Summary
Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in Desoxyribonukleinsäure (DNA) einzuführen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die Site-verwiesene Mutagenese mit einem 2-Schritt tun und 3-Stufen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Ansatz, die auf DNA-Fragment von Interesse anwendbar ist.
Abstract
Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in der DNA zu untersuchen, die Interaktion zwischen kleine nicht-kodierende Ribonukleinsäure (sRNA) Moleküle und Ziel-Messenger-RNAs (mRNAs) einzuführen. Darüber hinaus dient die Site-verwiesene Mutagenese spezifischen Proteins Bindestellen RNA zuordnen. Eine 2- und 3-Schritt PCR-basierte Einführung von Mutationen wird beschrieben. Der Ansatz ist für alle Protein-RNA und RNA-RNA Wechselwirkungsstudien relevanten. Kurz gesagt, setzt die Technik auf Primer mit der gewünschten Auge und durch 2 oder 3 Schritte der PCR Synthese ein PCR-Produkt mit der Mutation zu entwerfen. Das PCR-Produkt wird dann zum Klonen verwendet. Hier beschreiben wir, wie auszuführenden Site-verwiesene Mutagenese mit dem 2 - und 3-Schritt-Ansatz einzuführen Mutationen die sRNA, McaS und die mRNA, CsgD, RNA-RNA und RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Wir wenden diese Technik um RNA Interaktionen zu untersuchen; Allerdings ist die Technik für alle Mutagenese Studien (z. B. DNA-Protein Interaktionen, Aminosäure Substitution/löschen/hinzufügen). Es ist möglich, jede Art von Mutation mit Ausnahme von nicht natürlichen Basen einzuführen, aber die Technik ist nur anwendbar, wenn ein PCR-Produkt für nachgeschaltete Anwendung (z. B. Klonen und Vorlage für weitere PCR) verwendet werden kann.
Introduction
DNA wird oft bezeichnet als die Blaupause einer lebenden Zelle da alle Strukturen der Zelle in der Reihenfolge ihrer DNA kodiert werden. Exakte Replikation und DNA-Reparaturmechanismen sicherstellen, dass nur eine sehr geringe Raten von Mutationen auftreten, das ist wichtig für die Erhaltung der richtigen Funktionen kodiert Gene. Veränderungen der DNA-Sequenz können aufeinander folgende Funktionen auf verschiedenen Ebenen, beginnend mit DNA (Anerkennung von Transkriptionsfaktoren und Restriktionsenzyme), dann RNA (Basenpaar Komplementarität und Sekundärstruktur Veränderungen) und/oder Protein (Aminosäuren beeinflussen. saure Substitutionen, Streichungen, Ergänzungen oder Frame-Schichten). Während viele Mutationen Genfunktion nicht erheblich beeinträchtigen, können einige Mutationen in der DNA enorme Auswirkungen haben. Site-verwiesene Mutagenese ist damit ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer DNA-Standorte auf allen Ebenen.
Dieses Protokoll beschreibt einen gezielte Mutagenese-Ansatz verwendet, um bestimmte Mutationen einzuführen. Das Protokoll stützt sich auf zwei verschiedenen PCR-Strategien: eine 2-stufige oder ein 3-Stufen-PCR. Die 2-stufige PCR ist anwendbar, wenn die gewünschte Mutation in der Nähe von 5'-Ende oder der 3'-Ende der DNA von Interesse ist (< 200 Basenpaaren (bp) vom Ende) und die 3-Stufen-PCR ist in allen Fällen anwendbar.
In der 2-Schritt-PCR-Ansatz 3 Grundierungen sind so konzipiert, in denen ein Set der Zündkapseln ist konzipiert, um die DNA des Interesses (Primer 1 und 3, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) verstärken und eine einheitliche Grundierung wurde entwickelt, um die Mutation zu integrieren. Die Mutation, die Einführung der Grundierung (Primer 2) sollte eine umgekehrter Orientierung haben, wenn die Mutation in der Nähe von 5'-Ende und eine nach vorne Ausrichtung, ist wenn die Mutation in der Nähe der 3'-Ende ist. Im ersten Schritt PCR verstärkt Primer 1 + 2 oder 2 + 3 ein kleines Fragment in der Nähe der 5'-Ende oder 3' Ende, beziehungsweise. Das daraus resultierende PCR-Produkt dient dann als Grundierung in Schritt 2 mit Primer 1 oder 3, wodurch sich ein PCR-Produkt mit einer Mutation in der DNA des Interesses (Abbildung 1A).
In der 3-Stufen-PCR 4 Primer dienen, in denen ein Satz von Primern ausgelegt ist, verstärken die DNA des Interesses (Primer 1 und 4, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) und einen Satz von Primern wurde entwickelt, um spezifische Mutationen mit überlappenden Komplementarität zu integrieren (Primer 2 und 3, rückwärts und vorwärts, bzw.). In Schritt eins und zwei, Primer 1 + 2 und 3 + 4 der 5' und 3'-Ende zu verstärken. In Schritt drei die daraus resultierende PCR-Produkte von Schritt eins und zwei sind als Vorlage verwendet und mit Primer 1 + 4 verstärkt. So ist die resultierende PCR-Produkt die DNA des Interesses mit der gewünschten Mutation (Abbildung 1 b).
