Summary
In diesem Protokoll werden Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und zur Beurteilung des Erfolgs eines dieser Kreuze, die Ameise Vollenhovia Emeryibeschrieben. Diese Protokolle sind wichtig für Experimente zur Verständnis der genetischen Grundlagen von Geschlecht Bestimmung Systeme in Hymenoptera.
Abstract
Die genetischen und molekularen Komponenten der Geschlechtsbestimmung Kaskade haben ausgiebig in die Honigbiene, Apis Mellifera, hymenopteran Modellorganismus untersucht. Jedoch ist wenig bekannt über die Bestimmung des Geschlechts Mechanismen in anderen nicht-Modell hymenopteran Taxa, wie Ameisen gefunden. Aufgrund der Komplexität der Lebenszyklen, die in hymenopteran Spezies entwickelt haben, ist es schwer zu warten und experimentelle Kreuzungen zwischen diesen Organismen im Labor durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und für die Beurteilung des Erfolgs eines diese Kreuze in Ant Vollenhovia Emeryi. Inzucht im Labor mit V. Emeryiinduzieren, ist relativ einfach, wegen der einzigartigen Biologie der Arten. Insbesondere dieser Art produziert androgenetischen männlichen und weiblichen geschlüpften ausstellen Flügel Polymorphismus, die Identifikation der Phänotypen im genetischen Kreuze vereinfacht. Darüber hinaus ist die Bewertung des Erfolgs der Inzucht einfach, Männchen kontinuierlich hergestellt werden können, durch Inzucht Kreuze, während normale Männchen nur während einer genau definierten Paarungszeit im Feld angezeigt. Unser Protokoll ermöglichen den Einsatz V. Emeryi als Modell der genetischen und Molekulare Grundlagen der Sex-Bestimmung-System in Ameisenarten zu untersuchen.
Introduction
Eusozialen Hautflügler Taxa, wie Ameisen und Bienen, haben eine diploide geschlechtermittlung System entwickelt, bei denen Personen, die an einem oder mehreren komplementären Geschlechtsbestimmung heterozygot sind (CSD) Loci Weibchen, während diejenigen geworden, die Homo- oder Hemizygous sind werden Sie Männchen (Abb. 1A)1.
Genetischen und molekulare Komponenten der Geschlecht-Bestimmung-Kaskade beteiligt sind gut in die Honigbiene, Apis Mellifera, ein hymenopteran Modell Organismus2,3,4untersucht worden. Vergleichende Genomik Untersuchungen deuten darauf hin, dass Ameisen und Bienen viele vermeintliche homologe in dem Geschlecht Bestimmung Weg, wie das erste Geschlecht Bestimmung gen, Csd5teilen. Beweise für die funktionelle Erhaltung dieser Homologen fehlt allerdings noch bei Ameisen.
Um dieses Problem zu beheben, Inzucht-Linien müssen entwickelt werden, da sie wichtig für genetische und molekulare Studien sind. Es ist jedoch schwer zu warten und Durchführung von experimentellen Kreuzungen zwischen diesen Organismen im Labor aufgrund der Komplexität der Lebenszyklen, die entwickelt haben.
Hier verwenden wir Vollenhovia Emeryi als Modell um zu untersuchen, die genetischen und Molekulare Grundlagen der Sex-Bestimmung-System in Ameisen6,7. Die Inzucht-Linien dieser Art wurden bisher für Verknüpfung Zuordnung der quantitative Trait Loci (QTL) für Züge, die im Zusammenhang mit Geschlechtsbestimmung zum ersten Mal in Ameisen6entwickelt. Darüber hinaus wurde die molekulare Geschlechtsbestimmung Kaskade untersuchten7. Diese Sorte hat eine ungewöhnliche Reproduktionssystems entwickelt, die Gynogenesis und Androgenese (Abbildung 1B)8,9beschäftigt. Die meisten neuen Königinnen und Männchen klonal aus der mütterlichen und väterlichen Genome, bzw. entstehen. Darüber hinaus sind Arbeitnehmer und einige Königinnen sexuell produziert8. Diese Reproduktion-System ist besonders gut geeignet für genetische Studien, weil die Inzucht Kreuze mit sexuell hergestellt Königinnen produziert und Männchen eine klassische Rückkreuzung genetisch entspricht sind. Da sich sexuell erzeugte Königinnen morphologisch von Königinnen produziert von mütterlichen Genome10 (Abbildung 1B), wird Durchführung und Auswertung von Inzucht Kreuze stark vereinfacht mit dieser Methode.
