Summary
このプロトコルでは、ant Vollenhovia emeryiの近親交配を実施し、これらの十字の成功を評価するためのメソッドを説明します。これらのプロトコルは、膜翅目の性決定システムの遺伝的基盤を理解することを目的とした実験のため重要です。
Abstract
カスケードは性決定の遺伝学的および分子成分が盛んミツバチ、セイヨウミツバチ、ハチのモデル有機体の。しかし、少しは他非モデル分類群ハチ、アリなどに見られる性決定機構について知られています。ハチの種に進化しているライフ サイクルの複雑な性質のため、研究室では、これらの生物間の実験十字を行い、維持することは困難です。ここでは、我々 は近親交配を実施するため、ant Vollenhovia emeryiのそれらの交差の成功を評価するための方法を説明します。種のユニークな生物学のためemeryi 対を用いた実験で近親交配を誘導するは比較的簡単です。具体的には、この種を生成するアンドロゲン性男性と女性の reproductives 展示翅多型、遺伝子交雑における表現型の識別を簡素化します。さらに、男性はフィールドには、明確に定義された繁殖シーズン中にのみ表示されます通常男性間の交差を近親交配によって継続的に作り出すことができるよう、近親交配の成功の評価は簡単です。我々 のプロトコル モデルとしてemeryi (動)使用している遺伝学的および分子的蟻種の性決定システムを調査するを可能にします。
Introduction
アリやハチなど社会性ハチのイチイが進化したが 1 つまたは複数の相補性決定でヘテロ個人を (CSD) 軌跡になる女性、ホモや hemizygous 中 haplodiploid 性決定システム男性 (図 1A)1になります。
遺伝学的および分子性決定カスケードに関連するコンポーネントは、ミツバチ、セイヨウミツバチ、ハチのモデル有機体の2,3,4においてよく研究されています。最近の比較ゲノミクスの調査は、アリやミツバチが初期の性決定の遺伝子、 csd5などの性決定経路の推定同族体多くを共有することをお勧めします。ただし、これらの同族体の機能の保全のための証拠はまだアリで欠けています。
この問題に対処するため近親交配行遺伝のマップおよび分子研究に不可欠な開発しなければなりません。ただし、進化しているライフ サイクルの複雑な性質のため研究室では、これらの生物間の実験十字を行い、維持することは困難です。
ここでは、我々 はアリ6、7の性決定システムの分子・遺伝的基盤を調査するのにモデルとしてのVollenhovia emeryiを使用します。この種の近親ラインは、以前アリ6で初めての性決定に関連する形質の量的形質遺伝子座 (QTL) のマッピングのため開発されました。さらに、分子性決定カスケードは調査7をされています。この種は gynogenesis と今回の両方 (図 1B)8,9を採用した異常な再生システムを進化しています。クローン母体と父方のゲノムからほとんどの新女王と男性がそれぞれ生成されます。さらに、労働者といくつかのクイーンは性的生産が8。この複製システムは、性的を使用して生成される近親交配はクイーンズブレイドを生産し、男性が古典的な交雑と遺伝的等価特に遺伝学的研究に適しています。性的に作り出されたクイーンズ異なる母体ゲノム10 (図 1B) から生成されるクイーンズから形態学的、ので実施し、近親交配の評価は大幅に簡略化このメソッドを使用しています。
交差テストの実験室コロニーの確立の方法この記事で近親交配のアプリケーションを越える完全 sib のペアを使用して、コロニーのメンバーのジェノタイピングおよび男性の子孫の解剖を使用してこれらの十字の成功を評価性器は、 emeryi v.のとおりです。
関係なく、再生システムを採用、十字架を近親交配のアプリケーションはしばしば、膜翅目の性決定システムの任意の調査で重要な第一歩。たとえばCardiocondyla obscurior全兄妹交配実験室での 10 世代後二倍体男性のほぼ完全な欠如は、CSD 遺伝子座11の不在を示しています。近親交配6,12,13で生産された男性の比から CSD 遺伝子座の数を予測することが可能です。
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Protocol
1. フィールド コレクションと研究室でV. Emeryi植民地のメンテナンス
注: emeryi v.の巣は腐敗のログと全国落ちた腐食木 branchesin 二次林で発見されます。この種は、植民地、すなわち、 (1) コロニーだけ女王の長い翼と (2) 植民地中心に長い翼クイーンズブレイド8,14の数が少ないだけでなく短翅女王を生産生産の 2 つのタイプを示しています。このプロトコルでは石川県におけるコロニーの後者のタイプを集めました。
- 年初夏emeryi 対植民地を収集します。
注: 繁殖の季節の間に性の個人の十分な数を取得、スタッフ 300 人以上を含む植民地が優先されます。 - 吸引器 (図 2左) を使用してガラス カバーと、アリの標本を収集の枝から人工石膏巣に転送します。
- 16:8 h 明暗周期下 25 ° C で人工巣の植民地を維持します。石膏をウェット洗浄ボトルに水道水を提供します。
