Summary
Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.
Abstract
Site yönettiği mutagenesis küçük kodlamayan ribonükleik asit (sRNA) molekülleri ve hedef haberci RNA (mRNA) arasındaki etkileşimi araştırmak için DNA belirli mutasyonların tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, site yönettiği mutagenesis belirli protein bağlayıcı siteleri için RNA eşlemek için kullanılır. 2-adım ve 3-adım dayalı PCR giriş mutasyonların açıklanmıştır. Tüm protein-RNA ve RNA, RNA-RNA etkileşim çalışmaları ile ilgili bir yaklaşımdır. Kısacası, teknik astar istenen mutation(s) ile 2 veya 3 adımda bir PCR ürünü mutasyon ile sentezleme PCR aracılığıyla tasarlama üzerinde dayanır. PCR ürünü daha sonra klonlama için kullanılır. Burada, nasıl site yönettiği mutagenesis mutasyonlar sRNA, McaS ve mRNA, RNA, RNA-RNA ve RNA-protein etkileşimleri araştırmak için csgD, tanıtmak için her iki 2 ve 3 adım yaklaşım ile gerçekleştirileceğini açıklar. RNA etkileşimleri araştırmak için bu tekniği uygulamak; Ancak, tüm mutagenesis çalışmaları (örneğin, DNA-protein etkileşimleri, amino asit ekleme/değiştirme/silme) için uygun bir tekniktir. Mutasyon doğal olmayan üsler dışında herhangi bir tür tanıtmak mümkün ama tekniği yalnızca PCR ürünü aşağı akım uygulama (örneğin, klonlama ve daha fazla PCR için şablon) için kullanılması durumunda geçerlidir.
Introduction
Tüm yapılar hücrenin DNA'sının sırayla kodlanır ettiği DNA kez için bir yaşam hücre planı denir. Doğru çoğaltma ve DNA tamir mekanizmaları mutasyonların sadece çok düşük oranları, doğru kodlanmış genler fonksiyonların sürdürülmesi için gerekli olduğu ortaya emin olun. Değişiklikleri DNA dizisinin farklı düzeylerde DNA'sını (transkripsiyon faktörleri ve enzimleri tarafından tanınması), sonra RNA (ikincil yapı değişiklik ve baz çifti tamamlayıcılık) ve/veya protein (amino başlayarak birbirini izleyen işlevleri etkileyebilir asit oyuncu değişikliği, silme, ekleme veya çerçeve-vardiya). Birçok mutasyonlar gen işlevini önemli ölçüde etkilemez ise bazı mutasyonlar DNA büyük etkileri olabilir. Böylece, mutagenesis site yönettiği belirli DNA siteleri her düzeyde önemi eğitim için değerli bir araçtır.
Bu iletişim kuralı belirli mutasyonlar tanıtmak için kullanılan bir hedeflenen mutagenesis yaklaşımı açıklar. Protokol iki farklı PCR stratejileri üzerinde dayanır: 2 adım veya 3 adımlı PCR. 2-adım PCR istenen mutasyon 5' uç ya da ilgi DNA 3' sonu yakın ise geçerlidir (< 200 baz çifti (bp) sonundan itibaren) ve 3-adım PCR tüm durumlarda geçerlidir.
2-adım PCR yaklaşımda, 3 astar tasarlanmıştır, hangi bir astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 3, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve tek bir astar mutasyon birleştirmek için tasarlanmıştır. Mutasyon 5' ucu ve ileriye doğru bir yönelim yakın ise mutasyon 3' ucu yakın ise astar (astar 2) tanıtımı mutasyon geriye doğru bir yönelim olmalı. İlk PCR adımda astar 1 + 2 ya da 2 + 3 5' uç veya 3' ucu yakın küçük bir parça sırasıyla güçlendirir. Elde edilen PCR ürünü sonra iki adımda bir astar astar 1 veya 3, böylece bir PCR ürünü faiz (Şekil 1A) DNA'daki bir mutasyon ile sonuçlanan ile kullanılır.
3-adım PCR 4 astar tasarlanmış, astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 4, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve astar bir dizi belirli mutasyonlar tamamlayıcılık örtüşen ile birleştirmek için tasarlanmıştır (astar 2 ve 3, geri ve ileri, sırasıyla). Bir ve iki adımda, astar 1 + 2 ve 3 + 4 5' ve 3' son yükseltmek. Üç adımda elde edilen PCR urun adım bir ve iki şablon olarak kullanılır ve astar 1 + 4 ile güçlendirilmiş. Böylece, elde edilen PCR ürünü istediğiniz mutasyon (Şekil 1B) ile ilgi DNA'sı.