In diesem Artikel, die Methoden für die Einrichtung von Labor Kolonien für Kreuzung Test kreuzt Anwendung von Inzucht mit voll-Sib Paare und Bewertung des Erfolgs der diese Kreuze mit Genotypisierung der Kolonie Mitglieder und sezieren von männlichen Nachkommen Genitalien sind in V. Emeryibeschrieben.
Unabhängig von der Reproduktion System beschäftigt ist die Anwendung von Inzucht Kreuze oft wichtiger erster Schritt in jeder Untersuchung Sex Bestimmung Systeme in der Hautflügler. Zum Beispiel zeigt das fast völlige Fehlen von diploiden Männchen nach 10 Generationen von voll-Sib Paarung im Labor in Cardiocondyla Obscurior, Abwesenheit von CSD Locus11. Es ist möglich, die Anzahl der CSD Loci aus dem Verhältnis der Männer in Inzucht Kreuze6,12,13produziert Vorhersagen.
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Protocol
1. Feld Erfassung und Pflege der V. Emeryi Kolonien im Labor
Hinweis: Nester der V. Emeryi findet man in faulenden Baumstämmen und gefallenen verfallenden Baum Branchesin sekundären Wäldern in ganz Japan. Diese Sorte zeigt zwei Arten von Kolonien, d. h. (1) Kolonien produzieren nur Long-winged Königinnen und (2) Kolonien produziert vor allem kurze geflügelten Königinnen neben kleinen Anzahl von langen geflügelten Königinnen8,14. In diesem Protokoll sammelten wir die letztere Art von Kolonien in der Präfektur Ishikawa, Japan.
- V. Emeryi Kolonien im frühen Sommer zu sammeln.
Hinweis: Um während der Paarungszeit sexuellen Einzelpersonen in ausreichender Zahl zu erhalten, sind Kolonien mit mehr als 300 Personen bevorzugt. - Übertragen Sie die Ameise Exemplare von gesammelte Äste auf eine künstliche Gips-Nest mit einer Glasabdeckung über eine Absauganlage (Abbildung 2, Links).
- Kolonien in das künstliche Nest bei 25 ° C unter einer 16:8 h Hell/Dunkel-Zyklus zu erhalten. Bieten Sie Leitungswasser mit einer Waschflasche zu Gips nass.
- Fügen Sie ca. 100 mg trocken Cricket Pulver eingewickelt in Alufolie und ein brauner Zucker Wasser gefüllten Tipp (20 µL Tip) jeden zweiten Tag bis neue geschlüpften (F1 geflügelte-Queens und F1 Männchen) entstehen.
2. Versuchslabor Kreuze
Hinweis: Neue geschlüpften beginnen sich vom Spätsommer bis Herbst (Abbildung 3). Lange-winged Königinnen sind sexuell produziert, und kurz-winged Königinnen werden klonal hergestellt und haben das mütterliche Genom (Abbildung 1). Verwenden Sie lange geflügelte Königinnen und Männchen für Inzucht Kreuze.
- Um Personen aus bewegen zu stoppen, legen Sie Kolonien in einem konstanten Umwelt Raum bei 4 ° C für 15 Minuten.
- Mitte der Beine 30 Arbeiter mit Pinzette stereoskopische Mikroskop zu entfernen und in neue kleinere Putz Nest (Abbildung 2, rechts) für Inzucht Kreuze überführen.
Hinweis: Die Beine werden entfernt, um die heutigen Arbeitnehmer von den Arbeitern zu unterscheiden, die durch die anschließende Inzucht Kreuze produziert wird. - Fügen Sie ca. 3-4 Larven oder Puppen in ein Gips-Nest mit Arbeiter.
