Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo
Summary
Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.
Abstract
Nosso sistema imunológico consiste de um número e variedade de células imunes, incluindo células de células (Treg) T reguladoras. Células TREG podem ser divididas em dois subconjuntos, tímicas células derivadas de Treg (tTreg) e perifericamente induzida por células Treg (pTreg). Eles estão presentes em diferentes órgãos do nosso corpo e podem ser diferenciados por marcadores específicos, tais como o Helios e Neuropilin 1. Relatou-se que as células tTreg são funcionalmente mais supressivas do que células pTreg. Portanto, é importante determinar a proporção de células tanto tTreg e pTreg na investigação de populações de células heterogêneas. Neste documento, coletamos glândulas do timo, pancreáticos drenagem de linfonodos e baço de normoglycemic não-obesos diabéticos ratos para distinguir células de tTreg de pTreg células usando citometria de fluxo. Estamos preparados manualmente suspensões única célula por estes órgãos. Conjugados a fluorocromo superfície CD4, CD8, CD25, e anticorpos Neuropilin 1 foram usados para manchar as células. Eles foram mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpos intracelulares de Foxp3 e Helios fluorocromo conjugado. Estes marcadores foram usados para caracterizar os dois subconjuntos de células Treg. Este protocolo demonstra uma maneira simples, mas prática para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço e usá-los para análise de subsequentes fluxo cytometric.
Introduction
Pilhas de T (Treg) reguladoras são essenciais para a homeostase do sistema imune. Células TREG são definidas pela expressão de antígenos de superfície CD4 e CD25 e transcrição fator forkhead caixa P3 (Foxp3)1,2,3. Primeiro, Sakaguchi et al mostrou que CD25 é constitutivamente expressa em células T supressor ratos4, que previa uma observação pioneira para a identificação de células Treg humanas. Células TREG desempenham um papel central na tolerância imunológica, exercendo uma capacidade supressora através de uma variedade de mecanismos, incluindo citólise através da secreção de granzymes para induzir apoptose, consumo de citocinas e inibição através da expressão de citotóxicos Linfócitos T antígeno 45. Além disso, eles podem secretam citocinas inibidoras como transformar o fator de crescimento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) e IL-355. Células TREG naturalmente podem ser derivadas de timo, caso em que eles são designados do Timo células derivadas de Treg (tTreg), ou eles podem ser induzidos nos órgãos periféricos, nesse caso são chamados perifericamente induzida por células Treg (pTreg).
Helios, um membro da família de factor de transcrição Ikaros, foi relatado para ser um marcador para distinguir entre as células tTreg células e e pTreg6. Mais tarde, dois outros grupos relataram que Neuropilin 1 (Nrp1), um receptor III semaphorin, poderia servir como um marcador de superfície para tTreg células sob determinadas condições de7,8. Não obstante, Singh et al demonstraram que o Helios é um marcador melhor neste contexto em ingênuo ratos9.
Os subconjuntos de células Treg desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase do sistema imune e na proteção contra a infecção e autoimunidade. Portanto, é importante determinar os números e proporções dessas populações nos tecidos linfoides e não linfoides. Para conseguir isso, é preciso preparar suspensões única célula por estes órgãos. Um número de protocolos foram descrito ou utilizado em estudos anteriores. Principalmente, dissociators automáticos têm sido utilizados em relatórios publicados anteriormente10,11. Usar o dissociators automáticos é conveniente e economia de tempo, mas é um procedimento caro. Portanto, usamos um método manual para preparar suspensões única célula de murino glândulas do timo, linfonodos pancreáticos (PDLNs) drenagem e baços de normoglycemic não-obesos diabéticos (ASSENTIMENTO) mouses e células únicas isoladas por estes órgãos. Este método tem sido utilizado em nossos estudos anteriores e descobrimos que o método manual para preparar a suspensão de célula única é tão eficiente quanto dissociador automático método9,12,13,14. Além disso, usamos a citometria de fluxo para determinar as proporções de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células e subconjuntos de Treg células tTreg e pTreg. As células tTreg e pTreg foram distinguidas usando o Helios e Nrp1 como marcadores de células tTreg. Assim, nossos resultados indicam que o método manual para preparar as células única funciona eficientemente e as suspensões preparadas única célula podem ser ainda mais usadas para estudos utilizando citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, nós isolado única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD e investigou a expressão de Helios e Nrp1 em CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células usando citometria de fluxo. No presente estudo, foram utilizados camundongos NOD, que é um modelo murino de diabetes tipo 1. Em um estudo anterior, usamos as estirpes de tipo selvagem do mouse CD-1 e camundongos C57BL/6 para investigar se o Helios ou Nrp1 é um melhor marcador para distinguir cél…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O presente estudo foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa Sueco, EXODIAB, Fundação sueca de Diabetes, fundo de Diabetes criança sueca, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Os autores também queria obrigado Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler para seus suportes e discussões.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
Referências
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