Summary
В этом протоколе описаны методы для проведения инбридинга кресты и для оценки успеха этих крестов, для муравей Vollenhovia emeryi. Эти протоколы являются важными для экспериментов, направленных на понимание генетическую основу системы определения пола в перепончатокрылые.
Abstract
Генетические и молекулярные компоненты определения пола Каскад активно изучались в пчелы Apis mellifera, организм hymenopteran модель. Однако мало что известно о механизмах определения пола, в других-модель hymenopteran таксонов, как муравьи. Из-за сложного характера жизненные циклы, которые развивались в hymenopteran видов трудно поддерживать и проводить экспериментальные кресты между этими организмами в лаборатории. Здесь мы описываем методы для проведения инбридинга кресты и для оценки успеха этих кресты в муравей Vollenhovia emeryi. Вызывая инбридинга в лаборатории с использованием V. emeryi, является относительно простым из-за уникальной биологии видов. Конкретно этот вид производит андрогенетическое мужчины, и женский самцами экспонат крыло полиморфизма, который упрощает выявление фенотипы в генетических кресты. Кроме того оценки успеха инбридинга проста, как мужчины могут производиться непрерывно инбридинг кресты, в то время как самцы появляются только в четко определенных репродуктивного сезон в поле. Наш протокол допускает использование V. emeryi как модель для изучения генетические и молекулярные основы системы определения пола в муравьи.
Introduction
Hymenopteran эусоциальных таксонам, как муравьи и пчелы, развивались системы определения пола haplodiploid, в котором люди, которые являются гетерозиготных на один или несколько дополнительных секс определение локусов (КУР) становятся женщины, в то время как те, которые являются гомо - или hemizygous стать мужчины (рис. 1A)1.
Генетические и молекулярные компоненты, участвующие в секс решимость каскадных хорошо изучены в пчелы Apis mellifera,3,2,hymenopteran модели организма4. Недавние исследования в области сравнительной геномики показывают, что муравьи и пчелы разделяют многие предполагаемые гомолог в секс определение пути, такие как первоначальный секс определение гена, кур5. Однако доказательства для функциональных сохранения этих гомолог по-прежнему отсутствует в муравьях.
Для решения этой проблемы, инбридинга линии должны разрабатываться как они имеют важное значение для картирования генетических и молекулярных исследований. Однако это трудно поддерживать и проводить экспериментальные кресты между этими организмами в лаборатории из-за сложного характера жизненные циклы, которые эволюционировали.
Здесь мы используем Vollenhovia emeryi как модель для изучения генетические и молекулярные основы системы определения пола в муравьи6,7. Инбридинг линии этого вида были разработаны ранее для сопоставления связь локусов количественных признаков (QTL) для черты, связанные с определением секс в первый раз в муравьи6. Кроме того Каскад молекулярных определение пола была исследованы7. Этот вид развивалась необычные репродуктивной системы, которая использует гиногенез и андрогенез (рис. 1Б)8,9. Большинство новых Королев и мужчины клонально изготавливаются из материнской и отцовской геномов, соответственно. Кроме того, работники и некоторые Королев производятся сексуально8. Эта система воспроизводства особенно хорошо подходит для генетических исследований, потому что инбридинг кресты, вырабатываемый сексуально производится Квинс и мужчины генетически эквивалентна классической backcross. Так как сексуально производимых Квинс морфологически отличаются от Квинс, производится из материнской геномов10 (рис. 1Б), проведения и оценки инбридинга кресты значительно упрощается с помощью этого метода.
В этой статье, методы для создания лаборатории колоний для пересечения теста, применение инбридинга пересекает используя полный СИБ пар и оценки успеха эти кресты, используя генотипирования членов колонии и рассечение мужского потомства гениталии описаны в V. emeryi.