Mutasyona uğramış DNA-ebilmek var olmak kullanılmış için aşağı akım herhangi bir uygulama iken, bu iletişim kuralını DNA klonlama vektör yeniden birleştirmek açıklar. Vektörel çizimler klonlama kullanım kolaylığı klonlama gibi çeşitli avantajları vardır ve özelliklere bağlı olarak belirli deneysel uygulamalar Yöneyin. Bu özellik genellikle RNA etkileşimi çalışmalar için kullanılır. Başka bir RNA etkileşim çalışmaları için karmaşık başka bir RNA1,2 veya protein3,ile4RNA'ın yapısal sondalama tekniğidir. Mutagenesis site yönettiği ve sonraki klonlama için etkileşim çalışmaları içinde vivo izin ise ancak, yapısal sondalama sadece tüp bebek gerçekleştirilir.
Site yönettiği mutagenesis yoğun olarak burada sunulan RNA etkileşim çalışmaları için kullanılmıştır. Ancak, anahtar yöntemi ile ilgili 2 - veya 3-adım PCR DNA herhangi bir parça için geçerlidir ve böylece sadece RNA-etkileşim çalışmaları için sınırlı.
Teknik ve olası kullanımları örneklemek için bölgeler için mRNA, csgD, Escherichia coli (e.coli) çoğu düzenleme önemli karakterizasyonu kullanılır. E. coli, csgD içinde küçük kodlamayan RNA tarafından McaS, protein, protein-ifade CsgD2,4,5bastırmak için Hfq, ile işbirliği içinde hedeflenmektedir. Teknik mutasyonlar McaS arasındaki csgD Bankası eşleştirme bölge ve csgDHfq bağlama site tanıtmak için kullanılır. Elde edilen DNA sonra sonraki deneyler için uygun bir vektör içine klonlanmış. Tekniğin aşağı akım uygulamalar içinde vivo, tüp bebek deneyleri içerir. İçin örnek, örnek 1 içinde vivo bir western blot yöntemi kullanarak karakterizedir ve örnek 2 tüp bebek bir elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) kullanarak karakterizedir. Her iki durumda da, o resimli nasıl site yönettiği mutagenesis birlikte diğer teknikleri ile ilgi bir gen hakkında biyolojik sonuçlar yapmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vektör seçimi
- Bir vektör ile aşağı akım deneyler gerçekleştirmek için seçin. Herhangi bir vektör bu 2 ve 3 adım PCR yöntemi için geçerlidir.
- Vektör seçim üzerinde bağlı olarak, uygun enzimleri klonlama için seçin.
2. astar tasarım site mutagenesis yönetmen
- Her iki 2-adım veya 3 adımlı PCR strateji arasında karar (2-adımdır sadece mutasyonlar için < 200 faiz DNA'ın iki ucundan kan basıncı). 2-adım PCR adım 2.2 gidin ve 3 adımlı PCR için adım 2.3'e gidin.
- 2-adım PCR tasarım astar.
- Astar 1 ve ilgi ve ile 5' DNA yükseltmek için 3 çıkıntı tasarım ilgili kısıtlama tanıma site seçilen vektör clone için gerekli ardından 4 nükleotit (örneğin, ATAT veya AGCT) içerir.
- İlk 2 mutation(s), istenen site veya siteleri tanıtmak ve mutasyon ile 10-15 tamamlayıcı nükleotit her iki kanattan için tasarım. Astar mutasyon 5' sonunda kullanılırsa ters yapmak ya da mutasyon 3' sonunda kullanılırsa ileri.
- 3-adım PCR tasarım astar.
- Astar 1 ve 4 DNA ilgi ve ile 5' yükseltmek için bu çıkıntı tasarım ilgili kısıtlama tanıma site seçilen vektör clone için gerekli ardından 4 nükleotit (örneğin, ATAT veya AGCT) içerir.
- Astar 2 ve 3 mutation(s) istenen site (ler), tanıtmak ve mutasyon tarafından 10-15 tamamlayıcı nükleotit her iki kanattan tasarlayın. Astar 2 ve 3 tamamlayıcı ters vardır.
