- Holde kolonier ved 25 ° C under en 16:8 h lys/mørke cyklus med mad og vand som beskrevet i punkt 1.3, indtil dronningen mister sine vinger og lægge æg.
Bemærk: Det tager en uge til en måned. - Kontrollere eksperimentelle koloni hverdagen under en stereoskopisk mikroskop. Efter udførelse af indavl krydser mellem F1 afkom, kan æg overholdes under en stereoskopisk mikroskop.
- Efter F1 queen begynder at lægge æg, fjerne F1 hanner og larver eller pupper tilføjede taktfast 2.3 fra reden for at undgå at blande F1 generation (hanner og hunner bruges til indavl Kors) og F2 generation (afkom fremstillet af indavl Kors).
Bemærk: Hvis der er nogle mænd i kolonien, det er muligt at inducere indavl krydser ved hjælp af én mand og 1 til 3 dronninger i den samme eksperimentelle koloni. - Holde kolonier under de samme conditionsas beskrevet i punkt 1.3, indtil F2 afkom opstår.
Bemærk: Overførsel F1 queen og F2 afkom til nye større gips reden (figur 2, venstre) for langsigtet kolonien holder.
3. evaluering af indavl succes
- DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse af forældrenes generation (F0)
- Fjerne det ene ben af en F0 dronning med pincet og overføre benet til en 1,5 mL microtube indeholdende 100 µL af Chelat agent.
- Under en stereoskopisk mikroskop, dissekere en kvindelige underliv i glasfad fyldt med 300 µL ultrarent vand med pincet og isolere de spermatheca, der indeholder sædceller fra skytterne hanner.
- Skræl væk væv af spermatheca og isolere sperm fra den kvindelige ved hjælp af insekt pins væv.
Bemærk: For at lette sperm udvinding fra spermatheca, gemme kvindelige prøver i 100% EtOH for mere end én dag før dissektion. - Med en mikropipette, overføre sæden til en 1,5 mL microtube indeholdende 100 µL af Chelat agent.
- Inkuber prøver af F0 dronning og sperms forberedt i trin 3.1.1 og 3.1.3, henholdsvis ved 95 ° C i 20 min. Flash centrifugeres microtube og opbevares ved 4 ° C.
- Genotype alle prøver ved hjælp af metoden beskrevet andetsteds4.
- DNA-ekstraktion fra par af myrer bruges til indavl krydser (F1)
- Efter bekræfter ægproduktion ved sib parret F1 queen, udtrække DNA af dronningen ved hjælp af hendes stald vinger eller en midten ben og genotype ved hjælp af samme metode beskrevet i afsnit 3.1 ovenfor.
- Uddrag DNA af F1 mand ved hjælp af et ben og genotype dem ved hjælp af samme metode beskrevet i afsnit 3.1 ovenfor.
Bemærk: Prøver kan opbevares i 100% EtOH før DNA-ekstraktion og DNA i kelation agent kan opbevares i to måneder ved 4 ° C.
- Evaluering af mandlige fertilitet hos mænd produceres fra indavl krydser
Bemærk: Diploide hanner fremstillet af indavl kors er ofte sterile.- Dissekere indre kønsorganer i en glasskål med 400 µL af PBS løsning med pincet.
- Fjern PBS og tilsæt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved hjælp af en mikropipette.
- Løse væv ved at inkubere i PFA i 30 min. ved stuetemperatur (15-25 ° C).
- Vask væv 5 gange med 400 µL af PBS ved hjælp af en mikropipette.
- Fortynd 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning til 1 µg/mL i PBS.
- Fjern PBS og tilsæt ca 300 µL af denne fortyndede DAPI Farvningsopløsningen til væv.
- Inkuber 15 min mørk betingelse ved stuetemperatur (15-25 ° C).
- Vaske væv 5 gange med 400 µL af PBS, og overføre væv på midten af diaset glas med pincet.
- Montere væv på montering medium indeholdende Tetramethylrhodamine TRITC-konjugeret phalloidin.
- Observere prøver af Konfokal laser scanning mikroskop ved hjælp af 20 X eller 63 X mål linser.
- Bruge en 405 nm excitation laser og en hybrid detektor på 410-530 nm for DAPI påvisning.
- Bruge en 561 nm excitation laser og en hybrid detektor på 565-650 nm til registrering af TRITC.
- Bruge en scanning hastighed på 400 Hz (400 linjer/s) med en opløsning på 1024 × 1024 pixel.
