Summary
I detta protokoll beskrivs metoder för att bedriva inavel korsar, och för att utvärdera framgången för dessa kors, för myran Vollenhovia emeryi. Dessa protokoll är viktiga för experiment som syftar till att förstå den genetiska grunden för sex beslutsamhet system i Hymenoptera.
Abstract
De genetiska och molekylära komponenterna i sex-bestämning kaskad har studerats i honungsbiet, Apis mellifera, en hymenopteran modellorganism. Lite är känt om de sex-bestämning mekanismerna i andra icke-modell hymenopteran taxa, såsom myror. På grund av den komplicerade karaktären av de livscykler som har utvecklats i hymenopteran arter, är det svårt att upprätthålla och genomföra experimentella korsningar av dessa organismer i laboratoriet. Här beskriver vi metoderna för att bedriva inavel kors och för att utvärdera framgången för dessa kors i ant Vollenhovia emeryi. Inducerande inavel i laboratorium med hjälp av V. emeryi, är relativt enkelt på grund av den unika biologin av arten. Särskilt arten producerar androgen män och kvinnliga reproductives uppvisar wing polymorfism, vilket förenklar identifiering av fenotyperna i genetiska korsar. Utvärdering av framgången hos inavel är dessutom okomplicerad som män kan produceras kontinuerligt av inavel kors, medan normal hannen visas endast under en väldefinierad reproduktiv säsong i fältet. Våra protokoll kan använda V. emeryi som modell för att undersöka den genetiska och molekylära grunden för systemets sex bestämning i ant arter.
Introduction
Eusociala Hymenopteran taxa, såsom myror och bin, har utvecklats en haplodiploid sex-fastställande system i vilka individer som är heterozygota på en eller flera kompletterande kön bestämning (CSD) loci blir honor, medan de som är homo- eller hemizygous bli män (figur 1A)1.
Genetiska och molekylära komponenter inblandade i sex bestämning kaskad har studerats väl hos honungsbiet, Apis mellifera, en hymenopteran modell organism2,3,4. Senaste komparativ genomik undersökningar tyder på att myror och honungsbin delar många förmodad homologs i sex bestämning väg, såsom den första kön bestämning genen, csd5. Dock saknas fortfarande bevis för funktionella bevarande av dessa homologs i myror.
För att lösa detta problem, behöver inavel linjer utvecklas eftersom de är viktiga för genetisk kartläggning och molekylära studier. Det är dock svårt att upprätthålla och genomföra experimentella korsningar av dessa organismer i laboratoriet på grund av den komplicerade karaktären av de livscykler som har utvecklats.
Här, använder vi Vollenhovia emeryi som en modell för att undersöka den genetiska och molekylära grunden för systemets sex bestämning i myror6,7. Inavel raderna av denna art utvecklades tidigare för länkaget kartläggning av kvantitativa loci (QTL) för egenskaper relaterade till sex bestämning för första gången i myror6. Undersökta7har dessutom gjorts av molekylär kön-bestämning kaskad. Denna art har utvecklats en ovanlig reproduktion system som sysselsätter både gynogenesis och androgenesis (figur 1B)8,9. De flesta nya drottningar och hanar är klonalt producerade från mödra- och paternal genomen, respektive. Dessutom, arbetstagare och vissa queens produceras sexuellt8. Denna reproduktion system är särskilt väl lämpade för genetiska studier eftersom inavel korsen produceras med sexuellt produceras queens och män är genetiskt motsvarar en klassisk backcross. Eftersom sexuellt producerade queens skiljer sig morfologiskt från queens produceras från moderns genomen10 (figur 1B), förenklas genomföra och utvärdera inavel korsar betydligt med den här metoden.
I denna artikel, metoderna för upprättande av laboratoriet kolonier för korsning test, korsar tillämpningen av inavel använder full-sib par och utvärdering av framgången hos dessa kors med genotypning av kolonin medlemmar och dissektion av manliga avkommor genitalier beskrivs i V. emeryi.