3. PCR vahşi klonlama için tipi DNA amplifikasyon
Not:6PCR hakkında ayrıntılar için bkz.
- PCR6 1 + 2 (2-adım PCR) veya 1 + 4 (3-adım PCR) primerler kullanılarak gerçekleştirmek ve vahşi türü DNA PCR ürünü ı. kullanım Tablo 1' deki PCR programını edinmek için şablon olarak kullanmak.
- PCR özel jel elektroforez tarafından doğrulayın.
- Bir özel çözüm (% 2) jel özel 100 mL 1 x Tris-asetat-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (TAE) arabelleği başına 2 g ekleyerek getirin. Özel bir mikrodalga fırında kaynatılarak geçiyoruz. DNA boyama boya etidyum bromür ekleyin (son bir konsantrasyon için ~ 0,5 µg/mL) için özel görüntüleme için çözüm jel.
- Özel jel döküm, bir elektroforez birimine yerleştirin ve PCR örnekleri (DNA yükleme boya ile karışık) ve bilinen boyutu DNA merdivenden yüklemek. Bantlar yeterince ayrılır ve bantları bir ultraviyole (UV) tablo ya da bir jel görüntüleme sistemi ile görselleştirmek kadar örnekleri 75 45 dk veya W çalıştırın.
- PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.
- -20 ° c (arabellekte Tris-EDTA (TE)-uzun vadeli depolama) veya 4 ° C'de (dH2O – kısa süreli depolama) saf DNA kullanılmış içinde adım 5 kadar saklayın.
4. site yönettiği mutasyonlar DNA'yı tanıtmak için PCR
- PCR 2-adım PCR (bkz. Adım 4.2 3 adımlı PCR için)
- Mutasyonlar 5' uç veya Eğer mutasyon 3' 2 + 3 sonlandırmak ve vahşi türü DNA PCR ürünü II elde etmek için bir şablon olarak kullanmak astar 1 + 2 kullanarak PCR6 gerçekleştirmek (bkz. Tablo 1 için PCR program).
- Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.
- PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.
- Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) kullanılmış içinde adım 5 kadar saf.
- Eğer mutasyonlar 5' ucuna veya astar mutasyonlar sonunda 3' iseniz ve vahşi türü DNA PCR ürünü III almak için şablon olarak 1 PCR ürünü II astar astar 3 birlikte olarak kullanarak PCR6 gerçekleştirmek (bkz. Tablo 1 PCR program için).
- Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.
- PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve konsantrasyon saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.
- Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) 5 adım kadar saf.
- PCR 3 adımlı PCR
- Astar 1 + 2 ve 3 + 4 ayrı tepkileri kullanarak PCR6 gerçekleştirmek ve vahşi türü DNA PCR ürünü elde etmek için şablon olarak kullanın (bkz. Tablo 1 için PCR program) II ve III.
- Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.
- PCR ürünleri bir jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve saf DNA konsantrasyonu spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.
- Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) saf.
- 1 + 4 primerler kullanılarak PCR6 gerçekleştirmek ve PCR ürünü IV elde etmek için 2-5 ng her iki PCR ürünlerinin II ve III (kategorisinde de aynı tepkiyi) şablon olarak kullanın (bkz. Tablo 1 için PCR program).
- Özel jel elektroforez olduğu gibi adım 3.2.1 ve 3.2.2 tarafından PCR doğrulayın.
Not: Birkaç yanlış bantları (bazen daha az şablonu kullanılarak azaltılabilir) almak anormal değildir. Ancak, Eğer doğru boy band varlığına ve jel çıkarılan yanlış PCR ürünleri sayılabilir. - Doğruysa, PCR ürünü jel ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile arındırmak ve konsantrasyon saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek.
- Mağaza DNA-20 ° c (TE arabellekte) veya 4 ° C'de (dH2O) 5 adım kadar saf.
5. vahşi türü ve DNA'sı mutasyona uğramış sürümleri seçilen vektör içine rekombinasyon
Not: aşağıdaki adımları ayrıntılı bilgi için bkz.7.
- Özet saf PCR ürünleri ı ve III (üzerinden 2-adım PCR) ve/veya ilgili kısıtlama enzimler kullanarak IV (gelen 3 adımlı PCR).
- 1 sindirim arabellek x 20 µL 1 µL PCR ürünü için 30-60 dk 37 ° C'de Özet 200 ng her Restriksiyon enzimi ile içinde.
