Summary
Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.
Abstract
Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no DNA para investigar a interação entre pequenas moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) não-codificantes e alvo mensageiro RNAs (mRNAs). Além disso, mutagenesis local-dirigido é usado para mapear locais obrigatórios de proteína específica de RNA. Uma introdução de PCR com base em etapas 2 e 3-etapa de mutações é descrita. A abordagem é relevante para todas as proteínas-RNA e estudos de interação RNA-RNA. Em suma, a técnica baseia-se na elaboração de cartilhas com o mutation(s) desejado e através de 2 ou 3 passos de PCR sintetizar um produto PCR com a mutação. O produto do PCR é usado para clonagem. Aqui, descrevemos como executar o mutagenesis local-dirigido com a abordagem de 2 e 3 passos para introduzir mutações a sRNA, McaS e o mRNA, csgD, para investigar o RNA-RNA e RNA-proteína interações. Podemos aplicar esta técnica para investigar interações de RNA; no entanto, a técnica é aplicável a todos os estudos de mutagênese (por exemplo, interações DNA-proteína, amino-ácido adição/exclusão/substituição). É possível introduzir qualquer tipo de mutação exceto bases não-natural, mas a técnica só é aplicável se um produto PCR pode ser usado para aplicação a jusante (por exemplo, clonagem e modelo para mais de PCR).
Introduction
DNA é muitas vezes referida como a estrutura de uma célula viva, uma vez que todas as estruturas da célula são codificadas na sequência de seu DNA. Replicação exata e mecanismos de reparo do DNA certifique-se de que só muito baixas taxas de mutações ocorrem, que é essencial para sustentar as funções corretas dos genes codificados. Alterações da sequência de DNA podem afetar funções sucessivas em diferentes níveis, começando com o DNA (reconhecimento por enzimas de restrição e fatores de transcrição), em seguida RNA (alterações de estrutura secundária e complementaridade de pares de base) e/ou proteínas (amino ácido substituições, supressões, adições ou quadro-turnos). Enquanto muitas mutações não afetam significativamente a função do gene, algumas mutações no DNA podem ter implicações enormes. Assim, o mutagenesis local-dirigido é uma ferramenta valiosa para estudar a importância dos locais específicos do DNA em todos os níveis.
Este protocolo descreve uma abordagem de mutagénese alvo usada para introduzir mutações específicas. O protocolo se baseia em duas diferentes estratégias PCR: um 2-passo ou um passo 3-PCR. Passo 2 PCR é aplicável se a mutação desejada está perto da extremidade 5' ou extremidade 3' do DNA de interesse (< 200 pares de bases (bp) da extremidade) e o PCR do passo 3-é aplicável em todos os casos.
Na abordagem PCR no passo 2, 3 primeiras demão são projetadas, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 3, para a frente e reverso, respectivamente), e um único primer é projetado para incorporar a mutação. A mutação, apresentando a primeira demão (cartilha 2) deve ter uma orientação reversa, se a mutação é perto da extremidade 5' e uma orientação para a frente se a mutação está perto da extremidade 3'. Na primeira etapa do PCR, cartilha 1 + 2 ou 2 + 3 amplifica um fragmento pequeno perto da extremidade 5' ou 3' final, respectivamente. O produto resultante da PCR é usado como um primer na etapa dois com primer 1 ou 3, resultando em um produto PCR com uma mutação no DNA de interesse (figura 1A).
No passo 3-PCR, 4 cartilhas destinam-se, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 4, para a frente e reverso, respectivamente) e um conjunto de primers é projetado para incorporar mutações específicas com sobreposição de complementaridade (primers, 2 e 3, reverter e encaminhar, respectivamente). Na etapa 1 e 2, as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 amplificam a extremidade 5' e 3'. No terceiro passo, os produtos resultantes da PCR de passo um e dois são usados como modelos e amplificado com iniciadores 1 + 4. Assim, o produto resultante da PCR é o DNA de interesse com a mutação desejada (figura 1B).
Enquanto o DNA modificado pode ser usado para qualquer aplicação a jusante, este protocolo descreve como re-combinar o DNA em um vetor de clonagem. A utilização de vectores de clonagem tem diversas vantagens tais como facilidade de clonagem e aplicações experimentais específicas dependendo de características do vetor. Esse recurso é usado frequentemente para estudos de interacção de RNA. Outra técnica para estudos de interação RNA está sondando estruturais do RNA em complexo com outro RNA1,2 ou proteína3,4. No entanto, sondagem estrutural só é executada em vitro considerando mutagenesis local-dirigido e clonagem subsequentes permitem estudos de interação in vivo.
