Summary
사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.
Abstract
사이트 지시 된 mutagenesis은 작은 비 코딩 ribonucleic 산 (요 스르나.) 분자와 대상 메신저 RNAs (mRNAs) 간의 상호 작용을 조사 하기 위하여 DNA에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기술입니다. 또한, 사이트 지시 된 mutagenesis는 RNA를 특정 단백질 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용 됩니다. 돌연변이의 2 단계와 3 단계 PCR 기반 소개 설명 되어 있습니다. 접근은 모든 단백질-RNA와 RNA RNA 상호 작용 연구에 관련이 있다. 즉, 기술 설계 뇌관 원하는 mutation(s)와 돌연변이 PCR 제품을 합성 하는 PCR의 2 또는 3 단계를 통해 사용 합니다. PCR 제품은 복제에 사용 됩니다. 여기, 우리는 요 스르나., McaS, 그리고 mRNA, csgD, RNA RNA와 RNA-단백질 상호 작용을 조사 하는 돌연변이 소개 하는 두 2 및 3 단계 접근 방식으로 mutagenesis 사이트 감독을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리 조사 RNA 상호 작용;이 기법을 적용 그러나, 기술은 모든 mutagenesis 연구 (예를 들어, DNA 단백질 상호 작용, 아미노 산 대체/삭제/추가)에 적용 됩니다. 비 자연 기지를 제외 하 고 돌연변이의 어떤 종류를 소개 수 있지만 기술은만 경우 적용 PCR 제품 다운스트림 응용 프로그램 (예: 복제 추가 PCR에 대 한 서식 파일)에 사용할 수 있습니다.
Introduction
DNA는 종종 라고 합니다 살아있는 세포의 청사진 때문에 모든 구조는 세포의 DNA의 순서에 인코딩됩니다. 정확한 복제 및 DNA 수리 메커니즘 코딩된 유전자의 정확한 기능 유지에 필수적입니다, 돌연변이의 매우 낮은 요금 발생 확인 합니다. DNA 순서의 변화 다음 (자료 쌍 complementarity 그리고 이차 구조 변경) RNA 및 단백질 (아미노산 DNA 전사 요소와 제한 효소 (인식)로 시작 하는 서로 다른 수준에서 연속 함수에 영향을 미칠 수 있습니다. 산 성 대체, 삭제, 추가 또는 프레임 교대). 많은 돌연변이 유전자 기능을 크게 미치지 않습니다, 그러나 일부 돌연변이 DNA에서 거 대 한 의미를 가질 수 있습니다. 따라서, 사이트 지시 된 mutagenesis 모든 수준에서 특정 DNA 사이트의 중요성을 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.
이 프로토콜에는 특정 돌연변이 소개 하는 데 사용 하는 타겟된 mutagenesis 접근 방식을 설명 합니다. 두 개의 서로 다른 PCR 전략에 의존 하는 프로토콜: 2 단계 또는 3 단계 PCR. 2 단계 PCR는 적용 가능한 경우 원하는 돌연변이의 DNA의 3' 끝 또는 5' 끝은 (< 200 기본적인 쌍 (bp) 끝에서) 3 단계 PCR 모든 경우에 적용 됩니다.
2 단계 PCR 방법에서 3 프라이 머는, 있는 뇌관의 한 세트의 (뇌관 1, 3, 앞으로 및 역방향, 각각), DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다 및 단일 뇌관은 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. 뇌관 (뇌관 2)을 소개 하는 돌연변이 돌연변이 5' 끝과 앞으로 방향 경우 경우 돌연변이 3' 끝은 역 방향이 있어야 합니다. 첫 번째 PCR 단계에서 뇌관 1 + 2 또는 2 + 3 각각 5' 끝 또는 3' 끝, 가까이 작은 파편을 증폭 한다. 유래 PCR 제품은 뇌관 1 또는 3, 관심 (그림 1A)의 DNA에 돌연변이와 PCR 제품에 따라서 결과와 2 단계에서 뇌관으로 사용 됩니다.
3 단계 PCR에 있는 뇌관의 1 세트는 (뇌관 1, 4, 앞으로 및 역방향, 각각)의 DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다. 4 뇌관 설계는 뇌관의 1 세트는 겹치는 complementarity 특정 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. (2, 3, 뇌관 역 그리고 앞으로, 각각). 1 및 2 단계에서 뇌관 1 + 2 및 3 + 4 증폭 5'과 3' 끝. 3 단계에서 로부터 유래 PCR 제품 1 단계 고 2는 사용 뇌관 1 + 4와 증폭. 따라서, 결과 PCR 제품은 원하는 돌연변이 (그림 1B)에 대 한 관심의 DNA 이다.