Независимо от репродуктивной системы используемых применение инбридинг кресты часто является важным первым шагом в любом расследовании секс определение систем в перепончатокрылые. Например, в Cardiocondyla obscurior, почти полное отсутствие диплоидных мужчины после 10 поколений полный СИБ спаривания в лабораторных условиях демонстрирует отсутствие кур Локус11. Это позволяет предсказать количество локусов кур от соотношение самцов, производимых в инбридинга кресты6,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. полевой сбор и ведение V. Emeryi колоний в лаборатории
Примечание: Гнезда V. emeryi находятся в загнивание бревен и упал распадаясь дерево branchesin вторичных лесов по всей Японии. Этот вид показывает два вида колоний, т.е. (1) колонии производит только Лонг крылатый Королев и (2) колонии, главным образом производить короткие крылатый Королев в дополнение к небольшое количество Лонг крылатый Квинс8,14. В этом протоколе мы собрали последний тип колоний в префектуре Исикава, Япония.
- Соберите V. emeryi колонии в начале лета.
Примечание: Для получения достаточного числа сексуальных людей в течение сезона репродуктивного, колоний, содержащий более чем 300 человек являются предпочтительными. - Передача образцов муравей из собранных филиалов искусственный гипс гнездо с стеклянной крышкой с помощью аспиратор (рис. 2, слева).
- Поддерживать колоний в искусственных гнезд при 25 ° C под 16:8 h свет/темно цикла. Обеспечивают водопроводной воды с бутылкой мыть для мокрой штукатурки.
- Добавьте около 100 мг порошка сухого крикет, завернутые в алюминиевой фольги и коричневый сахар водой наконечник (20 мкл наконечник) каждый день до тех пор, пока возникают новые самцами (F1 крылатый Королев и F1 мужчины).
2. Экспериментальная лаборатория кресты
Примечание: Новые самцами начинают появляться с конца лета до осени (рис. 3). Лонг крылатый Квинс производятся сексуально, и короткий крылатый Королев производятся клонально и материнской генома (рис. 1). Используйте длинные крылатый Королев и мужчины для инбридинг кресты.
- Чтобы остановить людей от переезда, место колоний в комнате постоянной среде при температуре 4 ° C на 15 мин.
- Удаление середине ноги 30 работников, используя пинцет под стереоскопическим микроскопом и передавать их в новые меньше гнездо штукатурки (рис. 2, право) для инбридинг кресты.
Примечание: Ноги удаляются, чтобы отличить настоящий работников от работников, которые будут производиться путем последующего инбридинга кресты. - Добавьте 3-4 Личинки и куколки в гнездо штукатурка содержащая работников.
Примечание: Рабочие Показать разведочной деятельности в колонии Королев менее0 F. Личинки и куколки могут эффективно привлекают эти рабочие и новых самцами в центре колонии во время пересечения теста. В результате сохранить условия экспериментальной колонии недалеко от обычной колонии. - Передача Лонг крылатый Королева и мужчина в гнездо Штукатурка подготовлена на шаге 2.3 для инбридинг кресты.
- Держите колонии при 25 ° C под свет/темно цикла 16:8 h с пищей и водой, как описано в 1.3 до королевы потерять ее крылья и откладывают яйца.
Примечание: Это занимает одну неделю до месяца. - Проверьте ежедневно экспериментальной колонии под стереоскопическим микроскопом. После выполнения инбридинга пересекает между F1 потомство, яйца можно наблюдать под стереоскопическим микроскопом.
- После F1 Королева начинает откладывать яйца, удалить F1 мужчины и личинки или куколок, добавленной на шаге 2.3 из гнезда, чтобы избежать смешивания1 поколения F (мужчины и женщины, используемых для инбридинга кресты) и F2 поколения (потомство производится из инбридинга кресты).
Примечание: Если существует несколько мужчин в колонии, его можно вызвать инбридинга кресты, используя один кобель и 1 – 3 Королев в том же экспериментальной колонии. - Держите колоний под же conditionsas описано в 1.3, до тех пор, пока возникают F2 потомство.
Примечание: Королева1 передачи F и F2 потомство в новых крупных гнездо штукатурки (рис. 2, слева) для долгосрочного поддержания колонии.