Oavsett det mångfaldigande som används, är tillämpningen av inavel korsar ofta det viktiga första steget i alla utredningar av sex beslutsamhet system i steklar. Till exempel i Cardiocondyla obscuriorvisar den nästan totala avsaknaden av diploida hanar efter 10 generationer av full-sib parning i laboratoriet avsaknad av CSD locus11. Det är möjligt att förutsäga antalet CSD loci från förhållandet mellan hanar produceras i inavel korsar6,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fältet insamling och underhåll av V. Emeryi kolonier i laboratoriet
Obs: Bon av V. emeryi finns i ruttnande stockar och fallna ruttnande träd branchesin sekundära skogar i hela Japan. Denna art visar två typer av kolonier, dvs (1) kolonier producerar endast långvingade queens och (2) kolonier som huvudsakligen producerar korta bevingade queens utöver litet antal långvingade queens8,14. I detta protokoll samlat vi sistnämnda typ av kolonier i Ishikawa prefektur, Japan.
- Samla in V. emeryi kolonier under försommaren.
Obs: För att få tillräckligt antal sexuella individer under säsongen reproduktiv, kolonier som innehåller mer än 300 individer föredras. - Överföra ant exemplaren från insamlade grenarna till en konstgjord gips boet med en glaskupa med en insugningsventil (figur 2, vänster).
- Upprätthålla kolonier i konstgjorda boet vid 25 ° C under en cykel med 16:8 h i ljus och mörker. Ge kranvatten med en tvättflaska våt gips.
- Lägg till ca 100 mg torr cricket pulver insvept i aluminiumfolie och ett brunt socker vattenfyllda tips (20 µL spets) varannan dag tills nya reproductives (F1 bevingade-queens och F1 hanar) dyka upp.
2. experimentell laboratorium korsar
Obs: Nya reproductives börjar växa fram från sensommaren till hösten (figur 3). Långvingad queens produceras sexuellt, och kort-winged queens produceras klonalt och har moderns genomet (figur 1). Använda långvingade queens och hanar för inavel kors.
- För att stoppa individer från att flytta, placera kolonier i ett konstant miljö rum vid 4 ° C i 15 min.
- Ta bort mitten-benen på 30 arbetstagare som använder tången i stereoskopisk Mikroskop och överför dem till nya mindre gips boet (figur 2, höger) för inavel kors.
Obs: Benen tas bort för att skilja de aktuella arbetstagarna från de arbetstagare som kommer att produceras av de efterföljande inavel kors. - Tillsätt 3-4 larver eller puppor i en gips boet som innehåller arbetstagare.
Anmärkning: Arbetstagare visar undersökande verksamhet i F0 queens-mindre kolonin. Larver eller puppor kan effektivt locka dessa arbetstagare och nya reproductives i centrera av kolonin under korsning test. Som ett resultat, hålla villkoren i den experimentella kolonin nära den normala kolonin. - Över en långvingade drottning och en hane till en gips boet bereddes i steg 2.3 för inavel kors.
- Hålla kolonier vid 25 ° C under en 16:8 h ljus/mörk cykel med mat och vatten tillhandahålls som beskrivs i 1.3 tills drottningen förlorar sina vingar och lägga ägg.
Anmärkning: Detta tar en vecka till en månad. - Kontrollera det experimentella koloni vardagliga i stereoskopisk Mikroskop. Efter utför inavel korsar mellan F1 avkomma, kan ägg observeras under en stereoskopisk Mikroskop.
- Efter F1 drottningen börjar lägga ägg, ta bort F1 hanar och larver eller puppor lade till i steg 2,3 från boet för att undvika blandning av den F1 (hanar och honor används för inavel korsar) och den F2 generationen (avkomma producerat från inavel korsningar).
Obs: Om det finns några hanar i kolonin, det är möjligt att inducera inavel korsar med en hane och 1 till 3 drottningar i samma experimentella kolonin. - Behåll kolonierna under den samma conditionsas som beskrivs i 1.3, tills F2 avkomma växa fram.
Obs: Överföring F1 queen och F2 avkommor till nya större gips boet (figur 2, vänster) för långsiktiga kolonin att hålla.