돌연변이 DNA 모든 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다,이 프로토콜에 다시 클로닝 벡터에는 DNA를 결합 하는 방법을 설명 합니다. 클로닝 벡터의 사용 복제의 용이성 등 몇 가지 장점이 및 벡터의 기능에 따라 특정 실험적인 응용 프로그램. 이 기능은 RNA 상호 작용 연구를 위해 자주 사용 됩니다. RNA 상호 작용 연구에 대 한 또 다른 기술은 다른 RNA1,2 또는 단백질3,4단지에서 RNA의 구조 조사입니다. 그러나, 구조 조사만 수행 됩니다 생체 외에서 반면 사이트 지시 된 mutagenesis와 후속 복제 허용 상호 작용 연구에 대 한 vivo에서.
사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 하 게 사용 되었습니다 RNA 상호 작용 연구로 여기에 제시. 그러나, 주요 방법에 관한 2-또는 3-단계 PCR는 DNA의 어떤 조각에 적용 이며 따라서 RNA 상호 작용 연구에 제한 뿐만 아니라.
기술과 그것의 가능한 사용을 예증 하 지역에 mRNA, 대장균 (대장균)의 csgD 의 post-transcriptional 규제에 대 한 중요 한 특성은 사용 됩니다. 대장균, csgD에서 대상 이다 작은 비 코딩 RNA, McaS, 단백질, Hfq, CsgD2,,45의 단백질 발현을 억 누르기 위해 협력. 기술은은 돌연변이 csgD , McaS, 사이 베이스 페어링 지역 그리고 csgD의 Hfq 바인딩 사이트에 소개 하는 데 사용 됩니다. 얻은 DNA는 다음 후속 실험에 적합 한 벡터에 복제 됩니다. 기술은의 다운스트림 응용 프로그램에는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 포함 됩니다. 이해를 돕기 위해 예제 1은 생체 조건 서쪽 오 점 분석 결과 사용 하 여 특징 하 고 예제 2 생체 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)를 사용 하 여 특징입니다. 두 경우 모두, 그것은 그림된 어떻게 사이트 감독 mutagenesis 관심의 유전자에 대 한 생물 학적 결론을 다른 기술 함께에서 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 벡터 선택
- 다운스트림 실험을 수행 하는 벡터를 선택 하십시오. 모든 벡터는이 2 및 3 단계 PCR 방법에 적용 됩니다.
- 벡터의 선택에 따라 달라 집니다, 복제에 대 한 적절 한 제한 효소를 선택 합니다.
2. 뇌관 디자인 사이트에 대 한 감독 mutagenesis
- 중 2 단계 또는 3 단계 PCR 전략 사이 결정 (2 단계는 돌연변이 < 200 bp의 DNA의 양쪽 끝에서). 2 단계 PCR를 위한 단계 2.2 이동한 3 단계 PCR를 위한 2.3 단계로 이동 합니다.
- 2 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
- 뇌관 1과 3의와 5' DNA 증폭을 돌출 하는 디자인 관련 제한 인식 사이트 선택한 벡터에 복제 하는 데 필요한 다음 4 뉴클레오티드 (예: ATAT 또는 AGCT)를 포함 합니다.
- 원하는 사이트에 mutation(s)를 소개 하 고 양쪽에 10-15 보완 뉴클레오티드와 돌연변이 측면 2 뇌관 디자인. 뇌관 역 돌연변이 5' 끝에 도입 하는 경우 또는 돌연변이 3' 끝에 도입 하는 경우 전달 합니다.
- 3 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
- 뇌관 1과 4의와 5' DNA를 증폭 하는 돌출 하는 디자인 관련 제한 인식 사이트 선택한 벡터에 복제 하는 데 필요한 다음 4 뉴클레오티드 (예: ATAT 또는 AGCT)를 포함 합니다.
- 2와 3을 원하는 사이트에서 mutation(s)를 소개 하 고 양쪽에 10-15 보완 뉴클레오티드에 의해 돌연변이 측면 뇌관 디자인. 뇌관 2와 3는 무료 리버스.
3. PCR 증폭 야생 타입 DNA 복제의
참고:에 대 한 내용은 PCR,6참조.
- PCR6 뇌관 1 + 2 (2-단계 PCR) 또는 1 + 4 (3 단계 PCR)를 사용 하 여 수행 하 고 표 1에 PCR 프로그램 PCR 제품 I. 사용을 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여.
- Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
- 1 x 트리 아세테이트 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (태) 버퍼의 100 mL 당 agarose의 2 세대를 추가 하 여는 agarose 젤 솔루션 (2%)을 확인 합니다. 렌지에 끓는 agarose를 녹. DNA 얼룩 염료 ethidium 평범한 사람 추가 (의 최종 농도에 ~ 0.5 µ g/mL)에 agarose 젤 시각화를 위한 솔루션.
- Agarose 젤을 캐스팅 하 고 전기 단위에 PCR (DNA 로드 염료와 혼합) 및 알려진된 크기의 DNA 사다리 로드. 때까지 밴드, 적절 하 게 구분 되 고 밴드는 자외선 (UV) 테이블에서 또는 젤 이미징 시스템을 시각화 75 W 45 분, 또는에서 샘플을 실행 합니다.