- Jel bir jel ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) kullanarak çıkarma tarafından sindirilmiş PCR ürünü arındırmak, saf DNA'ın DNA toplama bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek ve stok-20 ° c (TE arabellekte) ya da 4 ° C'de (dH2 O) kadar adım 5.6 için kullanılır.
- İlgili enzimleri ile arıtılmış vektör sindirmek ve alkalen fosfataz ile vektör yeniden ligasyonu olaylar azaltmak için tedavi. PCR ürünleri alkalen fosfataz ile muamele yapmak.
- 1 x 1 µL her Restriksiyon enzimi ve alkalen fosfataz, Özet 1000 ng vektörünün 30-60 dk 37 ° C'de 1 µL ile sindirim tampon 30 µL içinde.
- Atık DNA (örneğin, kesilmemiş vektör ve boşaltma DNA) ayrı sindirilir vektöründen özel jel elektroforez adım 3.2.1 ve 3.2.2 olduğu gibi kullanarak.
- Jel bir jel ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) kullanarak çıkarma tarafından sindirilmiş vektör arındırmak, DNA toplama saf DNA'ın bir spektrofotometre (Malzemeler tablo) ile ölçmek ve stok-20 ° c (TE arabellekte) ya da 4 ° C'de (dH2O) Adım 5.6 için kullanana kadar.
- Sindirilir PCR ürünleri sindirilmiş vektör Tablo 2' de belirtilen reaksiyonlar ile ligate.
- 2 h veya 16 ° C'de gece için oda sıcaklığında kuluçkaya
- Alıcı zorlanma (örneğin, E. coli K12) tüp ligasyonu reaksiyonlar ile dönüşümü.
- Zorlanma OD600için büyümek = 0,3-0,5 ve transfer 1 mL kültür ligaz tepkiler olarak kadar 1,5 mL tüpler için.
- 3.500 x g 5 min için de spin ve süpernatant atın.
- Dönüştürme arabelleği (0,1 g/mL Polietilen glikol 3350, %5 dimetil sülfat ve 20 mM MgCl2lysogeny suyu (LB): 10 mL) 200 μL hücrelerde resuspend.
- Ve buz için 30 dk tüpler yer ligasyonu tepki ekleyin.
- Isı-şok 42 ° C'de 2 min için
- 1 mL lb 1,5 mL tüpler ekleyin ve 37 ° C'de en az 45 dakika için antibiyotik direncinin fenotipik ifade sağlar
- Hücreleri 3.500 x g 5 min için de spin, 1 mL süpernatant atmak ve kalan süpernatant hücrelerde resuspend.
- Hücreleri plakalar üzerinde uygun antibiyotiklerle plaka ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Vektörel çizimler (örneğin, vektör ve Ekle özel primerler kullanılarak PCR ile) DNA ekleme başarılı entegrasyonu ile yataklık transformants tanımlayın.
- Sanger tarafından DNA dizisi doğrulamak sıralama.
Dikkat: aynı astar için adım 5,9 kullanılan sıralama için kullanmayın.
6. tüp bebek ve/veya içinde vivo deneyler için inşa vektörel çizimler kullanarak
- İn vivo deney
Not: Bu vahşi türü/mutasyona çoğu düzenleme karakterize etmek için RNA ifade etmek için bir vektör kullanmanın bir örneği olduğunu. Western Blot üzerinde daha fazla bilgi için bkz:8.- E. coli K12 suşları inşa vektörel çizimler ile uygun ortamda büyümeye ve gerekirse ifade teşvik. Santrifüjü tarafından hasat örnekleri.
- Örnekleri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) hücre topakları SDS örnek arabellek x 1 çözülerek hazırlamak (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, % 2.5 SDS, %0,002 bromophenol mavi, %5 β-mercaptoethanol, % 10 gliserol) ve kaynatın 5 95 ° c Min.
Not: Bir jel döküm veya piyasada bulunan prekast jel kullanımı mümkündür. İkinci sonuçları Şekil 3 ' te (Tablo reçetesi) sunulan kullanılmıştır. - 107 hücreleri her örneği ayrı Wells (protein merdivenle dahil) yükleyin ve proteinler (yaklaşık 45 dk) ayrılır kadar jel 200 V çalıştırın.
- Proteinler bir selüloz-zar 80, yarı kuru havalesiyle üzerine leke mA 1 h için.