Mutagenesis local-dirigido tem sido extensivamente usado para estudos de interação RNA como apresentado aqui. No entanto, o método chave sobre 2 ou 3-passos PCR é aplicável a qualquer pedaço de DNA e, portanto, não apenas limitada a estudos de interação com o RNA.
Para exemplificar a técnica e seus possíveis usos, caracterização de regiões importantes para regulação pós-transcricional do mRNA, csgD, de Escherichia coli (e. coli) é usada. Em e. coli, csgD destina-se a pequeno RNA não-codificante, McaS, em cooperação com uma proteína, Hfq, para reprimir a expressão da proteína de CsgD2,4,5. A técnica é usada para introduzir mutações para a região de base-emparelhamento entre csgD e McaS e o sítio de ligação do Hfq de csgD. O DNA obtido é então clonado em um vetor apropriado para experimentos subsequentes. Aplicações a jusante da técnica incluem experimentos in vivo e in vitro. Para ilustração, exemplo 1 é caracterizado em in vivo usando um ensaio de borrão ocidental e exemplo 2 caracteriza-se in vitro usando um ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA). Em ambos os casos, é ilustrado o mutagenesis local-dirigido como pode ser usado em combinação com outras técnicas para fazer conclusões biológicas sobre um gene de interesse.
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Protocol
1. seleção do vetor
- Escolha um vetor para realizar experimentos a jusante com. Qualquer vetor é aplicável para este método PCR de 2 e 3 passos.
- Com base na escolha do vetor, escolha as enzimas de restrição apropriadas para clonagem.
2. projeto primer para site dirigido mutagênese
- Decidir entre a estratégia do PCR-passo 2 ou 3 (2-passo é apenas para as mutações < 200 bp de ambas as extremidades do DNA de interesse). Para a PCR 2-passo, vá para o passo 2.2 e para o PCR do passo 3-Vá para o passo 2.3.
- Desenho de primers para PCR 2-passo.
- Projeto cartilha 1 e 3 para amplificar o DNA de interesse e com uma 5' saliência que contém 4 nucleotídeos (por exemplo, ATAT ou AGCT) seguidos pelo site reconhecimento relevante restrição necessário para clonar no vetor escolhido.
- Projeto cartilha 2 introduzir mutation(s) no site desejado e flanquear a mutação com 10-15 nucleotídeos complementares em ambos os lados. Fazer o primer reverso se a mutação é introduzida na extremidade 5' ou encaminhar se a mutação é introduzida na extremidade 3'.
- Desenho de primers para PCR de 3 etapas.
- Projeto cartilha 1 e 4 para amplificar o DNA de interesse e com uma 5' saliência que contém 4 nucleotídeos (por exemplo, ATAT ou AGCT) seguidos pelo site reconhecimento relevante restrição necessário para clonar no vetor escolhido.
- O projeto da primeira demão, 2 e 3 para apresentar mutation(s) no site desejado e flanquear a mutação por 10-15 nucleotídeos complementares em ambos os lados. Cartilha 2 e 3 são inverter complementares.
3. amplificação por PCR selvagem do tipo de DNA para clonagem
Nota: Para obter detalhes sobre o PCR, ver6.
- Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 2 (2-passo PCR) ou 1 + 4 (passo 3-PCR) e usar o DNA de tipo selvagem como modelo para obter PCR produto eu uso o programa PCR na tabela 1.
- Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose.
- Fazer um agarose gel de solução (2%) pela adição de 2 g de agarose por 100 mL de 1 x Tris-Acetato-ácido etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) (TAE) buffer. Dissolva o agarose fervendo em um forno de microondas. Adicionar o DNA de coloração tintura brometo de etídio (para uma concentração final de ~ 0,5 µ g/mL) do gel de agarose a solução para visualização.
- Conversão de gel de agarose, colocá-lo em uma unidade de eletroforese e carregar amostras PCR (misturadas com corante de carregamento de DNA) e uma escada de DNA de tamanho conhecido. Execute amostras em 75 W para 45 min, ou até bandas são separadas adequadamente e visualizar as faixas em uma tabela de raios ultravioleta (UV) ou com um gel de sistema de imagem.