- Fange billeder ved hjælp af en softwareplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microsatellite analyse ved hjælp af F0 og F1 generationer viste, at indavl Kors blev produceret med succes (figur 4)6. Som et resultat af indavl Kors, blev skytterne queens indhentet inden en måned efter oprettelse af eksperimentelle passage kolonier. En fjerdedel (27,1 ± 8.91% SD) af alle afkom (F2) fra indavl Kors var mandlige, mens resten var kvinde (arbejdstagere og en dronning)6. QTL kortlægning ved hjælp af afkom fra indavl Kors viste, at mænd produceret af indavl Kors var diploide og homozygot på to CSD loci (CSD1 og CSD2 i figur 5), mens hunnerne (arbejdstagere) fremstillet af indavl Kors var diploide og heterozygous på mindst én CSD locus6.
Dissektion af haploide hanner afsløret testiklerne og sædceller, som forventede (figur 6A-6 C). Men, i diploide hanner, sperms blev aldrig observeret, tyder på, at hanner produceret i indavl kors er sterile i V. emeryi6. Derudover undladt testiklerne diploide hanner at udvikle (figur 6D-6E).
Figur 1 . Typiske reproduktive system i a hvepse og den atypiske reproduktive system med androgenesis og gynogenesis i (B) V. emeryi. Typisk kvinder (arbejdere og dronninger) udvikle fra befrugtede diploide æg, og hannerne udvikle fra ubefrugtede haploide æg indeholder halvdelen af maternel genomet (A). I V. emeryiudvikler sterile arbejdstagere og et par lange-vingede dronninger (LWQ) fra befrugtede diploide æg, mens kort-vingede dronninger (SWQ) udvikler med næsten komplet maternel genomer fra ubefrugtede diploide æg (gynogenesis). Mænd arve aldrig maternel genomer men er kloner af deres fædre (androgenesis) (B). Dette tal er blevet ændret fra [Miyakawa et al. 2018]7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksperimentelle oprettet af V. emeryi kolonier. Efter feltsamlingen, kolonier overføres til en kunstig gips reden og holdt i laboratoriet. Store gips reden (til venstre) er forberedt til opretholde indsamlede kolonier, mens et mindre gips reden (til højre) er villig til eksperimentelle indavl Kors. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Nye V. emeryi reproductives dukke op i yngleperioden. Modne og well-fedcolonies tendens til at producere lange-vingede dronninger (LWQ) med forældrenes genomet ud over kort-vingede dronninger (SWQ), der bærer kun maternel genomet (figur 1B). Foto høflighed af Mr. Taku Shimada. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Design af indavl Kors og microsatellite genotyper af F0 og F1 generationer. Ved hjælp af 11 microsatellite markører udviklet i tidligere undersøgelser6,8,9, hunner og hanner af forældrenes generation (F0) viste forskellige genotyper. Genotyper af hunner og hanner bruges til eksperimentelle Kors (F1) arvet forældreorlov og faderlige genotyper, henholdsvis, der angiver, at hunnerne var krydset med succes med deres brødre, som hunnerne delt halvdelen deres genomer. Tallene angiver længder af PCR produkter til microsatellite locus L-5, som er en af de markører, der anvendes til genotypebestemmelse6,8,9,10. Dette tal er blevet illustreret ifølge data fra [Miyakawa og Mikheyev 2015]6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Allel mønstre af to CSD loci (CSD1 og CSD2) i afkom produceret af indavl Kors. Andelen af diploide hanner (ca. 25%) og QTL kortlægning ved hjælp af afkom af sib-parret queens antyder eksistensen af to CSD loci i V. emeryi. Hunnerne er heterozygous i mindst én af de to CSD loci hanner er homozygote for alle loci. Genotyper repræsenteres af bogstaverne i alfabetet. Dette tal er blevet ændret fra [Miyakawa et al. 2018]7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Mandlige indre kønsorganer af androgen haploide og diploide hanner i V. emeryi. Morfologier af testiklerne og andre indre kønsorganer dissekeret ud fra androgenetic haploide hanner (A). Sæd (fibrøst væv) kunne ses i testiklerne haploide hanner (B og C). Blå farve markerer cellekerner farves af DAPI, og røde farve markerer F-actin plettet af Tetramethylrhodamine TRITC-konjugeret phalloidin i B, C og E. (a) tilbehør kirtler; (t) testiklerne; (v) sædlederen; (g) ydre kønsorganer. Morfologier af indre kønsorganer dissekeret ud fra de diploide hanner (D). Testiklerne og sperm af diploide mænd blev aldrig observeret (D og E, N >> 30). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel viser protokoller, der kan bruges til at fremkalde indavl Kors og evaluere forekomsten af indavl i ant V. emeryi. I forsøgene er genotypebestemmelse af individer bruges til Kors nødvendige for at sikre, at indavl krydser var vellykket. Men effektiviteten af disse passage tests er klart som diploide hanner kan produceres hele året, mens haploide hanner kan kun produceres i efteråret i både feltet og laboratorium6. Sib-parret queens begynde at producere mandlige afkom umiddelbart efter passage. Ingen morfologiske fænotypiske forskelle blev observeret mellem diploide og haploide hanner i V. emeryi6,7. Dog undlader diploide mandlige V. emeryi næsten altid at udvikle testiklerne. I mangel af genetiske markører for at teste den genetiske slægtskab Pairs bruges til passage af de prøver, kan den reproduktive potentiale af mandlige afkom bruges til at udlede om indavl er opstået. Dog skal det bemærkes, at hannerne produceret i indavl Kors ikke er altid sterile i andre hymenopteran arter15,16,17.