- 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
- 5 단계에서 사용된까지 순화 된 DNA-20 ° c (에서 트리 스-EDTA (테) 버퍼-장기 저장) 또는 4 ° C (dH2O-단기 저장)를 저장 합니다.
4. PCR는 DNA에 돌연변이 사이트 감독을 소개 하
- 2 단계 PCR 위한 PCR (3 단계 PCR는 단계 4.2 참조)
- PCR6 돌연변이 5' 끝에 또는 2 + 3 변이 있는 3' 끝 및 PCR 제품 II를 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여 뇌관 1 + 2를 사용 하 여 수행 (PCR 프로그램 표 1 참조).
- 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
- 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
- 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계에서 사용된까지.
- PCR6 돌연변이 뇌관 1 변이 3' 끝에 있으며 야생 타입 DNA PCR 제품 III를 템플릿으로 사용 하는 경우 또는 5' 끝에 경우 2 뇌관 3 함께 뇌관으로 PCR 제품을 사용 하 여 수행 (PCR 프로그램에 대 한 표 1 참조).
- 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
- 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
- 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계까지.
- 3 단계 PCR 위한 PCR
- PCR6 별도 반응에서 1 + 2 및 3 + 4 뇌관을 사용 하 여 수행 하 고 PCR 제품을 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여 II 및 III (PCR 프로그램 표 1 참조).
- 3.2.1, 3.2.2 단계 에서처럼 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 PCRs를 확인 합니다.
- 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
- 저장소 (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 DNA를 정화.
- PCR6 뇌관 1 + 4를 사용 하 여 수행 하 고 PCR 제품 4 세를 (같은 반응)에서 템플릿으로 두 PCR 제품 II 및 III의 2-5 ng를 사용 하 여 (PCR 프로그램 표 1 참조).
- 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
참고: 그것은 (때때로 줄일 수 있습니다 더 적은 서식 파일을 사용 하 여) 여러 잘못 된 밴드를 예외적입니다. 그러나, 잘못 된 PCR 제품 올바른 크기의 밴드 excised 젤 추출 경우 무시할 수 있습니다. - 경우 올바른, 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
- 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계까지.
5. 야생 유형 및 선택한 벡터에 DNA의 돌연변이 체 버전의 재결합
참고: 다음 단계에서 자세한7참조.
- 다이제스트는 I 및 III (2 단계 PCR)에서 PCR 제품을 정화 및 관련 제한 효소를 사용 하 여 (에서 3 단계 PCR) 4.
- 각 제한 효소, 30-60 분 동안 37 ° C에서 PCR 제품의 다이제스트 200 ng의 1 µ L로 소화 버퍼 x 1의 20 µ L에서.
- 젤 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 젤 추출 하 여 소화 PCR 제품을 정화, 순화 된 DNA의 DNA 농도 측정 (자료 테이블), 분 광 광도 계 또는 및 저장 (TE 버퍼)에-20 ° C에서 4 ° C (dH2 O) 단계 5.6 사용 될 때까지.
- 소화 관련 제한 효소 정화 벡터와 벡터 다시 결 찰 이벤트 감소 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 함께. 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 PCR 제품을 취급 하지 않습니다.
- 소화 버퍼 1 µ L의 각 제한 효소와 알칼리 성 인산 가수분해 효소, 30-60 분 동안 37 ° C에서 벡터의 다이제스트 1000 ng의 1 µ L x 1의 30 µ L에서.
- (예: 포경된 벡터 및 컷 아웃 DNA) 폐기물 DNA에서 별도 소화 벡터 단계 3.2.1, 3.2.2에서 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여.
- 젤 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 젤 추출 하 여 소화 벡터를 정화, 순화 된 DNA의 DNA 농도 측정 (자료 테이블), 분 광 광도 계 또는 및 저장 (TE 버퍼)에-20 ° C에서 4 ° C (dH2O) 때까지 단계 5.6 사용.
- 표 2에 지정 된 반응 소화 벡터에 소화 PCR 제품을 선.
- 2 시간에 16 ° c.에 하룻밤 실 온에서 품 어
- 결 찰 반응 받는 사람 부담 (예를 들면, 대장균 K12)를 변환 합니다.
- OD600스트레인 성장 = 0.3-0.5 및 전송 1 mL 리가 반응으로 많은 1.5 mL 튜브에 문화.
- 5 분 동안 3500 x g 에서 회전 시키십시오 그리고 상쾌한 삭제.
- 변환 버퍼 (10 mL의 0.1 g/mL 폴 리 에틸렌 글리콜 3350, 5% 디 메 틸 황산 염 및 20 m m MgCl2lysogeny 국물 (파운드))의 200 μ 셀 resuspend
- 결 찰 반응, 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 2 분 42 ° c.에 대 한 열 충격
- 1.5 mL 튜브에 파운드의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 45 분 동안 항생제 내성의 phenotypic 식 수
- 3500 x g 5 분에 세포를 스핀, 상쾌한의 1 mL를 폐기 하 고 나머지 상쾌한 셀 resuspend.