Während die mutierte DNA für alle nachgelagerten Anwendungen verwendet werden kann, beschreibt dieses Protokoll die DNA in ein Klonen Vektor neu zu kombinieren. Die Nutzung des Klonens Vektoren hat mehrere Vorteile wie einfache Klonierung und spezifische experimentelle Anwendungen abhängig von den Funktionen des Vektors. Diese Funktion wird oft für RNA-Wechselwirkungsstudien verwendet. Eine andere Technik für RNA-Wechselwirkungsstudien ist strukturelle sondieren der RNA im Komplex mit einem anderen RNA1,2 oder Protein3,4. Jedoch strukturelle sondieren in-vitro-erfolgt erst während Site-verwiesene Mutagenese und anschließende Klonen für Studien zu Wechselwirkungen in vivo ermöglichen.
Site-verwiesene Mutagenese ist beträchtlich für RNA-Wechselwirkungsstudien benutzt worden, wie hier dargestellt. Jedoch die Schlüsselmethode über 2 oder 3-Stufen-PCR gilt für jedes Stück der DNA und somit nicht nur auf RNA-Wechselwirkungsstudien beschränkt.
Um die Technik und ihre Einsatzmöglichkeiten veranschaulichen, dient der Charakterisierung der Regionen wichtig für posttranskriptionale Verordnung der mRNA, CsgD, von Escherichia coli (E. Coli). In E. Coli, CsgD zielt durch die kleine nicht-kodierende RNA, McaS, in Zusammenarbeit mit einem Protein, Hfq, Proteinexpression von CsgD2,4,5zu unterdrücken. Die Technik wird verwendet, um Mutationen der Basis-Paarung Region zwischen CsgD und McaS und der Hfq-Bindungsstelle des CsgDeinzuführen. Die erhaltenen DNA wird dann in einen Vektor geeignet für spätere Experimente geklont. Downstream-Anwendungen der Technik sind in vivo und in-vitro-Experimente. Zur Veranschaulichung Beispiel 1 zeichnet in-vivo mit einem western-Blot-Test und Beispiel 2 in-vitro-mit einem elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) gekennzeichnet ist. In beiden Fällen ist es illustrierte wie Site-verwiesene Mutagenese in Kombination mit anderen Techniken verwendet werden kann, zu biologischen Rückschlüsse auf ein Gen von Interesse.
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Protocol
(1) Vektorauswahl
- Wählen Sie einen Vektor mit nachgeschalteten Experimente durchführen. Jeder Vektor ist für diese 2 - und 3-stufige PCR Methode anwendbar.
- Je nach Auswahl des Vektors, wählen Sie geeignete Restriktionsenzyme zum Klonen.
2. besser gekleideteres Design für Website gerichtet Mutagenese
- Entscheiden Sie sich zwischen entweder 2 oder 3-Schritt PCR-Strategie (2-Schritt gilt nur für Mutationen < 200 bp von beiden Enden der DNA des Interesses). Gehen Sie für die 2-stufige PCR zu Schritt 2.2 und für die 3-Stufen-PCR gehen Sie zu Schritt 2.3.
- Primer für 2-stufige PCR zu entwerfen.
- Design Grundierung 1 und 3, die DNA des Interesses und mit einer 5' zu verstärken, dass Überhang enthält 4 Nukleotide (z. B. ATAT oder AGCT) gefolgt von der entsprechenden Einschränkung Anerkennung Website notwendig, in den gewählten Vektor zu klonen.
- Design Grundierung 2 Auge auf die gewünschte Webseite(n) einzuführen und flankieren die Mutation mit 10-15 komplementären Nukleotide auf beiden Seiten. Machen Sie den Primer umkehren, wenn die Mutation am 5'-Ende eingeführt wird oder weiterleiten Sie, wenn die Mutation am 3'-Ende eingeführt wird.
- 3-Stufen-PCR Primer Design.
- Design Grundierung 1 und 4, die DNA des Interesses und mit einer 5' zu verstärken, dass Überhang enthält 4 Nukleotide (z. B. ATAT oder AGCT) gefolgt von der entsprechenden Einschränkung Anerkennung Website notwendig, in den gewählten Vektor zu klonen.
- Design Grundierung 2 und 3 zur Einführung Auge auf gewünschte Webseite(n) und flankieren die Mutation von 10-15 komplementären Nukleotide auf beiden Seiten. Primer 2 und 3 sind ergänzende umzukehren.
(3) PCR Verstärkung der Wildtyp-DNA für Klonen
Hinweis: Einzelheiten zur PCR, siehe6.
- Führen Sie PCR6 mit Primer 1 + 2 (2-stufige PCR) oder 1 + 4 (3-Stufen-PCR) und verwenden Sie Wildtyp-DNA als Vorlage, um PCR Produkt I. Verwendung der PCR-Programm in der Tabelle 1zu erhalten.
- Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Machen Sie eine Agarose-gel-Lösung (2 %) durch Zugabe von 2 g Agarose pro 100 mL 1 X Tris-Acetat-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (TAE) Säurepuffer. Lösen Sie die Agarose durch Kochen in der Mikrowelle auf. Fügen Sie die DNA-Färbung Farbstoff Interkalation Bromid (um eine Endkonzentration von ~ 0,5 µg/mL) um die Agarose gel-Lösung zur Visualisierung.
- Gegossen Sie Agarosegel, legen Sie sie in eine Elektrophorese-Einheit und laden Sie PCR-Proben (gemischt mit DNA Loading Dye) und eine DNA-Leiter bekannter Größe zu. Laufen Sie Proben bei 75 W 45 min oder, bis Bands ausreichend getrennt sind und Bands an einem Tisch mit ultravioletten (UV) oder mit einem Gel imaging-System zu visualisieren.
- Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).
- Speichern Sie die gereinigte DNA bei-20 ° C (im Tris-EDTA (TE) Puffer – langfristige Lagerung) oder 4 ° C (im dH2O – kurzfristige Lagerung) erst bei Schritt 5.
(4) PCR, Site-verwiesene Mutationen in der DNA vorzustellen
- PCR für 2-stufige PCR (siehe Punkt 4.2 für 3-Stufen-PCR)
- Führen Sie PCR6 mit Primer 1 + 2, wenn Mutationen in 5'-Ende sind oder 2 + 3 sind die Mutationen in den 3' Ende und Wildtyp-DNA als Vorlage verwenden, um PCR-Produkt II zu erhalten (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).
- Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.
- Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).
- Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) erst bei Schritt 5.
- PCR-6 mit PCR-Produkt II als Primer zusammen mit Primer 3 wenn Mutationen in der 5'-Ende oder Primer 1 sind wenn die Mutationen am 3'-Ende sind und Wildtyp-DNA als Vorlage zu PCR-Produkt III durchführen (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).
- Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.
- Reinigen Sie PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).
- Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis Schritt 5.
- PCR für die 3-Stufen-PCR
- PCR-6 mit Primer 1 + 2 und 3 + 4 in separaten Reaktionen führen und Wildtyp-DNA als Vorlage verwenden, um PCR-Produkt erwerben II und III (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).
- PCRs durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2 zu validieren.
- Reinigen Sie PCR-Produkte mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration des gereinigten DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).
- Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O).
- Führen PCR6 mit Primer 1 + 4 und 2 bis 5 ng beider PCR Produkte II und III als Vorlagen (in der gleichen Reaktion) verwenden, um PCR-Produkt IV zu erhalten (siehe Tabelle 1 für PCR-Programm).
- Validieren Sie PCR durch Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.
Hinweis: Es ist nicht ungewöhnlich, dass mehrere falsche Bands bekommen (kann manchmal verringert werden durch die Verwendung weniger Vorlage). Die falsche PCR-Produkte können jedoch ignoriert werden, wenn die richtig dimensionierte Band herausgeschnitten und Gel extrahiert wird. - Wenn du es richtig, reinigen Sie PCR-Produkt mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) und Messen Sie die Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials).
- Store gereinigte DNA bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis Schritt 5.
(5) Rekombination von Wildtyp und Mutanten Version(en) von DNA in den gewählten Vektor
Hinweis: Einzelheiten zu folgenden Schritten finden Sie7.
- Digest gereinigt PCR-Produkte I und III (von 2-stufige PCR) bzw. IV (von 3-Stufen-PCR) unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme.
- In 20 µL 1 x Verdauung Puffer mit 1 µL jedes Restriktionsenzym verdauen 200 ng PCR-Produktes bei 37 ° C für 30-60 Minuten.
- Verdaute PCR-Produkt durch Gel-Extraktion mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials) zu reinigen, die DNA-Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials) messen und speichern bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (in dH2 O) bis zum Schritt 5.6.
- Gereinigten Vektor mit relevanten Restriktionsenzymen zu verdauen und behandeln mit alkalischer Phosphatase, Vektor Re Ligatur Ereignisse zu verringern. Behandeln Sie nicht PCR-Produkte mit alkalischer Phosphatase.
- In 30 µL 1 x Verdauung Puffer mit 1 µL jedes Restriktionsenzym und 1 µL alkalische Phosphatase, Digest 1.000 ng des Vektors bei 37 ° C für 30-60 Minuten.
- Separate verdauten Vektor aus Abfall DNA (z. B. ungeschnitten Vektor und Cut-out DNA) mit Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 3.2.1 und 3.2.2.
- Reinigen verdauten Vektor durch Gel-Extraktion mit einem Gel Extraction Kit (Table of Materials), DNA-Konzentration von gereinigte DNA mit einem Spektrophotometer (Table of Materials) messen und speichern bei-20 ° C (in TE-Puffer) oder 4 ° C (im dH2O) bis für Schritt 5.6 verwendet.
- Verbinden Sie verdauten PCR-Produkte in verdauten Vektor mit den Reaktionen, die in Tabelle 2angegeben.
- Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bei 16 ° C.
- Verwandeln Sie Empfänger Belastung (z. B. E. Coli K12) mit Ligatur Reaktionen.
- Belastung bis OD600wachsen = 0,3-0,5 und 1 mL Transfer Kultur, soviele 1,5 mL-Röhrchen als Ligase Reaktionen.