- Purificar o produto PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
- Armazene o DNA purificado a-20 ° C (em tampão Tris-EDTA (TE) – armazenamento de longo prazo) ou a 4 ° C (em dH2O – armazenamento de curto prazo) até usado na etapa 5.
4. PCR apresentar local-dirigido mutações no DNA
- PCR para o passo 2 PCR (consulte a etapa 4.2 para o passo 3-PCR)
- Realizar PCR6 usando cartilhas 1 + 2, se as mutações são na extremidade 5' ou 2 + 3 se as mutações são em 3' acabar e usar o DNA de tipo selvagem como um modelo para obter o produto do PCR II (ver tabela 1 para o programa PCR).
- Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificar o produto PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
- Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até usado na etapa 5.
- Realizar PCR6 usando o produto do PCR II como o primer juntamente com a primeira demão 3 se as mutações são na extremidade 5' ou cartilha 1 se as mutações na extremidade 3' e usam o DNA de tipo selvagem como modelo para obter o produto do PCR III (ver tabela 1 para programa PCR).
- Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificar o produto do PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
- Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até o passo 5.
- PCR para o passo 3-PCR
- Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 em reações separadas e usar o DNA de tipo selvagem como modelo para obter o produto do PCR II e III (ver tabela 1 para o programa PCR).
- Valide o PCRs por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificar os produtos de PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
- Loja purificado DNA a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O).
- Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 4 e usar 2-5 ng de ambos os produtos PCR, II e III como os modelos (na mesma reação) para obter o PCR produto IV (ver tabela 1 para o programa PCR).
- Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
Nota: Não é incomum obter várias bandas incorretas (às vezes pode ser reduzido pelo uso de menos modelo). No entanto, os produtos PCR incorretos podem ser ignorados se a banda corretamente tamanho é excisada e gel-extraído. - Se correto, purificar o produto do PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
- Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até o passo 5.
5. recombinação de tipo selvagem e mutante versão (ões) do DNA para o vetor escolhido
Nota: Para obter detalhes sobre as etapas a seguir, consulte7.
- Digest purificado produtos do PCR I e III (da etapa 2 PCR) e/ou IV (do passo 3-PCR) utilizando as enzimas de restrição relevantes.
- Em 20 µ l de tampão de digestão 1x com 1 µ l de cada enzima de restrição, digerir 200 ng do produto do PCR a 37 ° C por 30-60 min.
- Purificar o produto PCR digerido por gel-extração usando um kit de extração do gel (Tabela de materiais), medir a concentração de DNA de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais) e armazenar a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2 O) até utilizada para etapa 5.6.
- Digerir o vetor purificado com enzimas de restrição relevantes e tratar com a fosfatase alcalina para diminuir o vetor da re-ligadura eventos. Não trate os produtos de PCR com a fosfatase alcalina.
- Em 30 µ l de tampão de digestão com 1 µ l de cada enzima de restrição e 1 µ l de fosfatase alcalina, digerir 1.000 ng do vetor a 37 ° C por 30-60 min de 1x.
- Vetor digerido separada de resíduos de DNA (por exemplo, vetor sem cortes e recortada DNA) usando a eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificar o vetor digerido por gel-extração usando um kit de extração do gel (Tabela de materiais), medir a concentração de DNA de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais) e armazenar a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até utilizada para etapa 5.6.
- Ligate produtos PCR digeridos em vetor digerido com as reações especificadas na tabela 2.
- Incubar a temperatura ambiente por 2 horas ou durante a noite a 16 ° C.
- Transforme o destinatário estirpe (por exemplo, Escherichia coli K12) com reações de ligadura.
- Crescer a tensão para OD600= 0.3-0.5 e transferência um 1ml cultura para tubos de 1,5 mL como muitos como reações de ligase.
- Girar a 3.500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 200 μL de tampão de transformação (10 mL de caldo de lisogenia (LB) com 0,1 g/mL polietilenoglicol 3350, 5% dimetil sulfato e 20 mM MgCl2).
- Adicionar a reação da ligadura e coloque os tubos no gelo por 30 min.
- Calor-choque por 2 min a 42 ° C.
- Adicionar 1 mL de LB para os tubos de 1,5 mL e permitir a expressão fenotípica da resistência aos antibióticos pelo menos 45 min a 37 ° C.