- 적절 한 항생제와 함께 접시에 셀 접시 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- Transformants 벡터 DNA의 삽입 (예: 벡터 및 삽입 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR)의 성공적인 통합을 은닉을 식별 합니다.
- 생어에 의해 DNA의 순서를 확인 연속.
주의: 시퀀싱 단계 5.9에 사용 된 동일한 뇌관을 사용 하지 마십시오.
6. 사용 하 여 생성 된 벡터 생체 외에서 또는 vivo에서 실험에 대 한
- 생체 조건 실험
참고:이 야생 타입/돌연변이 RNA post-transcriptional 레 귤 레이 션 특성을 표현 하는 벡터를 사용 하는 예제입니다. 에 대 한 자세한 내용은 서 부 럽,8을 참조 하십시오.- 적절 한 매체에서 생성 된 벡터와 대장균 K12 긴장을 성장 하 고 필요한 경우 식을 유도. 원심 분리에 의해 샘플을 수확.
- SDS 샘플 버퍼 x 1 펠 릿 세포를 용 해 하 여 나트륨 라우릴 황산 염-polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 대 한 샘플을 준비 (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 2.5 %SDS, 0.002 %bromophenol 블루, β-mercaptoethanol 5%, 10% 글리세롤) 5 대 95 ° C에서 비등 하 고 분입니다.
참고: 젤을 캐스팅 하거나 상업적으로 이용 가능한 캐스트 젤을 사용 하 여 가능 하다. 후자는 그림 3 (자료 테이블)에서 제시 하는 결과에 사용 되었다. - 로드 107 셀 (단백질 사다리를 포함 하는) 별도 우물에 각 샘플의 고 단백질 (약 45 분) 분리 될 때까지 200 V에서 젤을 실행 합니다.
- 오 점 80에서 세미 드라이 송금으로 셀 루 로스 멤브레인에 단백질 1 h mA.
- 단백질 (예: 5%-분유 1 x Tween 20 Tris 버퍼 식 염 수 (TTBS) 버퍼에 녹아 있는)의 혼합물으로 막을 차단 합니다.
- 1 차적인 항 체 (1 x TTBS 버퍼에 녹아 있는) 대상 (예를 들어, GFP, 플래그 또는 HIS 태그 단백질) 관심사의 단백질을 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다.
- 언바운드 항 체를 제거 하는 10 분 1 x TTBS에 멤브레인을 씻어. 두 번 더 반복 합니다.
- 이차 항 체 (1 x TTBS 버퍼에 용 해)을 대상으로 1 차 항 체를 추가 하 고 검색을 허용 (예: 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-2 차 항 체를 활용. 부드러운 동요와 1 시간에 품 어.
- 언바운드 항 체를 제거 하는 10 분 1 x TTBS에 막 씻으십시오. 두 번 더 반복 합니다.
- (예를 들어, HRP 활용 된 이차 항 체를 사용 하는 경우에 luminol 파생 된 화학으로 부 화 후 이미징)에 의해 2 차 항 체와 호환 기술로 막 시각화.
- 생체 외에서 실험
참고:이 템플릿으로 사용 하 여 벡터는 RNA의 생체 외 녹음 방송을 위한 RNA-단백질 상호 작용의 특성의 예입니다. 에 대 한 자세한 내용은 EMSA,9을 참조 하십시오.- 템플릿으로 생체 외 녹음 키트 (자료 테이블)에 5 단계에서 벡터 t 7을 사용 하 여 생체 외에서 성적을 확인 합니다.
- 4.5 %7 M 요소 젤, 변성 시키기에 페이지에 의해 RNA 사본 하 고 투 석 튜브 (자료 테이블)와 함께 전기 차입에 의해 RNA 젤에서 직접 추출 합니다.
- RNA를 레이블 (예: γ-32P-ATP radiolabeling T4 polynucleotide 키 (테이블의 재료)를 사용 하 여 고 열 (자료 테이블) 다시 정화.
주의: 방사성 물질을 사용 하기 전에 로컬 방사선 안전 관리와 상담. - 셔 서 RNA 바인딩 버퍼 (20 mM Tris, pH 8, 100 m KCl, 1 mM MgCl2, 1 m m dithiothreitol (DTT) m) x 1에 있는 별도 반응에 단백질의 농도 증가 함께 믹스.
참고: 발표 결과 (그림 4), 2에서 mRNA 0 ~ 2 µ M Hfq 단백질 (단위체 농도)의 그라데이션으로 혼합 했다 방사선된 csgD의 nM. - 단백질 및 RNA 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 교 잡 믹스를 로드 하기 전에 교배 하 여 200 V 1.5 h를 위한 젤을 실행 하실 수 있습니다.