Hinweis: Arbeitnehmer zeigen exploratorische Aktivität in F0 Königinnen-weniger Kolonie. Larven oder Puppen können effektiv diese Arbeitnehmer und neue geschlüpften in der Mitte der Kolonie während der Überfahrt Test ziehen. Infolgedessen halten der experimentellen Kolonie in der Nähe der normalen Kolonie. - Übertragen Sie eine Königin mit langen Flügeln und einem Mann in ein Gips-Nest in Schritt 2.3 für Inzucht Kreuze vorbereitet.
- Halten Sie Kolonien bei 25 ° C unter ein 16:8 h-Hell/Dunkel-Zyklus mit Nahrung und Wasser versorgt werden, wie unter 1.3, bis die Königin ihre Flügel verlieren und legen ihre Eier.
Hinweis: Dies dauert eine Woche bis zu einem Monat. - Überprüfen Sie jeden Tag das experimentelle Kolonie unter dem stereoskopische Mikroskop. Nach Durchführung von Inzucht zwischen der F-1 -Nachwuchs kreuzt, können Eier unter dem stereoskopische Mikroskop beobachtet werden.
- Nach der F1 Königin beginnt der Eiablage, F1 Männchen und Larven oder Puppen aus dem Nest in Schritt 2.3 hinzugefügt, um zu vermeiden, Mischen von F-1 Generation (Männchen und Weibchen für Inzucht Kreuze verwendet) und die F-2 -Generation (Nachkommen zu entfernen hergestellt aus Inzucht Kreuze).
Hinweis: Wenn in der Kolonie gibt es wenige Männer, ist es möglich, Inzucht Kreuze mit einem Männchen und 1 bis 3 Königinnen in der gleichen experimentellen Kolonie zu induzieren. - Halten Sie Kolonien unter der gleichen Conditionsas beschrieben in 1.3, bis F2 Nachkommen entstehen.
Hinweis: Transfer F1 Königin und F2 Nachkommen in neue größere Putz Nest (Abbildung 2, Links) zur langfristigen Aufbewahrung der Kolonie.
3. Bewertung der Inzucht Erfolg
- DNA-Extraktion und Genotypisierung der elterlichen Generation (F0)
- Ein Bein einer F0 Königin mit Pinzette entfernen und das Bein auf einer 1,5 mL reaktionscup mit 100 µL Chelat-Agent übertragen.
- Unter dem stereoskopische Mikroskop sezieren eines weiblichen Bauches in Glasschale gefüllt mit 300 µL Reinstwasser mit Pinzette und isolieren die samentasche, enthält das Sperma aus begatteten Männchen.
- Ziehen Sie das Gewebe der samentasche und isolieren Sie das Sperma aus dem Gewebe der weiblichen Insekten Stifte verwenden.
Hinweis: Zur Erleichterung der Spermien Extraktion aus der samentasche aufbewahren weiblichen Exemplare in 100 % EtOH für mehr als einen Tag vor der Präparation. - Mit einer Mikropipette übertragen Sie das Sperma in einem 1,5 mL reaktionscup mit 100 µL Chelat-Agent.
- Inkubieren Sie Proben von F0 Königin und Spermien im Schritt 3.1.1 und 3.1.3, jeweils vorbereitet, bei 95 ° C für 20 min. Flash Zentrifugieren die reaktionscup und Lagerung bei 4 ° C.
- An anderer Stelle beschrieben Genotyp alle Proben mit Methode4.
- DNA-Extraktion aus dem paar Ameisen zur Inzucht Kreuze (F1)
- Nach Bestätigung der Ei-Produktion durch das Sib F1 Königin verpaart, extrahieren Sie die DNA der Königin mit ihren Schuppen Flügeln oder Mid Einbein- und Genotyp mit derselben Methode beschrieben in Abschnitt 3.1 genannten.
- Extrahieren von DNA von F1 Männchen mit nur einem Bein und Genotyp mit gleichen in Abschnitt 3.1 oben beschriebene Methode.
Hinweis: Proben in 100 % speicherbar EtOH vor DNA-Extraktion und DNA in Chelat-Agent für zwei Monate bei 4 ° c gelagert werden können
- Beurteilung der männlichen Fruchtbarkeit bei Männern produziert von Inzucht Kreuze
Hinweis: Diploide Männchen produziert von Inzucht Kreuze sind oft steril.- Inneren Geschlechtsorgane in eine Glasschale mit 400 µL PBS-Lösung mit Pinzette zu sezieren.