- 乾燥コオロギ パウダーに包まれたアルミ箔と茶色の砂糖水で満たされたヒント (20 μ L チップ) 新しい reproductives (F1翼女王と F1男性) が出てくるまで毎日約 100 mg を追加します。
2. 実験交差
注: 新しい reproductives は、夏の終わりから秋 (図 3) に出現する開始します。長い翼を持つ女王が性的、作り出される、短翅クイーンズ クローン作り出されると母性のゲノム (図 1)。十字架を近親交配に長い翼を持つ女王と男性を使用します。
- 4 ° C で 15 分間の一定の環境ルームでコロニーの場所移動から個人を停止します。
- 実体顕微鏡下で鉗子を使用して 30 の労働者の半ば足を削除し、新しい小さな石膏巣 (図 2右) 十字を近親交配のためにそれらを転送します。
注: 足はその後近親交配によって生成される労働者から現在の労働者を区別するために削除されます。 - 労働者を含む石膏巣に 3-4 の幼虫や蛹を追加します。
注: 労働者は、F0クイーンズ少ない植民地で探索活動を表示します。幼虫や蛹に効果的にこれらの労働者と植民地の中心部に新しい reproductives 交差テスト中には、誘致することができます。その結果、通常のコロニーに近い実験的コロニーの条件を保ちます。 - 十字架を近親交配の手順 2.3 で準備石膏巣に長い翼を持つ女王と男性を転送します。
- 食料や水の女王が彼女の翼を失うし、卵を産むまで 1.3 で説明として提供 16:8 h 明暗周期下 25 ° C でコロニーを保ちます。
注: これは 1 ヶ月に 1 週間をかかります。 - 実体顕微鏡下で実験的コロニー毎日チェックしてください。F1子孫間で交差する近親交配を実行後、実体顕微鏡下で卵を観察できます。
- 1女王が産卵を始めます F 後、F1世代 (男女近親交配に使用) と F2世代 (子孫の混合を避けるために F1男性と幼虫や蛹の巣から 2.3 の手順で追加削除近親交配から生産)。
注: いくつかの男性は植民地は、同じ実験的コロニーの 1 人の男性と 1 に 3 の女王を使用して近親交配を誘導することが可能。 - F2の子孫が出てくるまでに 1.3 で説明した同じ動向の下でコロニーを保ちます。
注: 転送 F1女王と新しい大きな石膏巣 (図 2左) 長期の植民地維持のために F2の子孫。
3. 近親交配成功の評価
- DNA の抽出および親の世代 (F0) の遺伝子型解析
- 1 本の鉗子を用いた F0女王の足を取り外し、キレート剤の 100 μ L を含む 1.5 mL マイクロ チューブに脚。
- 実体顕微鏡下で鉗子を用いた超純水の 300 μ L で満たされたガラス皿の中の女性の腹部の解剖、嵌合の男性から精子を含んだ交尾を隔離します。
- 交尾の組織をはがすし、昆虫ピンを使用して女性の組織から精子を分離します。
注: 交尾から精子抽出しやすく、100% 女性の標本を格納解剖前に 1 日以上のエタノール。 - マイクロ ピペットを使用してには、キレート剤の 100 μ L を含む 1.5 mL マイクロ チューブに精子を転送します。
- F0女王と 3.1.1 および 3.1.3 のステップでそれぞれ準備の精子のサンプルをインキュベート、95 ° c で 20 分間フラッシュ、マイクロ チューブを遠心し、4 ° C で保存
- 遺伝子型のすべてのメソッドを使用してサンプル記載事項4をのすべて。
- 近親交配 (F1) 用アリのペアからの DNA 抽出
- F1女王の合致、sib による卵の生産を確認した後は、彼女の小屋の翼または中間片足セクション 3.1 上記で説明した方法を使用して遺伝子型を使用して女王の DNA を抽出します。
- 1 つの脚と遺伝子型を使用して同じを使用して DNA の F1男性を抽出セクション 3.1 上記記載の方法。
注: サンプルはキレート剤の DNA と DNA の抽出の前にエタノールは 4 ° C で 2 ヶ月保存ことができます 100% に格納できます。
- 十字架を近親交配から生成される男性の男性の生殖能力の評価
注: 近親交配から生産二倍体雄が滅菌多い。- 鉗子を使用して PBS 溶液 400 μ L でガラス皿の内部生殖器を解剖します。
- PBS を削除し、マイクロ ピペットを使用して 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加します。
- PFA で部屋の温度 (15 ~ 25 ° C) で 30 分間インキュベートし、組織を修正します。
- 5 回で 400 μ L の PBS マイクロ ピペットを使用して組織を洗浄します。
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューションを PBS で 1 μ g/mL を希釈します。
- PBS を削除し、この DAPI 染色溶液の約 300 μ L を組織に追加します。
- 室温 (15-25 ° C) で暗い条件下での 15 分間、インキュベートします。
- 5 回で 400 μ L の PBS、組織を洗浄し、鉗子を使用してスライド ガラスの中央にティッシュを転送します。