- Membran proteinleri (örneğin, % 5-1 x Tween 20-Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TTBS) arabellekte çözünmüş Süttozu) karışımı ile engelleyin.
- Faiz (örneğin, GFP, bayrak veya HIS öğesini protein) protein hedef ve nazik ajitasyon ile 1 h için kuluçkaya (1 x TTBS arabellekte çözünmüş) birincil antikor ekleyin.
- Membran ilişkisiz antikorlar kaldırmak için 1 x TTBS içinde 10 dakika yıkayın. İki kez daha tekrarlayın.
- Birincil antikorlar hedefleyen ikincil antikor (1 x TTBS arabellekte çözünmüş) ekleyin ve algılama için sağlar (örneğin, horseradish peroksidaz (HRP)-Birleşik ikincil antikorlar. Nazik ajitasyon ile 1 h için kuluçkaya.
- Membran ilişkisiz antikorlar kaldırmak için 1 x TTBS içinde 10 dakika yıkayın. İki kez daha tekrarlayın.
- İkincil antikorlar ile uyumlu bir teknik ile membran (HRP Birleşik ikincil antikor kullandıysanız Örneğin, kuluçka sonra luminol kaynaklı bir Kemiluminesan ile düşsel tarafından) gözünün önüne getir.
- İn vitro deney
Not: Bu vektör şablon olarak tüp bebek RNA transkripsiyonu için RNA-protein etkileşimleri karakterize kullanmanın bir örneği olduğunu. Emsan hakkında daha fazla bilgi için bkz:9.- Tüp bebek tutanaklar bir T7 vitro transkripsiyon kiti (Malzemeler tablo) ve adım 5 vektörlerinden şablon olarak kullanarak olun.
- Tarafından sayfası RNA transkript jel denaturing % 4.5 7 M üre üzerinde ayrı ve RNA elektro elüsyon diyaliz tüpler (Tablo reçetesi) tarafından doğrudan jel ayıklayın.
- Etiket RNA (örneğin, γ -32ile P-ATP radiolabeling T4-polinükleotit kinaz (Tablo reçetesi) kullanarak ve tekrar içeren sütunlar (Tablo reçetesi) arındırmak.
Dikkat: radyoaktif madde ile çalışmaya başlamadan önce yerel radyasyon emniyet amiri ile başvurun. - Etiketli-RNA bağlama arabellek (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)) x 1 ayrı reaksiyonlarda protein konsantrasyonları artan ile karıştırın.
Not: sonuçlarında sunulan (Şekil 4), 2 nM radiolabeled csgD mRNA bir gradyan 0-2 µM Hfq protein (monomer konsantrasyon) ile karışık oldu. - Protein ve RNA bir sigara denaturing polyacrylamide jel hibridizasyon mix yüklemeden önce melezlemek ve 1,5 saat için jel 200 V'de çalıştırmak için izin verir.
- 6.1.3 adımından etiketleme ile uyumlu bir teknik ile jel görselleştirin. (radiolabeling uygulandıysa Örneğin, phosphoimaging tarafından).
- Bir görüntü işleme programı ötelenen bantları göreli yoğunluğunu ölçmek ve uygun bir eğri (sigmoidal) için bir grafik kullanarak veri ve veri analiz yazılımı (Malzemeler tablo). Monte eğri dayalı, ayrılma sabit (Kd) değerleri otomatik olarak yazılım ile belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA etkileşimleri ile ilgili çoğu, düzenleme, csgD, bir çift vektör Kurulum seçildi araştırmak için: bir csgD ifade etmek için mRNA ve başka bir küçük kodlamayan RNA McaS ifade etmek için. csgD bir arabinoz indüklenebilir orta-kopya plazmid kloramfenikol direnci ile olan pBAD33 içine klonlanmış ve McaS izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüklenebilir düşük kopya plazmid olan mini R1 pNDM220, klonlanmış ile ampisilin direnç. Vahşi türü csgD yapıldı astar 1A ve 4A kullanılarak güçlendirilmiş PCR (4A içerir bir bayrak-sıra) vahşi türü McaS PCR ürünü IB verim için astar 1B ve 4B kullanarak güçlendirilmiş PCR iken PCR ürünü IA, vermeye. 