3. Оценка инбридинга успеха
- Экстракции ДНК и генотипирования родительского поколения (F0)
- Удалить одну ногу Королева0 F, с помощью щипцов и передача ногу на 1,5 мл микропробирок, содержащей 100 мкл комплексообразования агента.
- Под стереоскопическим микроскопом вскрыть Женский живот в стеклянную посуду, заполнены с 300 мкл ультрачистая вода с помощью щипцов и изолировать сперматека, содержащие сперму с растяжением мужчины.
- Удаляйте ткани сперматека и изолировать спермы из ткани самка с помощью насекомых булавки.
Примечание: Для облегчения извлечения спермы от сперматека, магазин женских особей в 100% EtOH для более чем за один день до вскрытия. - С помощью микропипеткой, передача спермы в 1,5 мл микропробирок, содержащей 100 мкл комплексообразования агента.
- Проинкубируйте образцы F0 Королева и сперматозоиды, подготовленную на этапе 3.1.1 и 3.1.3, соответственно, на 95 ° C в течение 20 мин Flash центрифуга Микропробирка и хранить при 4 ° C.
- Генотип, все образцы с использованием метода описано в других разделах4.
- Экстракции ДНК из пары муравьев, используемых для инбридинга кресты (F1)
- После того, как подтверждающие производство яиц, sib повязана F1 королевы, извлечь ДНК королевы, используя ее крылья сарай или середине ноги и генотип же методом, описанным в разделе 3.1 выше.
- Извлечь ДНК F1 самец, используя одну ногу и генотип их с помощью же методом, описанным в разделе 3.1 выше.
Примечание: Образцы могут быть сохранены в 100% EtOH до экстракции ДНК и ДНК в комплексообразования агент может храниться на два месяца при 4 ° C.
- Оценки от мужской фертильности у самцов производится из инбридинг кресты
Примечание: Диплоидный производится из инбридинга кресты самцы часто стерильные.- Вскрыть внутренних половых органов в стеклянную посуду с 400 мкл раствора PBS с помощью щипцов.
- Удаление PBS и добавить 4% параформальдегида (PFA) с помощью микропипеткой.
- Исправьте ткани, инкубации в PFA для 30 мин при комнатной температуре (15-25 ° C).
- Вымойте ткань 5 раз с 400 мкл PBS с помощью микропипеткой.
- Разбавьте 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) решения 1 мкг/мл в PBS.
- Удаление PBS и добавить примерно 300 мкл этой разбавленный раствор DAPI окрашивания тканей.
- Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре (15-25 ° C) в темных условиях.
- Вымойте ткань 5 раз с 400 мкл PBS и передачи ткани на центр слайд стекла с помощью щипцов.
- Монтировать ткани на монтаж среднего содержащие Фаллоидин конъюгированных тетраметилродамина TRITC.
- Наблюдать за образцы лазером конфокальный сканирующий микроскоп 20 X или 63 X объективов.
- Используйте 405 нм лазер возбуждения и гибридные детектор 410-530 Нм для обнаружения DAPI.
- Используйте 561 Нм лазер возбуждения и гибридные детектор на 565-650 Нм для обнаружения TRITC.
- Использовать скорость сканирования 400 Гц (400 линий/сек) с разрешением 1024 × 1024 пикселей.
- Захват изображения с помощью программного обеспечения платформы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты анализа микроспутник с использованием F0 и поколения1 F показал, что инбридинг кресты были произведены успешно (рис. 4)6. В результате инбридинга кресты, сочлененного queens были получены в течение одного месяца с момента создания экспериментальных пересечения колоний. Четверть (27,1% 8,91 SD ±) все потомство (F-2) от инбридинга кресты был мужчина, в то время как остальная была девушки (рабочие и королева)6. QTL картирования с использованием потомство от инбридинга кресты показали, что мужчины получают путем инбридинга кресты были диплоидных и гомозиготных на двух кур локусов (CSD1 и CSD2 на рис. 5), то время как самки (работники) производится из инбридинг кресты были диплоидных и гетерозиготных по крайней мере на одном локусе кур6.