- 組織をマウントします中含む Tetramethylrhodamine TRITC 共役ファロイジンをマウントします。
- 共焦点レーザー顕微鏡 20 X または 63 倍の対物レンズを使用してサンプルを確認します。
- DAPI 検出 410 530 nm 405 nm 励起レーザーとハイブリッド検出器を使用します。
- 565-650 nm 561 nm 励起レーザーとハイブリッド検出器を使用して、TRITC 検出のため。
- 400 Hz のスキャン速度を使用 (400 ライン/秒) 解像度 1024 × 1024 ピクセルでに。
- ソフトウェア プラットフォームを使用してイメージをキャプチャします。
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Representative Results
F0と F1世代によるマイクロ サテライト解析の結果は、近親交配が正常に生成されたことを示した (図 4)6。結果として十字架を近親交配の実験交差コロニーの確立の 1 ヶ月以内合致の女王が得られました。残りは女性 (労働者および女王)6近親交配からのすべての子孫 (2F) の四分の一 (27.1 ± 8.91 %sd) は男性だった十字架を近親交配から子孫を使用して QTL マッピング, 十字架を近親交配によって生成される男性が二倍体 2 つのホモ CSD 遺伝子座 (CSD1 および図 5に CSD2)、女性 (労働者) ながら十字架を近親交配から生産された二倍体とヘテロで少なくとも 1 つ CSD 遺伝子座6時。
半数の男性の解剖では、予想される (図 6A-6 C) として精巣や精子を明らかにしました。ただし、二倍体の男性の精子が決して観察され、十字架を近親交配で生産された男性、 emeryi 対6.で滅菌さらに、二倍体の男性の精巣は、(図 6-6 e) の開発に失敗。
図 1.ハチ目 (A) と雄核発生とemeryi 対(B) の gynogenesis を含む非定型の生殖システムに典型的な生殖システム。通常、二倍体の受精卵から女性 (労働者と王妃) を開発、男性が母性のゲノム (A) の半分を含む半数体卵から開発。Emeryi 対、生殖不能の労働者といくつか長い翼女王 (LWQ) 開発します二倍体の受精卵から二倍体未受精卵 (gynogenesis) からほぼ完全な母性ゲノム短翅クイーンズブレイド (SWQ) を開発。自分の父親 (今回) (B) のクローンは、男性は決して母体のゲノムを継承します。この図は、[宮川ら2018]7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.Emeryi V.コロニーの実験設定します。フィールド コレクションの後、植民地は人工石膏巣に転送され、実験室で保管します。大型石膏巣 (左) を備える小さい石膏巣 (右) は実験的近親交配の準備に対し収集したコロニーを維持します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.新しいemeryi 対reproductives 繁殖の季節の間に出現します。成熟したし、よく fedcolonies は母体のゲノム (図 1B) を負う短翅クイーンズブレイド (SWQ) に加えて親のゲノムと長い翼を持つ女王 (LWQ) を生成する傾向があります。島田卓氏の礼儀の写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.近親交配の F0と F1世代のマイクロ サテライト遺伝子型設計と。11 マイクロ サテライト マーカーを用いた開発以前研究6,8,9, 女性と男性 (F0) の親の世代の異なる遺伝子型を示した。女性と男性の実験十字 (F1) 用の遺伝子継承親と父方の遺伝子それぞれ、女性が、女性は半分を共有、兄弟たちと正常に渡っていたことを示す、ゲノム。数字は、 L-5ジェノタイピング6,8,9,10に使用されるマーカーの 1 つであるマイクロ サテライト遺伝子座で PCR の製品の長さを示します。この図は、【 宮川・ セルゲイェヴィッチ 2015年 】6からのデータによると示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.子孫の 2 つの CSD 座位 (CSD1 と CSD2) の対立遺伝子パターンが十字架を近親交配プロデュースします。二倍体雄 (約 25%) と王妃の兄妹交配による子孫を用いた QTL マッピングの割合は、 emeryi 対の 2 つの CSD 遺伝子座の存在を提案します。女性は、男性は、すべて遺伝子座ホモ接合体に対し少なくとも 1 つ 2 つの CSD 遺伝子座でヘテロ接合体。遺伝子型は、アルファベットの文字で表されます。この図は、[宮川ら2018]7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.Emeryi 対のアンドロゲン性半数体および二倍体男性の男性の内部生殖器。精巣およびその他の内部生殖器官の形態は、アンドロゲン性半数体男性 (A) からを解剖しました。