- Girar as células a 3.500 x g por 5 min, rejeitar 1 mL do sobrenadante e ressuspender as células no sobrenadante restante.
- As células em placas com antibióticos apropriados da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Identifica transformants abrigar vetores com integração bem sucedida de inserção de DNA (por exemplo, por PCR utilizando primers específicos do vetor e inserção).
- Validar a sequência de DNA por sanger sequenciamento.
Atenção: Não use os mesmos primers para sequenciamento como usado para etapa 5,9.
6. usando vetores construídos para experimentos in vitro ou in vivo
- Experimento in vivo
Nota: Este é um exemplo do uso de um vetor para expressar o tipo selvagem/mutação RNA para caracterizar o Regulamento pós-transcricional. Para mais detalhes sobre a mancha ocidental, ver8.- Crescer estirpes de Escherichia coli K12 com vetores construídos em meio apropriado e induzir a expressão, se necessário. Colheita de amostras por centrifugação.
- Preparar amostras para eletroforese em gel poliacrilamida – sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), dissolvendo-se aglomerados de células em tampão de amostra SDS 1x (pH de 62,5 mM Tris-HCl 6,8, 2,5% SDS, azul de bromofenol 0,002%, 5% β-Mercaptoetanol, 10% de glicerol) e ferver a 95 ° C por 5 min.
Nota: É possível converter um gel ou use um gel pré-fabricado comercialmente disponível. O último foi usado nos resultados apresentados na Figura 3 (Tabela de materiais). - Carregar 107 células de cada amostra em separado wells (incluem uma escada de proteína) e funcione o gel a 200 V, até que as proteínas são separadas (aproximadamente 45 min).
- Borre as proteínas para uma membrana de celulose por transferência semi seca em 80 mA por 1h.
- Bloquear a membrana com uma mistura de proteínas (por exemplo, 5% leite em pó dissolvido em 1 x Tween 20-Tris-buffered saline (TTBS) buffer).
- Adicione o anticorpo primário (dissolvido em 1 x TTBS buffer) que a proteína de interesse (por exemplo, GFP, bandeira ou HIS-etiquetado proteína) de destino e incubar durante 1 h com agitação suave.
- Lave a membrana em 1 x TTBS por 10 min para remover anticorpos não acoplados. Repita duas vezes mais.
- Adicione o anticorpo secundário (dissolvido em 1 x TTBS buffer) que tem como alvo os anticorpos primários e permitir detecção (por exemplo, com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados com anticorpos secundários. Incube durante 1 h com agitação suave.
- Lave a membrana em 1 x TTBS por 10 min para remover anticorpos não acoplados. Repita duas vezes mais.
- Visualize a membrana com uma técnica compatível com os anticorpos secundários (por exemplo, imagem latente após incubação com uma derivado de luminol quimioluminescência, se utilizou-se um anticorpo secundário conjugado HRP).
- Experimento in vitro
Nota: Este é um exemplo do uso do vetor como um modelo para in vitro a transcrição do RNA para caracterizar as interações RNA-proteína. Para mais detalhes sobre EMSA, consulte9.- Fazer transcrições in-vitro usando um T7 em vitro kit de transcrição (Tabela de materiais) e vetores da etapa 5 como modelos.
- Separar os transcritos de RNA por página em uma ureia de 7m 4,5% gel de desnaturação e extrair o RNA diretamente do gel por eluição de electro com tubos de diálise (Tabela de materiais).
- Rotular o RNA (por exemplo, radioativos com γ -32P-ATP usando quinase T4-polinucleotídicas (Tabela de materiais) e purificar novamente com colunas (Tabela de materiais).
Atenção: Antes de trabalhar com material radioativo, consulte-se com o oficial de segurança de radiação local. - Misture rotulados-RNA com concentrações crescentes de proteína nas reações distintas em um tampão de ligação (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1mm ditiotreitol (DTT)) 1x.
Nota: nos resultados apresentados (Figura 4), 2 nM de radiolabeled csgD mRNA foi misturado com um gradiente de proteína de Hfq 0 a 2 µM (concentração de monômero). - Permitir que a proteína e RNA para cruzar antes de carregar o mix de hibridação em gel de poliacrilamida não-desnaturação e executar o gel para 1,5 h a 200 V.
- Visualize o gel com uma técnica compatível com a marcação de passo 6.1.3. (por exemplo, por phosphoimaging se radioativos foi aplicada).