Рассечение гаплоидным самцов показали яичек и спермы, как ожидается (рис. 6A-6 C). Однако в диплоидных мужчины, сперматозоиды никогда не наблюдались, предполагая, что мужчины в инбридинг кресты стерильных V. emeryi6. Кроме того яички диплоидных мужчин удалось разработать (рис. 6 d-6E).
Рисунок 1 . Типичный репродуктивной системы в (A) насекомые и атипичные репродуктивной системы с участием андрогенез и гиногенез в (B) V. emeryi. Как правило женщины (рабочие и Королев) развиваются из оплодотворенные яйцеклетки диплоидный, и мужчины развиваются из неоплодотворенных яиц гаплоидным, содержащий половину материнской генома (A). В V. emeryiстерильные рабочие и несколько Лонг крылатый Королев (удар) развиваются из оплодотворенные яйцеклетки диплоидный, а короткие крылатый Королев (SWQ) развиваются с почти полной материнской геномов из неоплодотворенных яиц диплоидных (гиногенез). Мужчины никогда не наследуют материнской геномов, но являются клонами своих отцов (андрогенез) (B). Эта цифра была изменена с [Миякава et al. 2018]7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Экспериментальная установка колоний V. emeryi . После коллекции полей колонии передаются в гнездо искусственный гипс и хранятся в лаборатории. Гнездо большой штукатурки (слева) готовится для сохранения собранных колоний, в то время как меньшие штукатурки гнездо (справа) готовится для экспериментальных инбридинга кресты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Новый V. emeryi самцами возникают в течение сезона репродуктивного. Зрелые и хорошо fedcolonies имеют тенденцию производить Лонг крылатый Королев (удар) с геном родителей в дополнение к короткий крылатый Королев (SWQ), которые несут только материнской генома (рис. 1Б). Фото любезно предоставлено Taku Shimada г-н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Дизайн инбридинга кресты и микроспутника генотипов F0 и поколения F1 . Используя 11 микроспутник маркеры разработан в предыдущих исследованиях6,8,9, самки и самцы родительского поколения (F0) показал различных генотипов. Генотипов самок и самцов используемые для экспериментальных кресты (F1) унаследовал родителей и отцовской генотипов, соответственно, указав, что женщины были успешно пересекли с их братьями, с которыми женщины совместно, половина их геномы. Цифры указывают длину продуктов ПЦР в микроспутника локусе L-5, который является одним из маркеров, используемых для генотипирования6,8,9,10. Эта цифра была показана по данным [Миякава и Михеева 2015]6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Аллель модели двух локусов кур (CSD1 и CSD2) в потомство производимые инбридинг кресты. Доля диплоидных мужчин (около 25%) и QTL картирования с использованием потомство, производимые СИБ спаренных Квинс предполагают существование двух локусов кур в V. emeryi. Самки гетерозиготных в по крайней мере один из двух локусов кур, тогда как мужчины гомозиготных на всех локусов. Генотипов обозначаются буквами алфавита. Эта цифра была изменена с [Миякава et al. 2018]7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Мужчины внутренних половых органов андрогенетическое гаплоидным и диплоидных мужчин в V. emeryi. Морфологии семенников и других внутренних половых органов расчлененный от андрогенетической гаплоидным мужчины (A). Спермы (фиброзной ткани) может рассматриваться в яичках гаплоидным мужчин (B и C). Синий цвет знаменует запятнана DAPI ядер, и красный цвет знаков F-актина запятнана конъюгированных TRITC тетраметилродамина Фаллоидин в B, C и E. () аксессуар желез; (t) яичек; (v) семяпроводов; (g) внешние гениталии. Морфологии внутренних половых органов расчлененный от диплоидных мужчины (D). Яички и спермы диплоидных мужчины никогда не наблюдалось (D и E, N >> 30). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья демонстрирует протоколы, которые могут использоваться для побудить инбридинга кресты и оценить появление инбридинга в муравьев V. emeryi. В экспериментах Генотипирование лиц, используемых для кроссов необходимо обеспечить, что инбридинг кресты были успешными. Однако эффективность этих тестов пересечения очевидна, как диплоидных мужчины могут быть произведены в течение года, в то время как гаплоидным мужчины могут производиться только осенью в полевых и лабораторных6. СИБ спаренных Квинс начинают производить мужского потомства сразу после пересечения границы. Нет морфологических фенотипические различия наблюдались между диплоидных и гаплоидным мужчины в V. emeryi6,7. Однако диплоидный мужской V. emeryi почти всегда не развивать яичек. В случае отсутствия генетических маркеров для тестирования генетическое родство пар используется для пересечения испытаний репродуктивный потенциал мужского потомства может использоваться для определения, произошло ли инбридинга. Следует, однако, отметить, что мужчины в инбридинг кресты не всегда являются стерильными в других видов hymenopteran15,16,17.