(B と C) 半数の男性の精巣内精子 (維) を見ることができます。青い色が染色 DAPI、核をマークし、赤色マーク F アクチンの B、C、および e. Tetramethylrhodamine TRITC 共役ファロイジン染色 (、) の付属腺;(t) 精巣;(v) 精管;(g) 外性器。内部の生殖器官の形態を (D) の二倍体の男性からを解剖しました。精巣と二倍体の雄の精子が認められたことがない (D と E, N >> 30)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、近親交配を誘導し、 emeryi 対アリの近親交配の発生を評価するために使用できるプロトコルを示します。実験では, 交雑用個人の遺伝子型は近親交配が成功したことを確認する必要。しかし、これらの交差テストの有効性は明らか二倍体雄は半数の男性は、フィールドと実験室6で秋にだけ生産できる一方、年間を通して生産できます。兄妹交尾女王を横断後すぐに男性の子孫を生成する開始します。Emeryi V.6,7.の二倍体と半数の男性間の形態的な形質の違いは認められなかったただし、二倍体雄emeryi 対ほとんど必ず失敗する精巣を開発します。踏切のテスト用のペアの遺伝的類縁性をテストするための遺伝子マーカーがない場合は、近親交配が発生したかどうかを推測する男性の子孫の生殖能を使用できます。しかし、十字架を近親交配で生産された男性が常にその他ハチ種15,16,17で滅菌ではないことに注意してください。
プロトコルの成功の最初の重要なステップは、フィールド コレクションが十字架の reproductives の十分な数を得ることの可能性を高める後それらを餌として飼育コロニーのメンテナンスです。Emeryi 対の栄養と長い翼の女王は、近親交配10用女王の生産の間に正の相関を報告されています。社会性昆虫、小さいコロニーや植民地を貧しい人々 の健康、新しい reproductives18の生産をしない傾向があります。したがって、フィールドから成熟したコロニーを収集するために、新しい reproductives を用いた実験のための栄養価の高い食品の十分な量を提供する重要です。
2 番目の重要なステップは交差テスト中に労働者、生殖といくつかの幼虫や蛹を一緒に維持し、(月に一週間) の交差を完了するまで通常のコロニーのそれと同じ状態で実験交差植民地を維持するために。男女労働者が供給する必要があります自分自身を養うことができないので、3 日以上労働者なしテストを横断するため、植民地を維持することは困難です。このような不自然な状況では、近親交配の成功率が非常に低い6だった。
これらのプロトコルの他の蟻種への適用に関する 2 つの制限があります。まず、十字架を誘導するための手がかりが固有種です。それは自然でフライトが発生せず内コロニー交配からemeryi v.の実験室十字を誘発する比較的簡単です。しかし、多くの蟻種は、交尾の儀式中または飛行19後どの新しい女王と男性の仲間の中に結婚式のフライトを含む進化してきました。したがって、実験室の設定でそれぞれの種の交差点を誘発するトリガーを解明する重要です。たとえば、寄生アリAcromyrmex ameliae結婚式のフライトをトリガーするための主な刺激は光20表示されます。第 2 の制限は、いくつかのケースで、彼らが実行可能、十字架を近親交配によって生成される二倍体雄が収集できない彼らは動作しない、またはないために労働者によって殺されたまたは生殖潜在性を低や植民地の主要なコストは、このように、客観的種21,22,23。幸いなことに、二倍体emeryi 対男性はない労働者によって殺され、彼らが彼らが頻繁を自然に発生したないことを示唆している当然のことながら、死ぬし、植民地から二倍体の男性を除外する戦略もこの種の進化していないまで暮らします。
(図 1A) を再現する産単為生殖を採用他の蟻種と比較して、我々 として今回emeryi (動)による実験的近親交配交配を生産する特定の利点があると仮定ことができます、近親交配は遺伝的古典的な交雑と同等です。確かに、システムは性決定遺伝子、分子メカニズムを調査し、この種の6、7の機能調査を行う実験を設計することになりました。
要約すると、近親交配を実施する方法を越えるし、結果の成否を評価する十字架のemeryi (動)に記載されています。これらのプロトコルは、膜翅目の性決定システムの遺伝学的および分子の基礎の理解に向けた実験に不可欠です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
Emeryi 対reproductives の彼の写真を提供してくれる、AntRoom、東京都代表の島田拓さんに感謝しますこのプロジェクトによって賄われていた日本学術振興会科学 (JSPS) 研究員若手 (16J00011) の奨学金の支援若手 (B)(16K18626)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
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