- 시각화 기술 단계 6.1.3에서에서 라벨 호환 젤. (예를 들어, 의해 phosphoimaging radiolabeling 적용 된 경우).
- 프로그램을 처리 하는 영상과 이동된 밴드의 상대 강도 계량 하 고 곡선 (자형) 그래프를 사용 하 여 데이터 및 데이터 분석 소프트웨어 (자료 테이블). 맞춤된 곡선에 따라 분리 상수 (Kd) 값 확인할 수 있습니다 자동으로 소프트웨어와 함께.
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Representative Results
이중 벡터 설정 선택 되었다 csgD 의 post-transcriptional 규정에 관한 RNA 상호 작용을 조사 하기: 하나 csgD 표현 하 mRNA 및 다른 작은 비 코딩 RNA, McaS 표현 하. csgD pBAD33, 페니 저항 arabinose 유도할 수 있는 매체 복사 플라스는으로 복제 했다 및 McaS는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도할 수 있는 낮은 사본 플라스 미드는 미니 R1 pNDM220으로 복제 했다와 암 피 실린 저항입니다. 야생 타입 csgD 는 PCR 뇌관 1A, 4A를 사용 하 여 증폭 (4A 플래그 시퀀스 포함) 동안 야생 타입 McaS PCR PCR 제품 IB를 뇌관 1B와 4B를 사용 하 여 증폭 PCR 제품 IA, 항복. 3 단계 PCR 전략 소개 csgD , McaS. 의 예측된 자료 페어링 지역에서 대체 하는 데 사용 되었다 2 첫 번째 단계에서 IIA 및 IIIA PCR 제품 각각 뇌관 1A + 2A, 3A, 4A를 사용 하 여 합성 했다. 세 번째 단계에서 PCR 제품 IVA 뇌관 (그림 2A)으로 서식 파일 및 1A, 4A IIA 및 IIIA PCR 제품을 사용 하 여 합성 되었다. 마찬가지로, 무료 사이트 이동 돌연변이 McaS, PCR 제품 IIB, 첫 번째 두 단계에서 IIIB와 세 번째 단계 (그림 2A)에서 IVB를 뇌관 1B, 2B, 3B, 4B를 사용 하 여 도입 되었다. pBAD33 및 PCR 제품 IA 및 IVA BamHI와 PstI 소화 했다 고 소화 IA 및 IVA 소화 pBAD33으로 출혈 했다. 결과 구문 pBAD csgD플래그 와 pBAD csgD63-66FLAG (위치 63-66 transcriptional 시작 사이트에서 돌연변이)에 선정 됐다. pNDM220 및 PCR 제품 IB IVB AatII와 BamHI 소화 했다 고 소화 IB와 IVB 소화 pNDM220으로 출혈 했다. 결과 구문 pNDM mcaS 및 pNDM-mcaS42-45 (42-45 transcriptional 시작 사이트 위치에서 돌연변이)에 선정 됐다.
돌연변이의 효과 시험 하 대장균 변종 pBAD csgD플래그 또는 pBAD csgD63-66FLAG 및 pNDM220, pNDM-mcaS 또는 pNDM-McaS42-45 은닉 OD 에 0.2% 글리세롤과 보충 M9 최소한의 매체에서 성장 했다 450 0.4의. PNDM-벡터에서 다음 1mm arabinose의 추가 의해 1 mM pBAD-벡터의 5 분 유도 뒤 IPTG의 추가 의해 10 분 유도 했다. 이 시점에서, 샘플 했다 수확 하 고 수확 샘플 서쪽 오 점 분석 수행. 동안 야생 타입 McaS 표현의 야생 타입 CsgD의 번역을 방지, CsgD 또는 McaS에 돌연변이의 소개 관찰된 억압을 완화 한다. 그러나, CsgD의 CsgD, McaS 변환 억압에 변이 보완 하는 때 복원 됩니다 (그림 3;2에서 수정). 따라서, 사이트 감독 mutational 접근 그 McaS csgD 기지-쌍이이 지역에서 가설을 지원합니다.