- Entfernen Sie PBS zu, und fügen Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit einer Mikropipette.
- Befestigen Sie das Gewebe durch Inkubation in PFA für 30 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C).
- Waschen Sie Gewebe 5 Mal mit 400 µL PBS mit einer Mikropipette.
- Verdünnen Sie die 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung bis 1 µg/mL in PBS.
- Entfernen Sie PBS zu und fügen Sie ca. 300 µL dieser verdünnten Färbelösung DAPI Gewebe.
- Inkubieren Sie 15 min unter dunklen Zustand bei Raumtemperatur (15-25 ° C).
- Gewebe 5 Mal mit 400 µL PBS waschen und Gewebe auf Mitte der Folie Glas mit Pinzette zu übertragen.
- Montieren Sie Gewebe auf Montage mittlerer enthaltenden Tetramethylrhodamine TRITC konjugiert Phalloidin.
- Beobachten Sie Proben durch konfokale Laser-scanning-Mikroskop 20 X oder 63 X-Objektive verwenden.
- Verwenden Sie 405 nm Anregung Laser und einem Hybrid-Detektor bei 410-530 nm für DAPI-Erkennung.
- Verwenden Sie 561 nm Anregung Laser und einem Hybrid-Detektor bei 565-650 nm für TRITC Erkennung.
- Verwenden Sie eine Scan-Geschwindigkeit von 400 Hz (400 Zeilen/s) mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel.
- Die Aufnahmen Sie mit Hilfe einer Softwareplattform.
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Representative Results
Mit F0 bis F1 Generationen Mikrosatelliten-Analyse ergab, dass Inzucht Kreuze erfolgreich produziert wurden (Abbildung 4)6. Infolgedessen wurden begatteten Königinnen von Inzucht Kreuze, innerhalb eines Monats nach der experimentellen Kreuzung Kolonien erhalten. Eine Viertel (27,1 ± 8,91 % SD) aller Nachkommen (F2) von der Inzucht Kreuze war männlich, während der Rest weiblich (Arbeitnehmer und eine Königin)6. QTL-Kartierung mit den Nachkommen von Inzucht Kreuze zeigte, dass Männchen produziert durch Inzucht Kreuze diploid und homozygot auf zwei CSD Loci (CSD1 und CSD2 in Abbildung 5), während Weibchen (Arbeitnehmer) produziert von Inzucht Kreuze diploid wurden und bei heterozygoten zumindest auf einem CSD-Locus-6.
Dissektion der haploiden männlichen Hoden und Spermien, als erwartet (Abbildung 6A-6 C) offenbart. Allerdings wurden in diploide Männchen Spermien nie beobachtet was darauf hindeutet, dass Männer in Inzucht Kreuze produziert sterile V. Emeryi6. , Darüber hinaus konnte Hoden der diploide Männchen (Abbildung 6-6E) zu entwickeln.
Abbildung 1 . Typische reproduktive System in (A) Hautflügler und atypische reproduktiven Systems mit Androgenese und Gynogenesis in (B) V. Emeryi. In der Regel Weibchen (Arbeitnehmer und Königinnen) entwickeln sich aus befruchteten, diploiden Eiern und Männchen aus unbefruchteten haploiden Eiern, enthält die Hälfte der mütterlichen Genom (A) entwickeln. In V. Emeryientwickeln sterile Arbeiter und ein paar lange-winged Königinnen (LWQ) aus befruchteten diploiden Eiern, während kurzer geflügelten Königinnen (SWQ) mit fast komplette mütterliche Genome aus unbefruchteten diploiden Eiern (Gynogenesis) zu entwickeln. Männlichen Erben nie mütterliche Genome aber sind Klone ihrer Väter (Androgenese) (B). Diese Zahl wurde von [Miyakawa Et Al. 2018]7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Experimenteller Aufbau V. Emeryi Kolonien. Nach Auflistung dar sind Kolonien in eine künstliche Putz Nest übertragen und im Labor. Ein großer Putz-Nest (links) ist bereit für gesammelten Kolonien zu halten, während ein kleiner Gips-Nest (rechts) für experimentelle Inzucht Kreuze vorbereitet ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Neuen V. Emeryi geschlüpften entstehen während der Paarungszeit. Reifen und gut-Fedcolonies neigen, lang-winged Königinnen (LWQ) produzieren mit dem elterlichen Genom zusätzlich kurze geflügelten Königinnen (SWQ) die nur das mütterliche Genom (Abbildung 1B) tragen. Foto mit freundlicher Genehmigung von Herrn Taku Shimada. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Gestaltung von Inzucht Kreuze und Mikrosatelliten Genotypen von F0 bis F1 Generationen. Mit 11 Mikrosatelliten-Markern entwickelt in früheren Studien6,8,9, Weibchen und Männchen der elterlichen Generation (F0) zeigten verschiedene Genotypen. Die Genotypen der Weibchen und Männchen zur experimentellen Kreuzungen (F1) geerbt die elterliche und väterlichen Genotypen bzw. darauf hinweist, dass Weibchen erfolgreich mit ihren Brüdern gekreuzt wurden die Weibchen mit der Hälfte gemeinsam ihrer Genome. Zahlen geben Längen der PCR-Produkte bei Mikrosatelliten Locus l-5, ist einer der Marker für die Genotypisierung6,8,9,10verwendet. Diese Zahl hat nach den Daten aus [Miyakawa und Mikheyev 2015]6illustriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Allel-Muster zwei CSD-Loci (CSD1 und CSD2) bei den Nachkommen von Inzucht Kreuze produziert. Anteil der diploide Männchen (ca. 25 %) und QTL Mapping mit Nachkommen von Sib verpaart Königinnen produziert deuten auf die Existenz von zwei CSD Loci in V. Emeryi. Weibchen sind in mindestens einem der beiden CSD Loci heterozygot, während die Männchen an alle Loci homozygot sind. Genotypen sind durch Buchstaben des Alphabets dargestellt. Diese Zahl wurde von [Miyakawa Et Al. 2018]7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Männlichen inneren Geschlechtsorgane androgenetische haploide und diploide Männchen in V. Emeryi. Morphologien der Hoden und andere interne reproduktive Organe seziert aus den androgenetischen haploide Männchen (A). Sperma (Bindegewebe) war in Hoden haploide Männchen (B und C) zu sehen. Blauer Farbe markiert Kerne von DAPI gefärbt, und roten Farbmarkierungen F-Aktin befleckt durch Tetramethylrhodamine TRITC konjugiert Phalloidin in B, C und E. (a) Zubehör Drüsen; (t) Hoden; (V) Vas Deferens; (g) äußeren Genitalien. Morphologien der reproduktiven Organe seziert von den diploiden Männern (D). Hoden und Spermien diploiden Männer wurden nie beobachtet (D und E, N >> 30). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt die Protokolle, die verwendet werden können, zu induzieren Inzucht Kreuze und das Auftreten von Inzucht in die Ameise V. Emeryizu bewerten. In den Experimenten ist Genotypisierung der Individuen für Kreuze verwendet muss sichergestellt werden, dass Inzucht Kreuze erfolgreich waren. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Kreuzung Tests deutlich wie diploide Männchen das ganze Jahr produziert werden können, während haploide Männchen nur im Herbst im Feld und Labor-6produziert werden können. SIB verpaart Königinnen beginnen unmittelbar nach der Kreuzung männliche Nachkommen zu produzieren. Keine morphologischen phänotypischen Unterschiede beobachtet wurden zwischen diploid und haploid Männchen in V. Emeryi6,7. Aber diploiden männlichen V. Emeryi fast ausnahmslos nicht Hoden zu entwickeln. Das reproduktive Potential der männlichen Nachkommen ist in Ermangelung von genetischen Markern für die Prüfung der genetische Verwandtschaft von Paaren, die für das Überschreiten der Tests verwendet lässt sich ableiten, ob Inzucht aufgetreten ist. Allerdings sollte angemerkt werden, dass Männchen in Inzucht Kreuze produziert nicht immer steril in anderen hymenopteran Arten15,16,17.