- Drehen Sie bei 3.500 X g für 5 min und verwerfen Sie überstand.
- Aufschwemmen Sie Zellen in 200 μL der Transformation-Puffer (10 mL Lysogeny Brühe (LB) mit 0,1 g/mL Polyethylenglykol 3350, 5 % Dimethyl Sulfat und 20 mM MgCl2).
- Ligatur-Reaktion, und die Rohre für 30 min auf Eis.
- Hitze-Schock für 2 min bei 42 ° C.
- Die 1,5 mL Röhrchen 1 mL LB hinzu, und erlauben Sie Phänotyp der Antibiotikaresistenz für mindestens 45 Minuten bei 37 ° C.
- Drehen Sie die Zellen bei 3.500 X g für 5 min, 1 mL des Überstandes verwerfen und Aufschwemmen der Zellen im restlichen überstand.
- Platte die Zellen auf Platten mit geeigneten Antibiotika und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Transformanten beherbergen Vektoren mit erfolgreichen Integration der DNA einfügen (z. B. durch PCR mit Vektor - und Insert-spezifische Primer) zu identifizieren.
- Validieren der Sequenz der DNA von Sanger Sequenzierung.
Achtung: Verwenden Sie nicht die gleichen Primer zur Sequenzierung für Schritt 5.9 verwendet.
6. verwenden konstruierte Vektoren für in-vitro- und in-vivo-Experimente
- In Vivo-experiment
Hinweis: Dies ist ein Beispiel für die Verwendung eines Vektors Wildtyp/mutierte RNA zu charakterisieren posttranskriptionale Verordnung zum Ausdruck bringen. Für weitere Details über das westliche Beflecken siehe8.- Wachsen Sie E. Coli K12-Stämme mit konstruierten Vektoren in geeigneter Form zu und induzieren Sie Ausdruck zu, wenn erforderlich. Ernten Sie Proben durch Zentrifugation.
- Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch Auflösen der Zelle Pellets im 1 x SDS-Probenpuffer Proben vorbereiten (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % SDS, 0,002 % Bromophenol Blue, 5 % β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin) und kochen bei 95 ° C für 5 min.
Hinweis: Es ist möglich, eine Gel gegossen oder verwenden Sie eine handelsübliche Betonfertigteile Gel. Letzteres wurde in die Ergebnisse in Abbildung 3 (Table of Materials) verwendet. - Wägezellen Sie 107 -jeder Probe in separaten Brunnen (mit einer Protein-Leiter) und betrieben Sie Gel bei 200 V, bis Proteine (ca. 45 min) getrennt sind.
- Beflecken der Proteine auf eine Zellulose-Membran durch semi-dry Transfer bei 80 mA 1 h.
- Blockieren Sie die Membran mit einer Mischung aus Proteinen (z. B. 5 % Milch-Pulver aufgelöst in 1 X Tween 20-Tris gepufferte Kochsalzlösung (TTB) Puffer).
- Fügen Sie Primärantikörper (aufgelöst in 1 X TTBS-Puffer), die das Protein des Interesses (z. B. GFP, Flagge- oder KIS-markierte Protein) und 1 h unter schonenden rühren inkubieren.
- Waschen Sie die Membran in 1 X TTBS für 10 min, ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie mehr.
- Fügen Sie Sekundärantikörper (aufgelöst in 1 X TTBS-Puffer), die den primären Antikörper richtet sich an und lassen für die Erkennung (z. B. Meerrettich Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper. 1 h unter schonenden rühren inkubieren.
- Waschen Sie die Membran in 1 X TTBS für 10 min, ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie mehr.
- Visualisieren Sie die Membran mit einer Technik, die kompatibel mit den sekundären Antikörper (z. B. durch Bildgebung nach Inkubation mit ein Chemilumineszenz Luminol abgeleitet, wenn ein HRP-konjugierten Sekundärantikörper verwendet wurde).
- In-vitro-experiment
Hinweis: Dies ist ein Beispiel für die Verwendung des Vektors als Vorlage für in-vitro-Transkription von RNA RNS-Protein-Interaktionen zu charakterisieren. Für weitere Details zu EMSA siehe9.- In-vitro-Transkripte mit einem T7 in Vitro Transkription Kit (Table of Materials) und Vektoren aus Schritt 5 als Vorlagen zu machen.
- Trennen Sie RNA-Transkripte von Seite auf einem 4,5 % 7 M Harnstoff Denaturierung Gel zu, und extrahieren Sie RNA direkt vom Gel von Electro Elution mit Dialyse Röhren (Table of Materials).
- Beschriften Sie RNA (z. B. mit γ -32P-ATP enzymatische mit T4-Polynukleotid-Kinase (Table of Materials) und reinigen wieder mit Spalten (Table of Materials).
Achtung: Vor dem arbeiten mit radioaktivem Material, wenden Sie sich an den lokalen Strahlung Sicherheitsbeauftragten. - Mischen Sie beschriftet-RNA mit steigenden Konzentrationen des Proteins in separaten Reaktionen in einem 1 x Bindung Puffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, MgCl2, 1 mM 1 mM Dithiothreitol (DTT)).