3. utvärdering av inavel framgång
- DNA-extraktion och genotypning av föräldragenerationen (F0)
- Ta bort ena benet av en F0 drottning med pincett och överföra benet till en 1,5 mL mikrorör innehållande 100 µL av kelering agent.
- I stereoskopisk Mikroskop, dissekera en kvinnlig buken i glasskål fylld med 300 µL av ultrarent vatten med hjälp av pincetten och isolera den spermatheca som innehåller spermier från Parade hanar.
- Skala bort vävnaden i spermatheca och isolera spermier från vävnaden i honan använder insekt pins.
Obs: För att underlätta spermier utvinning från spermatheca, lagra kvinnliga exemplar i 100% EtOH för mer än en dag innan dissektion. - Med hjälp av en mikropipett, överföra spermier i en 1,5 mL mikrorör innehållande 100 µL av kelering agent.
- Inkubera prover av F0 drottning och spermier som bereddes i steg 3.1.1 och 3.1.3, respektive, vid 95 ° C i 20 min. Flash Centrifugera mikroröret och förvaras vid 4 ° C.
- Genotyp alla prover med metoden beskrivs på annan plats4.
- DNA-extraktion från para av myror används för inavel korsar (F1)
- Efter bekräftar äggproduktion av sib parat F1 queen, extrahera DNA av drottningen med vingarna skjul eller ena halva benet och genotyp med samma metod som beskrivs i avsnitt 3.1 ovan.
- Extrahera DNA av F1 hane med ena benet och genotyp dem med samma metod som beskrivs i avsnitt 3.1 ovan.
Obs: Prover kan lagras i 100% EtOH innan DNA-extraktion och DNA i kelering agent kan förvaras i två månader vid 4 ° C.
- Utvärdering av manlig fertilitet hos hanar produceras från inavel korsar
Obs: Diploida hanar produceras från inavel korsningar är ofta sterila.- Dissekera inre reproduktiva organ i en glasskål med 400 µL av PBS-lösningen med pincett.
- Ta bort PBS och Lägg 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) med hjälp av en mikropipett.
- Korrigera vävnaden genom ruvning i PFA för 30 min i rumstemperatur (15-25 ° C).
- Tvätta vävnad 5 gånger med 400 µL av PBS med hjälp av en mikropipett.
- Späd den 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) lösning på 1 µg/mL i PBS.
- Ta bort PBS och Lägg till ca 300 µL av denna utspädda DAPI färglösningen vävnad.
- Inkubera i 15 min under mörka tillstånd vid rumstemperatur (15-25 ° C).
- Tvätta vävnad 5 gånger med 400 µL av PBS och överföra vävnad på mitten av bilden glas med hjälp av tången.
- Montera vävnad på montering medium innehållande tetrametylrodamin TRITC-konjugerad phalloidin.
- Iaktta prover av confocal laserscanning Mikroskop 20 X eller 63 X objektiv.
- Använd en 405 nm excitation laser och en hybrid-detektor på 410-530 nm för DAPI upptäckt.
- Använd en 561 nm excitation laser och en hybrid-detektor vid 565-650 nm för TRITC upptäckt.
- Använda en scan hastighet av 400 Hz (400 linjer/s) med en upplösning på 1024 × 1024 pixlar.
- Fånga bilder med en mjukvaruplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av mikrosatellit analys med F0 och F1 generationer visade att inavel korsar producerades framgångsrikt (figur 4)6. Som en följd av inavel korsar, erhölls Parade drottningar inom en månad efter att fastställa experimentella korsning kolonierna. En fjärdedel (27,1 ± 8,91% SD) av alla avkomma (F2) från inavel korsen var manliga, medan återstoden kvinna (arbetstagare och en drottning)6. QTL mappning med avkomman från inavel korsar visade att hanar produceras av inavel korsar fanns diploida och homozygot på två CSD loci (CSD1 och CSD2 i figur 5), medan honor (arbetare) produceras från inavel kors var diploida och heterozygota på minst en CSD locus6.