Der erste wichtige Schritt für den Erfolg des Protokolls ist die Wartung der wohlgenährten Kolonien, wie füttern, nach Feldauflistung wird die Wahrscheinlichkeit der Erlangung ausreichender Zahl der geschlüpften für Kreuze zu erhöhen. In V. Emeryiberichtet eine positive Korrelation zwischen Ernährung und die Produktion von langen geflügelten Königinnen, die Königinnen verwendet für die Inzucht Kreuze10sind. Bei sozialen Insekten eher kleine Kolonien oder Kolonien in einem schlechten Gesundheitszustand nicht neu geschlüpften18zu produzieren. Es ist daher wichtig, Reife Kolonien aus dem Feld zu sammeln und ihnen ausreichende Mengen an nahrhaften Lebensmitteln für Experimente mit neuen geschlüpften bieten.
Der zweite wichtige Schritt ist, Arbeitnehmer, Fortpflanzungs- und einige Larven oder Puppen während der Überfahrt Tests zusammen zu halten und pflegen die experimentellen Kreuzung Kolonie auf dem gleichen Stand wie die einer normalen Kolonie bis Kreuzung (für eine Woche bis einen Monat) abgeschlossen ist. Es ist schwierig, Kolonien zu pflegen, die verwendet werden, für die Überquerung Tests ohne Arbeitnehmer länger als 3 Tage, denn Männer nicht in der Lage sind, sich selbst zu ernähren und von Arbeitern gefüttert werden müssen. Unter solchen unnatürlichen Bedingungen war die Erfolgsquote bei der Inzucht Kreuze extrem niedrigen6.
Es gibt zwei Einschränkungen hinsichtlich der Anwendung der Protokolle zu anderen Ameisenarten. Erstens sind die Hinweise zur Induktion Kreuze bestimmte Arten. Es ist relativ leicht induzieren Labor Kreuze in V. Emeryi seit Intra-Kolonie Paarung ohne Flug in der Natur vorkommt. Jedoch haben viele Ameisenarten paarungsrituale entwickelt, die nuptial Flüge während oder nach dem Flug19während die neuen Königinnen und Männchen Partner einbeziehen. Es ist daher wichtig, die Auslöser zu erhellen, die Kreuzung in jeder Tierart in einer Laborumgebung zu induzieren. Zum Beispiel in die parasitären Ameise Acromyrmex Ameliaescheint der wichtigste Impuls für die Auslösung nuptial Flüge Licht20sein. Die zweite Einschränkung ist in einigen Fällen, die diploiden Männchen produziert durch Inzucht Kreuze können nicht gesammelt werden, wie sie Therapeu sind oder von Arbeiter getötet, weil sie nicht arbeiten und/oder keine haben oder niedrige reproduktive Potential und somit erhebliche Kosten in die Kolonie von der objektiven Art21,22,23. Glücklicherweise, diploiden V. Emeryi Männchen sind nicht durch Arbeiter getötet und sie zu leben, bis sie sterben natürlich, was darauf hindeutet, dass sie nicht in der Natur häufig anzutreffen sind und eine Strategie zur diploide Männchen von Kolonien auszuschließen sich nicht in dieser Art entwickelte.
Im Vergleich zu anderen Ameisenarten, die Arrhenotokous Parthenogenese (Abb. 1A) zu reproduzieren beschäftigen, davon auszugehen, dass gewisse Vorteile zur Herstellung von experimentellen Inzucht Kreuze Androgenese als V. Emeryi mittels der eine klassische Rückkreuzung entsprechen genetisch Inzucht Kreuze. In der Tat hat das System konnten wir design-Experimente zu untersuchen die Geschlechtsbestimmung Gene, Molekulare Mechanismen und funktionelle Studien in dieser Spezies6,7durchführen.
Zusammenfassend lässt sich sagen Methoden zur Durchführung von Inzucht überquert und um den Erfolg der resultierenden auszuwerten sind Kreuze in V. Emeryibeschrieben worden. Diese Protokolle sind unerlässlich für Experimente an Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen der Sex Bestimmung Systeme in den Hymenopteren gerichtet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Taku Shimada, der Delegierte des AntRoom, Tokio, Japan, für die uns mit seinem Foto von V. Emeryi geschlüpften. Dieses Projekt wurde von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Research Fellowship für junge Wissenschaftler (16J00011) und Grant in Aid for Young Scientists (B)(16K18626). finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