- Quantificar a intensidade relativa das bandas deslocadas com uma programa de processamento de imagem e ajustar uma curva (sigmoidal) para os dados usando um gráfico e software de análise de dados (Tabela de materiais). Com base na curva equipada, valores (Kd) constantes de dissociação podem ser determinados automaticamente com o software.
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Representative Results
Para investigar interações RNA sobre regulação pós-transcricional do csgD, foi escolhida uma configuração de duplo vetor: um para expressar o csgD mRNA e outra para expressar o pequeno RNA não-codificante, McaS. csgD foi clonado em pBAD33, que é um plasmídeo de médio-cópia inducible arabinose com resistência ao cloranfenicol e McaS foi clonado em mini pNDM220 R1, que é um plasmídeo de cópia baixa inducible isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) com resistência à ampicilina. Tipo selvagem csgD foi PCR amplificado utilizando primers 1A e 4A (4A inclui uma bandeira-sequência) para produzir IA do produto PCR, enquanto o tipo selvagem McaS foi PCR amplificado utilizando primers 1B e 4B para produzir o produto do PCR IB. A estratégia PCR 3 passos foi usada para introduzir substituições na região de base-emparelhamento prevista de csgD e McaS. Nas duas primeiras etapas, os produtos de PCR IIA e IIIA foram sintetizados usando as primeiras demão 1A + 2A e 3A e 4A, respectivamente. Na terceira etapa, o produto do PCR IVA foi sintetizado usando produtos do PCR IIA e IIIA como modelo e 1A e 4A como primeiras demão (Figura 2A). Da mesma forma, mutações local-dirigido complementares foram introduzidas no McaS, usando as primeiras demão 1B, 2B, 3B e 4B para produzir produtos do PCR IIB, IIIB, nas duas primeiras etapas e IVB na terceira etapa (Figura 2A). pBAD33 e produtos PCR IA e IVA foram digeridos com BamHI e PstI e o digerido IA e IVA foram ligados em pBAD33 digerido. Resultante de construções foram nomeadas pBAD-csgDbandeira e pBAD-csgD63-66FLAG (uma mutação na posição 63-66, relativo para o local de início transcriptional). pNDM220 e produtos PCR IB e IVB foram digeridos com AatII e BamHI e digerido IB e IVB foram ligados em pNDM220 digerido. Resultante de construções foram nomeadas pNDM-mcaS e pNDM-mcaS42-45 (uma mutação na posição 42-45 em relação ao início transcriptional local).
Para analisar o efeito das mutações, estirpes de Escherichia coli , abrigando o pBAD-csgDbandeira ou pBAD-csgD63-66FLAG e pNDM220, pNDM-mcaS ou pNDM-McaS42-45 foram cultivadas em M9 mínimo suplementado com 0,2% de glicerol para OD 450 de 0,4. Expressão de pNDM-vetores em seguida foi induzido por 10 min pela adição de 1 mM IPTG seguido de indução de 5 min dos vetores-pBAD pela adição de arabinosa de 1 mM. Neste ponto, as amostras foram colhidas e análise ocidental do borrão foi executada com as amostras colhidas. Enquanto expressão de tipo selvagem McaS impede a tradução de tipo selvagem CsgD, introdução de mutações em CsgD ou McaS alivia a repressão observada. No entanto, quando as mutações são complementadas na repressão traducional tanto CsgD e McaS de CsgD é restaurada (Figura 3; modificado de2). Assim, a abordagem mutacional local-dirigido suporta a hipótese que McaS e csgD -pares de bases na região.