Dissektion av haploida hanar avslöjade testiklar och spermier, som beräknade (figur 6A-6 C). Dock i diploida män observerats spermier aldrig, vilket tyder på att hanar produceras i inavel kors är sterila i V. emeryi6. Dessutom misslyckades testiklarna diploida män att utveckla (figur 6 d-6E).
Figur 1 . Typiska reproduktionssystemet hos a steklar och atypiska reproduktiva systemet som omfattar androgenesis och gynogenesis i (B) V. emeryi. Vanligtvis kvinnor (arbetstagare och queens) utvecklas från befruktade diploida ägg och hanar utvecklas ur obefruktade haploida ägg som innehåller hälften av maternell genomet (A). I V. emeryiutvecklas sterila arbetare och några långvingade queens (LWQ) från befruktade diploida ägg, medan korta bevingade queens (SWQ) utveckla med nästan komplett maternell genomen från obefruktade diploida ägg (gynogenesis). Män ärva aldrig moderns genomen men är kloner av deras fäder (androgenesis) (B). Denna siffra har ändrats från [Miyakawa et al. 2018]7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Experimentell uppsättning upp V. emeryi kolonier. Efter fältuppsättningen, kolonier överförs till en konstgjord gips boet och höll i laboratoriet. En stor gips-nest (vänster) är förberedd för upprätthålla insamlade kolonier, medan ett mindre gips boet (höger) är förberedd för experimentell inavel kors. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Nya V. emeryi reproductives dyka upp under säsongen reproduktiv. Mogen och väl-fedcolonies tenderar att producera långvingade queens (LWQ) med i föräldrarnas arvsmassa förutom korta bevingade queens (SWQ) som bär endast moderns genomet (figur 1B). Foto med tillstånd av Mr Taku Shimada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Design av inavel kors och mikrosatellit genotyper F0 och F1 generationer. Med 11 mikrosatellit märkpennor utvecklats i tidigare studier6,8,9, honor och hanar av föräldragenerationen (F0) visade olika genotyper. Genotyperna av honor och hanar används för experimentell korsar (F1) ärvde de föräldra- och paternal genotyperna, respektive, som anger att honor korsades framgångsrikt med sina bröder, som honorna delade hälften deras genomen. Siffrorna anger längder av PCR-produkter på mikrosatellit locus l-5, som är en av de markörer som används för genotypning6,8,9,10. Denna siffra har illustrerats enligt data från [Miyakawa och Mikheyev 2015]6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Allel mönster två CSD-lokus (CSD1 och CSD2) hos avkomman produceras av inavel korsar. Andelen diploida hanar (cirka 25%) och QTL mappning med avkommor som har producerats av sib-parat queens föreslår existensen av två CSD loci i V. emeryi. Honorna är heterozygot i minst en av de två CSD loci medan Hanarna är homozygota på alla loci. Genotyper representeras av bokstäverna i alfabetet. Denna siffra har ändrats från [Miyakawa et al. 2018]7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Manliga inre reproduktionsorganen ärftligt haploida och diploida män i V. emeryi. Morfologier i testiklarna och andra interna reproduktionsorgan dissekerade ut från ärftligt haploida hanarna (A). Sperma (fibrös vävnad) kunde ses i testiklarna hos haploida hanar (B och C). Blå färg markerar atomkärnor färgas av DAPI, och röd färg markerar F-aktin färgas av tetrametylrodamin TRITC-konjugerad phalloidin i B, C och E. (a) tillbehör körtlar; (t) testiklar; (v) sädesledaren; (g) genitalier. Morfologier inre reproduktiva organ dissekerade sig från de diploida hanarna (D). Testiklar och spermier diploida män observerades aldrig (D och E, N >> 30). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel visar protokoll som kan användas för att inducera inavel kors och utvärdera förekomst av inavel i myran V. emeryi. I experiment är genotypning av de individer som används för kors nödvändigt att säkerställa att inavel kors var framgångsrika. Effektiviteten av dessa korsning tester är dock tydligt som diploida hanar kan produceras under hela året, medan haploida hanar endast kan framställas under hösten i både fältet och på laboratoriet6. SIB-parat queens börja producera manlig avkomma omedelbart efter passage. Inga morfologiska fenotypiska skillnader observerades mellan diploida och haploida hanar i V. emeryi6,7. Dock misslyckas diploida manliga V. emeryi nästan alltid med att utveckla testiklarna. I avsaknad av genetiska markörer för att testa den genetisk släktskap av par som används för passage av tester, kan i fertil ålder manliga avkommor användas att utläsa om inavel har inträffat. Det bör dock noteras att hanar produceras i inavel kors inte är alltid sterila i andra hymenopteran arter15,16,17.