Hinweis: In den vorgestellten Ergebnissen (Abbildung 4), 2 nM des radioaktiven CsgD mRNA wurde mit einer Steigung von 0 bis 2 µM Hfq Protein (Monomerkonzentration) gemischt. - Lassen Sie Proteine und RNA zu hybridisieren vor dem Laden Hybridisierung Mischung auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel und das Gel für 1,5 h bei 200 V laufen.
- Visualisieren Sie das Gel mit einer Technik mit der Kennzeichnung von Schritt 6.1.3 kompatibel. (z. B. durch Phosphoimaging wenn enzymatische angewendet wurde).
- Quantifizieren Sie die relative Intensität der verschobenen Bands mit einer Bildgebung Verarbeitung Programm zu und passen Sie eine Kurve (sigmoidale), um die Daten mithilfe ein Graphen und Datenanalyse-Software (Table of Materials). Basierend auf die angepasste Kurve, können Dissoziation Konstante (Kd) Werte automatisch mit der Software ermittelt werden.
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Representative Results
RNA-Interaktionen bezüglich posttranskriptionale Regulierung des CsgD, untersucht eine doppelte Vektor-Setup wurde gewählt: eine CsgD zum Ausdruck bringen mRNA und eine weitere kleine nicht-kodierende RNA, McaS zum Ausdruck bringen. CsgD wurde in pBAD33, die eine Arabinose induzierbaren Medium-Kopie Plasmid mit Chloramphenicol Widerstand ist geklont und McaS in Mini R1 pNDM220, die eine Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) induzierbaren niedrigen Kopie Plasmid kloniert wurde mit Ampicillin-Resistenz. Wildtyp CsgD war PCR verstärkt mit Primer 1A und 4A (4A beinhaltet eine FLAG-Sequenz) PCR Produkt IA, Ausbeute während Wildtyp McaS PCR verstärkt mit Primer 1 b und 4 b um PCR-Produkt IB zu erzielen war. Die 3-Stufen-PCR-Strategie wurde zur Einführung der Substitutionen im Großraum vorhergesagten Basis-Kopplung von CsgD und McaS. In den beiden ersten Schritten synthetisiert wurden PCR-Produkte IIA und IIIA mit Primer 1A, 2A und 3A + 4A, beziehungsweise. Im dritten Schritt wurde PCR-Produkt IVA synthetisiert mit PCR-Produkte IIA und IIIA als Vorlage und 1A und 4A als Primer (Abbildung 2A). In ähnlicher Weise wurden ergänzende Site-verwiesene Mutationen McaS, mit Primer 1 b, 2 b, 3 b und 4 b zu PCR Produkten IIB, IIIB in den ersten beiden Schritten und IVB in der dritten Stufe (Abbildung 2A) eingeführt. pBAD33 und IA und IVA PCR-Produkte mit BamHI und PstI verdaut wurden und die verdaute IA und IVA wurden in verdaute pBAD33 ligiert. Daraus resultierende Konstrukte wurden madothertrucker-CsgDFlagge und madothertrucker-CsgD63-66FLAG (mutiert bei Position 63-66 in Bezug auf die transkriptionelle Startsite) benannt. pNDM220 und PCR-Produkte IB und IVB wurden mit AatII und BamHI verdaut und verdaute IB und IVB wurden in verdaute pNDM220 ligiert. Daraus resultierende Konstrukte wurden pNDM-McaS und pNDM-McaS42-45 (mutiert bei 42-45 Position transkriptionelle Startsite) benannt.
Um die Wirkung der Mutationen assay, wurden E. Coli -Stämme beherbergen die madothertrucker-CsgD-FLAG oder madothertrucker-CsgD-63-66FLAG und pNDM220, pNDM-McaS oder pNDM-McaS42-45 in M9 minimaler Medium ergänzt mit 0,2 % Glycerin, OD angebaut. 450 von 0,4. Ausdruck aus der pNDM-Vektoren wurde dann für 10 min durch Zugabe von 1 mM IPTG gefolgt von 5 min Induktion der madothertrucker-Vektoren durch Zugabe von 1 mM Arabinose induziert. Zu diesem Zeitpunkt Proben wurden geerntet und western-Blot Analyse wurde mit den geernteten Proben durchgeführt. Während Ausdruck der Wildtyp McaS Übersetzung der Wildtyp CsgD verhindert, lindert Einführung von Mutationen in CsgD oder McaS die beobachteten Unterdrückung. Jedoch wenn die Mutationen in CsgD und McaS translationale Unterdrückung der CsgD ergänzt werden wiederhergestellt ist (Abbildung 3;2geändert). So, der Site-verwiesene mutagenen Ansatz unterstützt die Hypothese, dass McaS und CsgD Basenpaare in dieser Region.