O vetor de pBAD33 foi escolhido para o experimento in vivo e também foi usado para a introdução de mutação sítio-dirigida para investigar Hfq-ligação para o csgD mRNA in vitro. Local-dirigido mutações foram introduzidas com a estratégia PCR 2-passo para gerar csgD mutante RNAs com estruturas primárias e/ou secundárias alteradas quando transcritas. As primeiras demão 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F ou 2G foram usados para amplificar e introduzir mutações à extremidade 5' do csgD. Os produtos resultantes da PCR (IIC, IID, IIE, IIF e IIG) foram usados como modelos com primer 3 para amplificar e introduzir mutações para o inteiro csgD DNA (Figura 2B). Os produtos resultantes da PCR (IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG) foram clonados em pBAD33 como descrito acima. In vitro transcrições foram transcritas com o T7 RNA-polimerase: primeiro, os produtos de PCR foram sintetizados com primeiras demão 5A, 5C, 5D, 5E, 5F ou 5 + 6 usando os vetores construídos como modelo. Os produtos resultantes da PCR foram usados como modelos para o T7 RNA-polimerase. Em vitro transcrito csgD tipo de selvagem e mutante RNAs foram purificada, radiolabeled e misturado com aumento das concentrações de Hfq purificado. As reacções de hibridização foram executadas em géis não-desnaturação e visualizadas. O aumento de Kd-valores dos alelos mutantes prova que Hfq vincula-se menos eficiente para os mutantes. Além disso, Hfq tem vários sítios de ligação na csgD que é mostrado pelos 3 turnos observados para o tipo selvagem do RNA. No entanto, apenas 2 locais obrigatórios são observados para o mutante diferente RNAs (Figura 4; modificado de4). Assim, a abordagem mutacional local-dirigido identifica estruturas primárias e/ou secundárias do csgD mRNA que são importantes para a ligação completa do Hfq.
Tomados em conjunto, é possível executar o mutagenesis local-dirigido com uma abordagem PCR de 2 ou 3 passos em combinação com a jusante ensaios tornar biológicas conclusões sobre regulação gênica a nível pós-transcricional, bem como interações proteína-RNA .
| Passo | Temperatura | Tempo |
| Desnaturação inicial | 98° C | 2 min |
| Desnaturação | 98° C | 10 s |
| Recozimento | 55° C | 10 s |
| Extensão | 72° C | 15 s |
| (30 ciclos) | ||
| Extensão final | 72° C | 5 min |
| Segure | 4 ° C |
Tabela 1: Programa PCR
| Reagente | Reação de controle | reação de 20 fmol | reação de 100 fmol |
| 10x buffer de ligase | 2 Μ l | 2 Μ l | 2 Μ l |
| Digerido vector DNA | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Produto PCR digerido | fmol 0 | 20 fmol | fmol 100 |
| H2O | A 19 µ l | A 19 µ l | A 19 µ l |
| Ligase | 1 Μ l | 1 Μ l | 1 Μ l |
Tabela 2: Reações de ligadura
| Nome da primeira demão | Sequência de | Usado para - mutações | ||
| 1A-2 ou 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - e 3-rodada PCR na csgD | ||
| 2-3A ou 4A-3 | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - e 3-rodada PCR na csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-rodada PCR na csgD – substitui 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-rodada PCR na csgD – substitui 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-rodada PCR no McaS | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-rodada PCR no McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-rodada PCR no McaS – substitui 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-rodada PCR no McaS – substitui 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-redonda PCR na csgD – exclui 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-redonda PCR na csgD – substitui 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-redonda PCR na csgD – exclui 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-redonda PCR na csgD – exclui 9 nt e substitutos 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-redonda PCR na csgD – exclui 9 nt e substitutos 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabela 3: Primers utilizados para o mutagenesis local-dirigido e síntese de modelo T7
Negrito: sites de reconhecimento da enzima de restrição (BamHI, PstI e AatII)
Sublinhado: mutações nucleotídicas