Den første afgørende skridt i succes i protokollen er vedligeholdelse af velnærede kolonier, som fodre dem efter feltet samling vil øge sandsynligheden for at opnå tilstrækkelig antal reproductives for Kors. I V. emeryi, er blevet rapporteret en positiv korrelation mellem ernæring og produktion af lange-vingede dronninger, som er queens bruges til indavl krydser10. I sociale insekter, små kolonier eller kolonier i dårligt helbred, har tendens til ikke at producere ny reproductives18. Det er derfor vigtigt at indsamle modne kolonier fra feltet og at forsyne dem med tilstrækkelige mængder af nærende mad for eksperimenter ved hjælp af nye reproductives.
Det andet vigtige skridt er at holde arbejdstagere, reproduktiv og få larver eller pupper sammen under prøverne, passage og bevare den eksperimentelle passage koloni på den samme stat som en normal koloni indtil passage er afsluttet (for en uge til en måned). Det er vanskeligt at opretholde kolonier, der skal anvendes til passage tests uden arbejdstagere i mere end 3 dage, fordi mænd er i stand til at brødføde sig selv og skal fodres af arbejdstagere. Under sådanne unaturlige forhold var succesraten for indavl Kors ekstremt lave6.
Der er to begrænsninger med hensyn til anvendelsen af disse protokoller til andre myre arter. Først, stikord for inducerende kors er artsspecifikke. Det er relativt let at fremkalde laboratorium Kors i V. emeryi siden intra-koloni parring uden flight forekommer i naturen. Mange myre arter har dog udviklet sig parring ritualer, der involverer vielsesceremoni flyvninger under hvilke nye dronninger og hanner mate, under eller efter flyvningen19. Det er derfor vigtigt at belyse de udløsere, der inducerer passage i hver arter i et laboratorium indstilling. For eksempel, i den parasitære ant Acromyrmex ameliaesynes den største stimulus for at udløse vielsesceremoni fly at være lys20. Den anden begrænsning er i nogle tilfælde, diploide hannerne produceret af indavl Kors kan ikke indsamles, da de er inviable eller dræbt af arbejdstagere, fordi de ikke arbejde eller har ingen eller lav reproduktive potentiale, og er dermed en større omkostninger til kolonien af den objektive arter21,22,23. Heldigvis diploide V. emeryi hanner er ikke dræbt af arbejdstagere og de bor indtil de dør naturligt, hvilket tyder på, at de ikke er ofte stødt i naturen og en strategi til at udelukke diploide hanner fra kolonier har ikke udviklet sig i denne art.
Sammenlignet med andre myre arter, der beskæftiger arrhenotokous partenogenese til reproducere (fig. 1A), kan vi antage, at der er visse fordele ved at producere eksperimentelle indavl Kors med V. emeryi ved androgenesis som den indavl kors er genetisk svarende til en klassisk backcross. Ja, systemet har aktiveret os til at designe eksperimenter for at undersøge de sex-bestemmelse gener, molekylære mekanismer, og udføre funktionelle studier i denne arter6,7.
I Resumé, metoder til at gennemføre indavl krydser og for at evaluere effekten af den resulterende kors er blevet beskrevet i V. emeryi. Disse protokoller er afgørende for eksperimenter instrueret til at forstå den genetiske og molekylære grundlag af sex bestemmelse systemer i hvepse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mr. Taku Shimada, delegeret fra AntRoom, Tokyo, Japan, for at forsyne os med hans fotografi af V. emeryi reproductives. Dette projekt blev finansieret af Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) Research Fellowship for unge forskere (16J00011), og Grant i støtte til unge forskere (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