Ett första viktigt steg i framgången för protokollet är underhåll av välnärda kolonier, som utfodring dem efter fältuppsättningen ökar sannolikheten för att få tillräckligt antal reproductives för kors. I V. emeryi, har en positiv korrelation rapporterats mellan nutrition och produktionen av Långvingad drottningar, som är drottningarna används för inavel korsar10. I sociala insekter, små kolonier eller kolonier i dålig hälsa, tenderar att inte producera nya reproductives18. Det är därför viktigt att samla mogen kolonier från fältet och att förse dem med tillräckliga mängder av näringsrik mat för experiment med nya reproductives.
Den andra kritiska steget är att hålla arbetstagarna, reproduktiv och några larver eller puppor tillsammans under korsning provningarna och att upprätthålla den experimentella korsning kolonin på samma tillstånd som för en normal koloni tills korsning är klar (för en vecka till en månad). Det är svårt att upprätthålla kolonier som ska användas för att passera proven utan arbetstagare för mer än 3 dagar eftersom män inte kan livnära sig själva och måste matas av arbetstagare. Under sådana onaturliga förhållanden var andelen framgångsrika inavel korsar extremt låg6.
Det finns två begränsningar angående tillämpningen av dessa protokoll på andra ant arter. Första är ledtrådar för att inducera kors artspecifika. Det är relativt lätt att framkalla laboratorium korsen i V. emeryi sedan intra-koloni parning utan flygning förekommer i naturen. Många ant arter har dock utvecklats parning ritualer som involverar bröllops flygningar under vilka nya drottningar och hanar mate under eller efter flygning19. Det är därför viktigt att belysa de triggers som inducerar korsning i varje art i laboratoriemiljö. Till exempel i den parasitiska ant Acromyrmex ameliaeverkar viktigaste drivfjäder för att utlösa bröllops flyg vara ljus20. Den andra begränsningen är, i vissa fall, diploida hanar produceras av inavel korsar inte kan samlas så som omintetgör eller dödade av arbetstagare eftersom de inte arbeta eller har ingen eller låg fertil ålder, och därmed en större kostnad för kolonin av den objektiva Art21,22,23. Lyckligtvis, diploida V. emeryi hanar inte dödas av arbetstagare och de lever tills de dör naturligt, vilket tyder på att de inte är ofta påträffas i naturen och en strategi för att utesluta diploida hanar från kolonier har inte utvecklats hos denna art.
Jämfört med andra ant arter som sysselsätter arrhenotokous partenogenes att reproducera (figur 1A), kan vi anta att det finns vissa fördelar med att producera experimentella inavel kors med V. emeryi genom androgenesis som den inavel kors är genetiskt motsvarar en klassisk backcross. Faktiskt har systemet gjort det möjligt för oss att utforma experiment att undersöka sex-bestämning generna, molekylära mekanismer, och utföra funktionella studier här arter6,7.
Sammanfattningsvis, metoder att bedriva inavel korsar och för att utvärdera framgången för den resulterande kors har beskrivits i V. emeryi. Dessa protokoll är väsentliga för experiment riktad till förstå den genetiska och molekylära grunden för sex beslutsamhet system i Hymenoptera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Mr Taku Shimada, ombudet av AntRoom, Tokyo, Japan, för att förse oss med sitt fotografi av V. emeryi reproductives. Projektet finansierades av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) forskning gemenskap för unga forskare (16J00011), och ge stöd för unga forskare (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