Figura 1: estratégia PCR para o mutagenesis local-dirigido. A) três primeiras demão são usadas na abordagem PCR no passo 2 para introduzir mutações local-dirigido a um gene de interesse. As primeiras demão 1 e 3 amplifica o gene (produto do PCR eu), enquanto a cartilha 2 apresenta mutações específicas (*). Pares da primeira demão 1 + 2 amplifica um pequeno fragmento em ambas as extremidades do DNA de interesse para sintetizar o produto do PCR II (etapa 1). O produto resultante da PCR é usado como um primer juntamente com a primeira demão 3 para sintetizar o produto do PCR III com a mutação sítio dirigido incorporada (etapa 2). B) quatro cartilhas são usadas na abordagem PCR no passo 3-para introduzir mutações local-dirigido a um gene de interesse. As primeiras demão 1 e 4 amplifica o gene (produto do PCR eu), enquanto as primeiras demão 2 e 3 introduz mutações específicas (*). Pares da primeira demão 1 + 2 e 3 + 4 são usados nos dois primeiros passos do PCR para sintetizar o produto do PCR II e III (etapa 1 & 2). Na terceira etapa, os produtos de PCR II e III são usados como modelo com par de primer 1 + 4 para sintetizar IV de produto PCR com a mutação sítio-dirigida incorporada (etapa 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: produtos do PCR do mutagenesis local-dirigido. PCR foram realizada com primers e modelos conforme descrito no texto. Produtos PCR foram executados em um gel de agarose 2% com brometo de etídio (~ 0,5 µ g/mL) com 1 µ g de escada de DNA mix (Mesa de materiais). Bandas de tamanho correto são marcadas com um quadrado vermelho. A) para a maioria das reações de PCR apenas uma banda do tamanho correto é visível. No entanto, a reação de PCR IVB tem duas bandas visíveis de que a banda superior (apenas acima de 300 bp) tem o comprimento correto. Como esperado, a soma do comprimento dos produtos PCR II e IIIC igual ao comprimento dos produtos PCR, I e IV (r: os produtos de PCR csgD , b: McaS PCR produtos, i: tipo selvagem csgD/McaS amplificado usando as primeiras demão 1A/4A + B/B, II + III: PCR produtos intermédios amplificado usando as primeiras demão 1A/B + 2A/B e B + 4A/3A/B, respectivamente, IV: mutante produto PCR amplificado usando as primeiras demão 1A/B + 4A/B com os produtos PCR intermédios II e III como modelos). Em todas as reações de PCR apenas uma banda do tamanho correto é visível. Neste caso, quase todas as moléculas dos produtos PCR que II adicionado para reações de PCR III foram usadas para sintetizar produtos do PCR III. Apenas para PCR IIIE é produto do PCR IIE ainda visível (IA: produto PCR do tipo selvagem csgD amplificado usando primer 1A + 3A, CII-g.: produtos intermédios da PCR amplificados utilizando cartilha 1A + 2 C-G, IIIC-g: uma mutação PCR produtos amplificados usando 3A primeira demão com produtos do PCR IA e como modelos da CII-G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: experimento In vivo com csgD local-dirigido e mutantes McaS. Análise ocidental do borrão de cepas de abrigar vetores indicados. Cepas foram cultivadas para fase exponencial e induzidas por 10 min com 1 mM IPTG (McaS) seguido de indução de 5 min com arabinosa 1mm (csgD). Anticorpos de α-bandeira foram utilizados para direcionar a bandeira-tag CsgD e α-GroEL anticorpos eram usados para direcionar a proteína de limpeza GroEL (diluída 10.000 e 50.000 vezes, respectivamente). Rato e coelho anticorpos conjugados a HRP foram usados como anticorpos secundários (diluídos em 2.000 vezes). Esta figura foi modificada de2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: In vitro experimento com local-dirigido csgD mutantes. EMSA de tipo selvagem de csgD transcrito in vitro (WT) e RNAs mutante (painel C-G) em relação a ligação Hfq. Os alelos csgD (WT e mutante C-G) foram radiolabeled e misturados com 0, 0,25, 0,5, 1 ou 2 µM monomérico Hfq. hibridação reações foram executadas em gel de poliacrilamida não-desnaturação. A intensidade relativa das bandas deslocadas foi quantificada e uma curva sigmoide foi montada para os dados. Valores (Kd) constantes de dissociação foram determinados utilizando SigmaPlot. Esta figura foi modificada em4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Mutagenesis local-dirigido tem uma ampla gama de aplicações diferentes, e aqui, resultados representativos de uma in vivo e in vitro experimento foram incluídos como exemplos de como fazer conclusões biológicas usando a técnica. Mutagenesis local-dirigido foi, por muito tempo, o padrão ouro para estudos de interacção de RNA. A força da técnica reside na combinação da introdução de mutações relevantes com a jusante ensaios e experiências (por exemplo, borrão ocidental ou EMSA) para tirar conclusões sobre locais específicos do DNA e a sua importância nas funções dos gene-produtos pergunta. Quando decidir fazer o mutagenesis local-dirigido, o desenho de primers deve ser cuidadosamente planejado para aproveitar ao máximo a técnica (por exemplo, quais sites de mutação); Certifique-se de incluir o corretas saliências e sítios de restrição com atenção as características da primeira demão/modelo.