PBAD33 벡터 생체 조건 실험에 대 한 선정 및 또한 사용 되었다 소개 사이트 이동 돌연변이 csgD에 Hfq-바인딩 조사를 mRNA 생체 외에서. 사이트 이동 돌연변이 복사할 때 변경 된 기본 및 보조 구조와 csgD 돌연변이 RNAs를 생성 하는 2 단계 PCR 전략으로 도입 되었다. 뇌관 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F 또는 2 세대의 5' 끝에 돌연변이 소개 하 고 증폭 하는 데 사용 했다 csgD. 결과 PCR 제품 (IIC, IID, IIE, IIF 및 IIG) 뇌관 3 템플릿 전체 csgD DNA (그림 2B)에 돌연변이 소개 하 고 증폭으로 사용 되었다. 위에서 설명한 대로 결과 PCR 제품 (IIIC, IIID, IIIE, IIIF와 IIIG) pBAD33으로 복제 했다. T7 RNA 중 합 효소와 생체 외에서 성적 변하게 했다: 첫째, PCR 제품 종합 되었다 뇌관 5A, 5, 5, 5E, 5 층 또는 5G + 6 템플릿으로 생성 된 벡터를 사용 하 여. 결과 PCR 제품 T7 RNA 중 합 효소에 대 한 템플릿으로 사용 되었다. 생체 외에서 복사할 수 csgD 야생 유형 및 돌연변이 RNAs 순화 Hfq의 증가 농도 정화, 방사선 및 혼합 했다. 교 잡 반응 비 변성 시키기 젤에서 실행 그리고 시각. 증가 된 Kd-돌연변이 체 대립 유전자의 가치 증명 Hfq 돌연변이를 덜 효율적으로 바인딩합니다. 또한, Hfq csgD 야생 타입 RNA에 대 한 관찰 3 교대에 의해 표시 되는 몇 가지 바인딩 사이트 있다. 그러나, 단지 2 바인딩 사이트 다른 돌연변이 RNAs에 대 한 관찰 된다 (그림 4;4에서 수정). 사이트 감독 mutational 접근 csgD 의 기본 및 보조 구조를 식별 하는 따라서, mRNA Hfq의 완전 한 바인딩을 위해 중요 한.
함께 찍은, 그것은 2 또는 3 단계 PCR 방법 사이트 감독 mutagenesis 다운스트림 분석 실험 단백질 RNA 상호 작용 뿐만 아니라 post-transcriptional 수준에서 유전자 규칙에 대 한 생물 학적 결론을 함께에서 수행할 수 .
| 단계 | 온도 | 시간 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 2 분 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s |
| 어 닐 링 | 55 ° C | 10 s |
| 확장 | 72 ° C | 15 s |
| (30 주기) | ||
| 마지막 확장 | 72 ° C | 5 분 |
| 보류 | 4 ° C |
표 1: PCR 프로그램
| 시 약 | 컨트롤 반응 | 20 fmol 반응 | 100 fmol 반응 |
| 리가 버퍼 x 10 | 2 Μ L | 2 Μ L | 2 Μ L |
| 벡터 DNA를 소화 | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| 소화 PCR 제품 | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | 19 µ L를 | 19 µ L를 | 19 µ L를 |
| 리가 | 1 Μ L | 1 Μ L | 1 Μ L |
표 2: 결 찰 반응
| 뇌관 이름 | 시퀀스 | 사용-돌연변이 | ||
| 2-1A 또는 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2-, 3-라운드 PCR csgD 에 | ||
| 2-3A 또는 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2-, 3-라운드 PCR csgD 에 | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | csgD -에 3 라운드 PCR 대체 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | csgD -에 3 라운드 PCR 대체 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
McaS에 3 라운드 PCR | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | McaS에 3 라운드 PCR | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | McaS-에 3 라운드 PCR 대체 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | McaS-에 3 라운드 PCR 대체 4 nt | ||
| 2-2 C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | csgD -에 2 라운드 PCR 삭제 11 nt | ||
| 2 2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -에 2 라운드 PCR 대체 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -에 2 라운드 PCR 삭제 11 nt | ||
| 2-2 층 | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | csgD -에 2 라운드 PCR 9 삭제 nt 및 대용 7 nt | ||
| 2-2 G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -에 2 라운드 PCR 9 삭제 nt 및 대용 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5 C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5 D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5 층 | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5 G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