PBAD33 Vektor für das in-vivo-Experiment wurde gewählt und diente auch zur Einführung von Site-verwiesene Mutation Hfq-Bindung an die CsgD zu untersuchen in-vitro-mRNA. Site-verwiesene Mutationen wurden mit der 2-stufigen PCR Strategie CsgD Mutant RNAs mit veränderten primären bzw. sekundären Strukturen wenn transkribiert generieren eingeführt. Primer 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F und 2G wurden verwendet, um zu verstärken und führen Mutationen an der 5'-Ende der CsgD. Die daraus resultierende PCR-Produkte (IIC, IID, IIE, IIF und IIG) dienten als Vorlagen mit Primer 3 verstärken und Mutationen, die gesamte CsgD DNA (Abb. 2 b) einzuführen. Die daraus resultierende PCR-Produkte (IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG) wurden in pBAD33 geklont, wie oben beschrieben. In-vitro-Transkripte wurden mit der T7 RNA-Polymerase transkribiert: Erstens PCR-Produkte wurden synthetisiert mit Primer 5A, 5C, 5D, 5E, 5F oder 5 + 6 mithilfe der konstruierten Vektoren als Vorlage. Die daraus resultierende PCR-Produkte dienten als Vorlagen für die T7-RNA-Polymerase. In-vitro-transkribiert CsgD -Wildtyp und Mutanten RNAs wurden gereinigte, radioaktiven und gemischte mit steigende Konzentrationen von gereinigtem Hfq. Die Hybridisierung Reaktionen waren laufen auf nicht Denaturierung Gele und visualisiert. Die erhöhten K-d-Werte der mutierten Allele beweist, dass Hfq weniger effizient an die Mutanten bindet. Darüber hinaus hat Hfq mehrere Bindungsstellen an CsgD , die durch die 3 Schichten beobachtet für den Wildtyp RNA gezeigt wird. Jedoch nur 2 Bindungsstellen für die verschiedenen Mutante RNAs eingehalten werden (Abbildung 4;4geändert). So, die Site-verwiesene mutagenen Ansatz identifiziert primären bzw. sekundären Strukturen der CsgD mRNA, die für die vollständige Bindung der Hfq wichtig sind.
Zusammengenommen ist es möglich, die Site-verwiesene Mutagenese mit einem 2 - oder 3-Schritt-PCR-Ansatz in Verbindung mit nachgeschalteten Assays, biologische Schlüsse über die Genregulation posttranskriptionale Ebene sowie Protein-RNA-Interaktionen durchführen .
| Schritt | Temperatur | Zeit |
| Anfängliche Denaturierung | 98° C | 2 min |
| Denaturierung | 98° C | 10 s |
| Glühen | 55° C | 10 s |
| Erweiterung | 72° C | 15 s |
| (30 Zyklen) | ||
| Letzte Erweiterung | 72° C | 5 min |
| Halten | 4 ° C |
Tabelle 1: PCR-Programm
| Reagenz | Kontrollreaktion | 20 Fmol Reaktion | 100 Fmol Reaktion |
| 10-fach Ligase Puffer | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Vektor-DNA verdaut | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Verdaute PCR-Produkt | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | Zu 19 µL | Zu 19 µL | Zu 19 µL |
| Ligase | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tabelle 2: Ligatur Reaktionen
| Primer-name | Sequenz | Verwendet für - Mutationen | ||
| 2-1A oder 3-1A | DCGKGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - und 3-Runde PCR auf csgD | ||
| 2-3A oder 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - und 3-Runde PCR auf csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3 Runden PCR auf CsgD – ersetzt 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3 Runden PCR auf CsgD – ersetzt 4 nt | ||
| 3-1 B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3 Runden PCR auf McaS | ||
| 3-4 B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3 Runden PCR auf McaS | ||
| 3-2 B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3 Runden PCR auf McaS – ersetzt 4 nt | ||
| 3-3 B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3 Runden PCR auf McaS – ersetzt 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-Runde PCR auf CsgD – löscht 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-Runde PCR auf CsgD – ersetzt 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-Runde PCR auf CsgD – löscht 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-Runde PCR auf CsgD – löscht 9 nt und Ersatzstoffe 7 nt | ||
| 2: 2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-Runde PCR auf CsgD – löscht 9 nt und Ersatzstoffe 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabelle 3: Primer für Site-verwiesene Mutagenese und T7 Vorlage Synthese verwendet
Fett: Anerkennung Beschränkungsenzymsites (BamHI und PstI AatII)
Unterstrichen: Nukleotid-Mutationen