A mutagênese real descrito neste protocolo baseia-se na PCR. A parte mais importante do protocolo é, portanto, as condições para isso. Existem várias maneiras de otimizar o PCR, incluindo gradientes de concentrações de Mg2 + , concentração de DMSO e temperaturas do recozimento passo. Para obter mais detalhes, consulte3. Além de otimização da reação de PCR, em si, duas coisas são vale a pena fazer certeza quando fazendo o mutagenesis local-dirigido: primers cuidadosamente concebidos e modelos de alta qualidade.
Ter um modelo de alta qualidade para PCR, muitas vezes faz a diferença entre um PCR falhado e bem sucedido. Enquanto é possível usar um lisado celular para fornecer o molde do ADN, purificado DNA (genoma-, vetor - ou PCR-DNA) é sempre preferível. Além disso, quando se trata da quantidade de modelo, muitas vezes menos é mais; especialmente na última etapa do passo 3-PCR (etapa 4.2.5). Por exemplo, tente uma série de diluição de 10 x de modelo para encontrar o ideal, se necessário.
Projeto da primeira demão ideal depende de características do DNA de interesse e de polymerase. Sempre que possível, sempre tente projetar primers em conformidade. No entanto, em muitos casos as primeiras demão devem ser desenhadas em um site específico em, portanto, não podem ser projetadas de acordo com critérios específicos. Nesses casos, talvez seja necessário fazer mais condições de otimização da PCR em vez disso (veja acima e protocolo na PCR6), mas com as condições até difícil PCRs são geralmente bem sucedidos.
Vários métodos alternativos para local-dirigido mutagênese estão disponíveis, tais como método10 do Kunkel, plasmídeo inteiro mutagênese11, gaveta mutagênese12, síntese de gene de novo e CRISPR13,14.
Método do Kunkel e mutagênese plasmídeo inteiro depende o DNA de interesse, sendo já em um plasmídeo (vector) e usa as primeiras demão para sintetizar um único fio ou fita dupla de DNA modificado, respectivamente. Em ambas as técnicas, o plasmídeo inteiro está sendo sintetizada e utilizada para transformação, Considerando que 2 ou 3 passos PCR apenas sintetiza o pedaço de DNA de interesse. Uma desvantagem de 2 - ou 3-etapa PCR, é que o DNA de interesse deve ser sintetizado em duas vezes, aumentando o risco de mutações nele. Por outro lado, o plasmídeo não tem de ser sintetizada, diminuindo assim o risco de mutações aqui em vez disso. Além disso, usando o 2 ou 3 passos PCR, uma variante do tipo selvagem não precisa ser clonado em um vetor de antemão, diminuindo assim o tempo de clonagem por vários dias.
Mutagênese de gaveta não depende da utilização de cartilhas ou polymerases. Em vez disso, um pequeno fragmento de DNA é de novo sintetizado e incorporado o DNA de interesse com o uso de enzimas de restrição. Este método, no entanto, depende da presença de sítios de restrição apropriada perto do local de destino, que não está sempre presente. Essa abordagem requer também a variante tipo selvagem a ser clonado no vetor de antemão, aumentando o tempo de clonagem em comparação com o método PCR de 2 ou 3 passos.
Com o custo decrescente da síntese de gene de novo (grandes fragmentos de DNA), está se tornando cada vez mais acessível para introduzir mutações, ordenando a sequência desejada comercialmente. Este método é, no entanto, ainda é caro comparado os outros métodos mencionados. Na hora de escrever de novo a síntese é aproximadamente 3 vezes mais caro do que o método apresentado aqui.
Outra opção emergente é o método CRISPR altamente antecipado para alterações do genoma. Este método é altamente eficiente e adaptável em comparação com outras técnicas usadas para as células eucarióticas. No entanto, com a relativa facilidade e muitas técnicas disponíveis para a clonagem no organismo mais simples, como bactérias, CRISPR raramente é mais adequada do que a convencional de clonagem. Assim, a utilidade do CRISPR depende principalmente do organismo a ser estudado.
Ao escolher fazer o mutagenesis local-dirigido, é importante para projetá-lo cuidadosamente; tanto no que diz respeito a aplicações a jusante também usou a técnica real. O método PCR 2 - e 3-passo descrito aqui é aplicável para quase qualquer estudo de mutação e com seu baixo custo é apropriado para qualquer orçamento de laboratório.
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Disclosures
Os autores declaram não interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostaria agradecer subsídios de política de acesso aberto de Universidade do Sul da Dinamarca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
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