표 3: 뇌관 사이트 지시 된 mutagenesis와 T7 템플릿 합성 사용
대담: 제한 효소 인식 사이트 (BamHI, PstI 및 AatII)
밑줄된: 뉴클레오티드 돌연변이
그림 1: PCR 전략 사이트 지시 된 mutagenesis. A) 3 뇌관 사이트 이동 돌연변이 유전자에 관심의 소개를 2 단계 PCR 방법에 사용 됩니다. 뇌관 1와 3는 유전자 증폭 (PCR 제품 나), 뇌관 2 특정 변이 (*)를 소개 하는 동안. 뇌관 쌍 1 + 2 증폭 PCR 제품 II (1 단계) 합성의 DNA의 양쪽 끝에 작은 조각. 유래 PCR 제품은 PCR 제품 III 사이트 이동 돌연변이 통합 (2 단계)와 합성 뇌관 3 함께 뇌관으로 사용 됩니다. B) 4 개의 뇌관 사이트 이동 돌연변이 유전자에 관심의 소개 3 단계 PCR 방법에 사용 됩니다. 뇌관 1와 4는 유전자 증폭 (PCR 제품 나), 프라이 머 2와 3에서는 특정 변이 (*). 뇌관 쌍 1 + 2 3 + 4 PCR 제품 합성 PCR의 두 가지 첫 번째 단계에서 사용 됩니다 II 및 III (단계 1 및 2). 세 번째 단계에서 PCR 제품 II 및 III PCR 제품 4 사이트 이동 돌연변이 통합 (3 단계)와 합성 뇌관 쌍 1 + 4와 함께 템플릿으로 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 사이트 지시 된 mutagenesis에서 PCR 제품. PCRs는 뇌관 및 템플릿 텍스트에 설명 된 대로 수행 했다. Ethidium 평범한 사람으로 2 %agarose 젤에 PCR 제품 실행 (~ 0.5 µ g/mL) 1 µ g의 DNA 사다리와 함께 혼합 (자료 테이블). 정확한 크기 밴드는 빨간색 사각형으로 표시 됩니다. A) 대부분 PCR 반응에에서는 올바른 크기의 하나의 밴드 표시 됩니다. 그러나, PCR 반응 IVB의 두 보이는 밴드는 최고 밴드 (바로 위에 300 bp) 올바른 길이 있다. 예상 했던 대로, PCR 제품 II 및 IIIC의 길이의 합계 PCR 제품의 길이를 같게 하는 I와 IV (a: csgD PCR 제품, b: McaS PCR 제품, i: 야생 타입 csgD/McaS 뇌관 1A/B + 4A/B, II + III를 사용 하 여 증폭: PCR 제품 중간 각각에, 뇌관 1A/B + 2A/B와 3A/B + 4A/B를 사용 하 여 증폭 IV: 돌연변이 PCR 제품 템플릿 II 및 III 중간 PCR 제품 뇌관 1A/B + 4A/B를 사용 하 여 증폭). 모든 PCR 반응에는 올바른 크기의 하나의 밴드 표시 됩니다. 이 경우에, II PCR 반응 III에 추가 하는 PCR 제품의 거의 모든 분자 합성 PCR 제품 III에 사용 되었다. 만 대 한 PCR IIIE PCR 제품 IIE 여전히 표시 (IA: 야생 타입 csgD PCR 제품 뇌관 1A + 3A, IIC-g: 중간 PCR 제품은 뇌관 1A를 사용 하 여 증폭을 사용 하 여 증폭 + 2 C-G, IIIC g: 돌연변이 PCR PCR 제품 IA 뇌관 3A를 사용 하 여 증폭 하는 제품 그리고 템플릿 IIC G)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 생체 조건 실험 사이트 감독 csgD와 McaS 돌연변이. 지정 된 벡터를 은닉 하는 긴장의 서쪽 오 점 분석입니다. 종자 고 1mm IPTG (McaS)와 10 분 뒤에 1mm arabinose (csgD)와 함께 5 분 유도 유도 지 수 단계 성장 했다. Α-플래그 항 체 플래그 태그 CsgD를 대상 하는 데 사용 했다 그리고 α GroEL 항 체 가사 단백질 GroEL (각각 10000 및 50000 시간, 희석)를 대상으로 사용 되었다. 마우스와 토끼 HRP 활용 된 항 체는 2 차 항 체 (2, 000 배 희석)으로 사용 되었다. 이 그림2에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 생체 외에서 실험 사이트 감독 csgD 돌연변이 함께. 생체 외에서 베낀된 csgD 야생 유형 (WT) 및 Hfq 바인딩 관련 돌연변이 (패널 C-G) RNAs의 EMSA. CsgD 대립 유전자 (WT 및 돌연변이 C G) 방사선 그리고 혼합 0, 0.25, 0.5, 1 또는 2 µ M 단위체 Hfq 하이브리드 반응 polyacrylamide 젤 비 변성 시키기에서 실행 했다. 이동한 밴드의 상대 강도 계량 하 고 sigmoid 곡선 데이터를 장착 했다. 분리 상수 (Kd) 값 SigmaPlot을 사용 하 여 결정 했다. 이 그림은4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 한 다른 응용 프로그램, 그리고 여기, 대표는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 결과 기술을 사용 하 여 생물학적 결론을 확인 하는 방법의 예제로 포함 했다. 사이트 지시 된 mutagenesis는 오랫동안 RNA 상호 작용 연구에 대 한 황금 표준 되었습니다. 기술의 강점 다운스트림 분석 실험 및 실험 (예를들면, 서쪽 오 점 또는 EMSA)에 유전자 제품의 기능에 특정 DNA 사이트 및 그들의 중요성에 대 한 결론과 관련 된 돌연변이 소개의 조합에 질문입니다. 프라이 머의 디자인 기술에서 가장 얻을 수 신중 하 게 계획 되어야 할 사이트 지시 된 mutagenesis 결정할 때 (예: 어떤 사이트를 변형); 반드시 올바른 돌출부 등 금지 사이트 뇌관/템플릿 특성에 주의 하 라.