Abbildung 1: PCR-Strategie für Site-verwiesene Mutagenese. (A) drei Primer sind in der 2-Schritt-PCR-Ansatz verwendet, um Site-verwiesene Mutationen zu einem gen des Interesses zu stellen. Primer 1 und 3 verstärkt das Gen (PCR-Produkt ich), während Primer 2 spezifische Mutationen (*) einführt. Primer-Paaren 1 + 2 verstärkt ein kleines Fragment an beiden Enden der DNA des Interesses, PCR-Produkt II (Schritt 1) zu synthetisieren. Das daraus resultierende PCR-Produkt dient dann als Grundierung mit Primer 3, um PCR-Produkt III mit der Website gerichtet Mutation integriert (Schritt 2) zu synthetisieren. (B) vier Zündkapseln werden in der 3-Schritt-PCR-Ansatz zur Site-verwiesene Mutationen zu einem gen des Interesses zu stellen. Primer 1 und 4 verstärkt das Gen (PCR-Produkt ich), während Primer 2 und 3 führt spezifische Mutationen (*). Primer-Paaren 1 + 2 und 3 + 4 sind in den beiden ersten Schritten der PCR verwendet werden, um PCR-Produkt synthetisieren II und III (Schritt 1 & 2). Im dritten Schritt werden PCR-Produkte II und III als Vorlage mit Primerpaar 1 + 4 zur PCR Produkt IV mit der Site-verwiesene Mutation integriert (Schritt 3) zu synthetisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: PCR-Produkte von Site-verwiesene Mutagenese. PCRs wurden mit Primer und Vorlagen wie im Text beschrieben durchgeführt. PCR-Produkte wurden auf einem 2 % Agarose-Gel mit Interkalation Bromid laufen (~ 0,5 µg/mL) mit 1 µg DNA-Leiter (Table of Materials) mischen. Richtige Größe Bänder sind mit einem roten Quadrat gekennzeichnet. (A) in den meisten PCR-Reaktionen ist nur ein Band der richtigen Größe sichtbar. PCR-Reaktion IVB hat jedoch zwei sichtbare Bands, von denen die Top-Band (knapp über 300 bp) hat die richtige Länge. Wie erwartet, die Summe der Länge der PCR-Produkte II und IIIC gleich der Länge des PCR-Produkte I und IV (A: CsgD PCR Produkte, B: McaS PCR Produkte, I: Wildtyp CsgD/McaS verstärkt mit Primer 1A/B + 4A/B, II + III: fortgeschrittene PCR-Produkte verstärkt mit Primer 1A/B + 2A/B und 3A/B + 4A/B, bzw. IV: mutierte PCR-Produkt verstärkt mit Primer 1A/B + 4A/B mit der PCR-Zwischenprodukte II und III als Vorlagen). In allen PCR-Reaktionen ist nur ein Band der richtigen Größe sichtbar. In diesem Fall wurden fast alle Moleküle der PCR-Produkte, die PCR-Reaktionen III II hinzugefügt zur PCR-Produkte III zu synthetisieren. Nur für PCR IIIE PCR-Produkt IIE noch sichtbar ist (IA: Wildtyp CsgD PCR-Produkt verstärkt mit Grundierung 1A + 3A, IIC-G: Zwischenprodukte PCR verstärkt mit Grundierung 1A + 2 C-G, IIIC-G: mutiert PCR Produkte verstärkt mit Grundierung 3A mit PCR-Produkte IA und IIC-G als Vorlagen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: In-vivo Experiment mit Site-verwiesene CsgD und McaS Mutanten. Western-Blot Analyse der Stämme beherbergen angegebenen Vektoren. Stämme wurden auf exponentielle Phase gewachsen und für 10 min mit 1 mM IPTG (McaS), gefolgt von 5 min Induktion mit 1 mM Arabinose (CsgD) induziert. Α-FLAG Antikörper wurden verwendet, um die Flagge markiert CsgD und α-GroEL Antikörper wurden verwendet, um das Zimmermädchen Protein GroEL (10.000 bis 50.000 Mal bzw. verdünnt). Maus und Kaninchen HRP-konjugierten Antikörpern dienten als sekundäre Antikörper (2.000-Mal verdünnt). Diese Zahl wurde von2geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: In-vitro- Experiment mit Site-verwiesene CsgD Mutanten. EMSA von in-vitro-Transkription CsgD Wildtyp (WT) und Mutant (Panel C-G) RNAs in Bezug auf Hfq Bindung. Die CsgD Allele (WT und Mutant C-G) waren radioaktiv und gemischt mit 0, 0,25, 0,5, 1 oder 2 µM Monomere Hfq. Hybridisierung Reaktionen auf nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele ausgeführt wurden. Die relative Intensität der verschobenen Bands wurde quantifiziert und eine sigmoid Kurve wurde ausgestattet, um die Daten. Dissoziation wurden konstant (Kd) Zeitwerte mit SigmaPlot. Diese Zahl wurde von4geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Site-verwiesene Mutagenese hat eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten, und hier, repräsentative Ergebnisse aus in-vivo und in vitro-Experiment wurden als Beispiele für biologische Schlüsse mit Hilfe der Technik aufgenommen. Site-verwiesene Mutagenese ist seit lange der goldene Standard für RNA-Wechselwirkungsstudien. Die Stärke des Verfahrens liegt in der Kombination der relevanten Mutationen mit nachgeschalteten Tests und Experimenten (z. B. western-Blot oder EMSA) Rückschlüsse auf bestimmte DNA-Websites und ihre Bedeutung in Funktionen der Genprodukte in Einführung Frage. Bei der Entscheidung, Site-verwiesene Mutagenese zu tun, sollte das Design der Primer sorgfältig geplant werden, um die Technik für eine erfolgreiche Arbeit (z. B. welche Seiten zu mutieren); Achten Sie darauf, gehören die richtige Überhänge und Restriktionsschnittstellen und achten die Grundierung/Vorlage Eigenschaften.