Первым важным шагом в обеспечении успеха протокола является поддержание сытых колоний, как кормить их, после того, как коллекция полей увеличит вероятность получения достаточного количества самцами за кресты. В V. emeryiбыло сообщено положительная корреляция между питанием и производства Лонг крылатый Королев, которые являются Королев, используемые для инбридинга кресты10. В общественных насекомых, небольшими колониями или колоний в плохое состояние здоровья как правило, не производить новые самцами18. Поэтому важно собрать Зрелые колоний от поля и предоставить им достаточное количество питательной пищи для экспериментов с использованием новых самцами.
Вторым важным шагом является держать работников, репродуктивные и несколько личинок или куколок вместе во время пересечения испытаний и поддерживать экспериментальные пересечения колонии в том же состоянии, что и обычный колонии до завершения перехода (за неделю до одного месяца). Трудно поддерживать колоний, которые должны использоваться для пересечения тестов без рабочих для более чем 3 дней потому, что мужчины не могут прокормить себя и должны подаваться работниками. В таких неестественных условиях показатель успеха инбридинга кресты был крайне низкой6.
Есть два ограничения в отношении применения этих протоколов в других видов муравьев. Во-первых подсказки для стимулирования кресты являются конкретные виды. Это сравнительно легко побудить Лаборатория кресты в V. emeryi после спаривания интра колонии без полет происходит в природе. Однако многие виды муравьёв развивались брачные ритуалы, которые включают брачных полетов в течение которого новые Королев и мужчины мат, во время или после полета19. Поэтому важно пролить свет триггеры, которые вызывают пропуска в каждого вида в лабораторных условиях. Например в паразитарные муравей царицами ameliae, главным стимулом для инициирования брачных полетов видимому света20. Второй недостаток-это, в некоторых случаях, диплоидный мужчины, получают путем инбридинга кресты не могут быть собраны как они являются нежизнеспособными или убит работников, потому что они не работают или не имеют или низкий репродуктивный потенциал, и, таким образом, основные затраты в колонию объективных видов21,22,23. К счастью диплоидный V. emeryi мужчины не убили работников, и они живут до тех пор, пока они умирают естественным образом, который предполагает, что они не часто встречаются в природе и стратегию для исключения диплоидных мужчины из колоний не развивалась в этот вид.
По сравнению с других видов муравьев, которые используют arrhenotokous партеногенеза воспроизвести (рис. 1A), мы можем предположить, что есть определенные преимущества для производства экспериментальной инбридинга кресты с помощью V. emeryi , андрогенез как инбридинг кресты генетически эквивалентны классический backcross. Действительно система позволила нам разработать эксперименты для расследования определение пола генов, молекулярные механизмы и выполнять функциональные исследования в этом видов6,7.
В целом методы проведения инбридинга пересекает и оценивать успех в результате кресты были описаны в V. emeryi. Эти протоколы являются важным для экспериментов, направленных на понимание генетические и молекулярные основы системы определения пола в перепончатокрылые.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-н Taku Симада, делегат AntRoom, Токио, Япония, за предоставление нам с его фотографией V. emeryi самцами. Этот проект финансировался японского общества для поощрения науки (JSP) исследовательских стипендий для молодых ученых (16J00011) и предоставление помощи для молодых ученых (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