이 프로토콜에서 설명 하는 실제 mutagenesis PCR에 의존 합니다. 프로토콜의 가장 중요 한 부분이입니다 따라서이 대 한 조건. PCR, Mg2 + 농도, DMSO 농도 및 어 닐 링 단계의 온도 그래디언트를 포함 한 최적화의 방법은 여러 가지가 있습니다. 자세한 사항은3을 참조 하십시오. PCR 반응 자체의 최적화, 외 두 가지 mutagenesis 사이트 감독을 하 고 있을 때 확실히 만드는 가치가 있다: 높은-품질 템플릿과 신중 하 게 설계 된 뇌관.
종종 PCR에 대 한 높은-품질 서식 파일 데 실패 하 고 성공적인 PCR 사이 차이 만들어. DNA 템플렛을 제공 하는 세포 lysate를 사용할 수 있지만, 정화 DNA (게놈-, 벡터-또는 PCR DNA)이 항상 바람직합니다. 또한, 서식 파일의 금액에 관해서, 종종 더 적은 이다; 특히에서 3 단계 PCR (단계 4.2.5)의 마지막 단계. 예를 들어, 서식 파일을 필요 하다 면 최적의 방법을 찾기의 10 배 희석 시리즈를 보십시오.
최적의 뇌관 디자인 관심 및 중 합 효소의 DNA의 특성에 따라 달라 집니다. 가능 하다 면, 항상 따라 뇌관을 디자인 하려고 합니다. 그러나, 많은 경우에 뇌관 그리고 특정 사이트에서 설계 되어야 합니다 하지 특정 기준에 따라 설계 될 따라서 수 있습니다. 이러한 경우에, 그것은 더 많은 일을 해야 할 수도 있습니다 PCR의 최적화 조건 대신 (PCR6프로토콜 및 위 참조), 하지만 오른쪽 조건 조차 어려운 PCRs는 일반적으로 성공.
에 대 한 여러 가지 대체 방법을 사이트 감독 mutagenesis Kunkel의 방법10, 전체 플라스 미드 mutagenesis11, 카세트 mutagenesis12, 데 노 보 유전자 합성 CRISPR13,14등 사용할 수 있습니다.
Kunkel의 방법 및 전체 플라스 미드 mutagenesis 이미 플라스 미드 (벡터)에 있는 관심사의 DNA에 의존 하 고 뇌관을 사용 하 여 단일 가닥 또는 돌연변이 DNA의 이중 가닥을 각각 합성을. 두 기술의 전체 플라스 미드 되 고 합성 및 사용에 대 한 변환, 반면 2 또는 3 단계 PCR만 관심의 DNA 조각을 합성. 불리는 2-또는 3-스텝의 PCR, 그 관심의 DNA 해야 합니다 합성 수, 두 번 거기에 돌연변이의 위험을 증가 이다. 다른 한편으로, 플라스 미드는 없습니다 합성 수를 따라서 대신 여기 돌연변이의 위험을 낮추는. 또한, 2-또는 3-단계 PCR를 사용 하 여, 야생 타입 변종 필요 하지 않습니다 미리, 벡터에 복제할 따라서 며칠 여 복제 시간을 낮추는.
카세트 mutagenesis 뇌관 또는 polymerases의 사용에 의존 하지 않습니다. 대신, 작은 DNA 조각 드 노 보 합성 및 제한 효소의 사용으로 관심사의 DNA에 통합 이다. 그러나이 메서드는, 적당 한 제한 사이트 근처에 항상 존재 하는 대상된 사이트의 존재에 의존 합니다. 이 방법은 벡터 미리, 2 또는 3 단계 PCR 방법에 비해 복제 시간에 복제를 야생 타입 변종을 필요 합니다.
드 노 보 유전자 합성 (큰 DNA 파편)의 감소 비용, 그것을 원하는 시퀀스를 상업적으로 주문 하 여 돌연변이 소개 점점 더 저렴 한 되고있다. 그러나이 방법은,, 여전히 비용 비교 언급 하는 다른 방법. 드 노 보를 쓰기의 때에 합성은 여기에 제시 된 방법 보다 약 3 배 더 비싼.
또 다른 신흥 옵션 게놈 변경에 대 한 높은 기대 CRISPR 방법입니다. 이 방법은 매우 효율적 이며 진 핵 세포를 위해 사용 하는 다른 기술에 비해 적응. 그러나,이 상대적으로 완화와 박테리아로 간단한 유기 체에서 복제에 대 한 많은 사용 가능한 기술, CRISPR 전통적인 복제 보다 더 적합 한 거의 이다. 따라서, CRISPR의 유용성은 주로 유기 체 공부 되 고에 따라 다릅니다.
사이트 지시 된 mutagenesis 할 선택할 때 신중 하 게, 그것을 디자인 하는 것이 중요 하다 다운스트림 응용 프로그램 뿐만 아니라 실제 기술 사용에 관해서는 둘 다. 여기 설명 하는 2 및 3 단계 PCR 방법을 거의 모든 돌연변이 연구에 적용 이며 자사의 저렴 한 비용으로 어떤 실험실 예산에 적당 하다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 남쪽 덴마크의 대학 오픈 액세스 정책 보조금을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
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- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
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- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