Die tatsächliche Mutagenese beschrieben in diesem Protokoll stützt sich auf PCR. Der wichtigste Teil des Protokolls ist daher die Voraussetzungen dafür. Es gibt mehrere Möglichkeiten der Optimierung der PCR, einschließlich Gradienten der Mg2 + Konzentrationen, DMSO-Konzentration und Temperaturen glühen Schritt. Für weitere Details siehe3. Neben der Optimierung der PCR-Reaktion selbst, sind zwei Dinge lohnt sich sicher wann tut Site-verwiesene Mutagenese: hochwertige Vorlagen und sorgfältig gestaltete Primer.
Mit einer qualitativ hochwertigen Vorlage für PCR oft Unterschied der zwischen einer gescheiterten und erfolgreichen PCR. Es ist, zwar möglich, eine Zelle lysate zu verwenden, um die DNA-Vorlage bereitzustellen gereinigte DNA (genomische-, Vektor oder PCR-DNA) ist immer vorzuziehen. Darüber hinaus, wenn es um die Höhe der Vorlage geht, ist oft weniger mehr; vor allem im letzten Schritt der 3-Stufen-PCR (Schritt 4.2.5). Zum Beispiel versuchen Sie, eine 10-fach Verdünnungsreihe der Vorlage, um das Optimum zu finden, falls erforderlich.
Optimale besser gekleideteres Design hängt von Eigenschaften der DNA des Interesses und Polymerase. Wann immer möglich, versuchen Sie immer, Primer entsprechend zu gestalten. Jedoch in vielen Fällen Primer müssen an einem bestimmten Standort ausgelegt und können daher nicht nach bestimmten Kriterien gestaltet werden. In diesen Fällen ist es notwendig, mehr zu tun wäre Optimierung der PCR Bedingungen statt (siehe oben und Protokoll über PCR-6), aber mit den richtigen Bedingungen auch schwierige PCRs sind in der Regel erfolgreich.
Mehrere Alternativen für die Site-verwiesene Mutagenese zur Verfügung stehen, wie z. B. Kunkels Methode10, ganze Plasmid Mutagenese11, Kassette Mutagenese12, de-Novo-Gensynthese und CRISPR13,14.
Kunkels Methode und ganze Plasmid Mutagenese stützt sich auf die DNA des Interesses wird bereits in ein Plasmid (Vektor) und Primer verwendet, um jeweils eine Einzelstrang oder Doppelstrang der mutierter DNA zu synthetisieren. In beiden Techniken wird das gesamte Plasmid synthetisiert und zur Transformation, während 2 oder 3-stufige PCR nur die DNA-Stück von Interesse synthetisiert. Ein Nachteil des 2 - oder 3-Step PCR, ist, dass die DNA des Interesses zweimal, erhöht das Risiko von Mutationen darin synthetisiert werden muss. Auf der anderen Seite muss das Plasmid nicht synthetisiert werden, wodurch das Risiko von Mutationen hier stattdessen. Darüber hinaus muss verwenden die 2 oder 3-stufige PCR, eine Wildtyp-Variante nicht vorher in einen Vektor geklont werden senken dadurch die cloning-Zeit um einige Tage.
Kassette Mutagenese verlässt sich nicht auf die Verwendung von Primern oder Polymerasen. Stattdessen ist ein kleines DNA-Fragment de Novo synthetisiert und in die DNA des Interesses mit der Verwendung von Restriktionsenzymen integriert. Diese Methode beruht jedoch auf das Vorhandensein von geeigneten Restriktionsschnittstellen in der Nähe der gezielten Website, die nicht immer vorhanden ist. Dieser Ansatz erfordert auch die Wildtyp-Variante in den Vektor im Voraus, Erhöhung der cloning-Zeit im Vergleich zu den 2 oder 3-Stufen-PCR-Methode geklont werden.
Mit den sinkenden Kosten für de-Novo-Gen-Synthese (große DNA-Fragmente) wird es zunehmend erschwinglich zu Mutationen führen durch die Bestellung der gewünschten Reihenfolge im Handel. Diese Methode ist allerdings noch teuer gegenüber die anderen genannten Methoden. Zur Zeit des Schreibens de Novo ist Synthese ca. 3 Mal teurer als die hier vorgestellte Methode.
Eine weitere neue Option ist die mit Spannung erwartete CRISPR-Methode für Genom-Änderungen. Diese Methode ist sehr effizient und anpassungsfähig im Vergleich zu anderen Techniken für eukaryotische Zellen verwendet. CRISPR ist mit relativer Leichtigkeit und vielen verfügbaren Techniken zum Klonen in einfacher Organismus als Bakterien, jedoch selten besser geeignet als herkömmliche Klonen. Somit hängt die Nützlichkeit der CRISPR meist auf den Organismus untersucht.
Bei der Auswahl, Site-verwiesene Mutagenese zu tun, ist es wichtig, sie sorgfältig zu gestalten; sowohl in Bezug auf downstream-Anwendungen sowie die eigentliche Technik verwendet. Die hier beschriebene 2 - und 3-stufige PCR-Methode gilt für fast jede Mutation Studie und mit seiner geringen Kosten eignet sich für jedes Labor Budget.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten University of Southern Denmark open-Access-Politik Zuschüsse zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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