3-adım PCR strateji oyuncu değişikliği tahmin edilen Bankası eşleştirme bölgedeki csgD ve McaS. takdim etmek için kullanmıştı İki ilk adımda PCR ürünleri IIA ve IIIA astar 1A, 2A ve 3A + 4A, sırasıyla kullanarak sentez. Üçüncü adımda, PCR ürünü IVA PCR ürünleri IIA ve IIIA şablonu ve 1A ve 4A kullanarak astar (Şekil 2A) sentezlenmiş. Benzer şekilde, tamamlayıcı site yönettiği mutasyonlar McaS, PCR ürünleri IIB, ilk iki adımda IIIB ve üçüncü adımda (Şekil 2A) IVB vermeye astar 1B, 2B, 3B ve 4B ile tanıtıldı. pBAD33 ve PCR ürünleri IA ve IVA BamHI ve PstI ile sindirmek ve sindirilmiş IA ve IVA sindirilmiş pBAD33 tane. Elde edilen yapıları olarak pBAD-csgDbayrak ve pBAD-csgD63-66FLAG (transkripsiyon başlangıç sitesi göre konuma 63-66, mutasyona uğramış) seçilmiştir. pNDM220 ve PCR ürünleri IB ve onu AatII ve BamHI ile sindirmek ve sindirilmiş IB ve onu sindirilmiş pNDM220 tane. Elde edilen yapıları olarak pNDM-mcaS ve pNDM-mcaS42-45 (transkripsiyon başlangıç sitesi göre konuma 42-45, mutasyona uğramış) seçilmiştir.
Mutasyonlar etkisi tahlil için pBAD-csgDbayrak ya da pBAD-csgD63-66FLAG ve pNDM220, pNDM-mcaS veya pNDM-McaS42-45 yataklık E. coli suşları M9 en az orta OD için % 0,2 gliserol ile takıma yetiştirilmiştir 450 , 0,4. PNDM-vektörel çizimler ifadeden sonra buna ek olarak 1 mM pBAD-vektörel çizimler 5 dk indüksiyon tarafından takip IPTG 1 mM arabinoz eklenmesi tarafından tarafından 10 dakikadır akımıdır. Bu noktada, örnekleri hasat edildi ve western blot Analizi hasat örnekleri ile gerçekleştirildi. McaS vahşi türündeki ifade çeviri vahşi türü CsgD engeller olsa da, giriş CsgD veya McaS mutasyonların gözlenen baskı azaltır. Ancak, ne zaman mutasyonlar CsgD ve McaS translasyonel bir baskı CsgD içinde tamamlanmaktadır geri yüklenir (Şekil 3;2Güncelleme). Böylece, site yönettiği mutational yaklaşım o McaS ve csgD baz-çifti, bu bölge hipotezi destekler.
PBAD33 vektör içinde vivo deneme için seçildi ve ayrıca site Yönetmen: mutasyon tanıtmak için Hfq bağlama csgD için araştırmak için kullanılan mRNA tüp bebek. Site yönettiği mutasyonlar csgD mutant RNA transkripsiyonu zaman değişmiş birincil ve/veya ikincil yapılar ile üretmek için 2-adım PCR stratejisi ile tanıtıldı. Astar 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F veya 2G yükseltmek ve mutasyonlar 5' sonuna tanıtmak için kullanılan csgD. Elde edilen PCR ürünleri (IIC, IID, yalan, IIf ve IIG) yükseltmek ve mutasyonlar için tüm csgD DNA (Şekil 2B) tanıtmak için astar 3 şablonları olarak kullanılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri (IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG) pBAD33 yukarıda açıklandığı gibi klonlanmış. İn vitro transkript T7 RNA polimeraz ile transkripsiyonu: Birincisi, PCR ürünleri astar 5A, 5 C, 5 D, 5E, 5F veya 5G + 6 ile inşa vektörel çizimler şablon olarak kullanıp sentez. Elde edilen PCR ürünleri T7 RNA polimeraz için şablon olarak kullanılmıştır. Vitro csgD vahşi türü ve mutant RNA'ların arıtılmış Hfq arıtılmış, radiolabeled ve karışık ile artan konsantrasyonları edildi transkripsiyonu. Hibridizasyon reaksiyonlar sigara denaturing jeller üzerinde çalıştırmak ve görüntülenir. Artan Kd-mutant gen değerlerini kanıtlıyor Hfq daha az verimli mutantlar için bağlar. Ayrıca, Hfq csgD vahşi türünün RNA gözlenen 3 vardiya tarafından gösterilen çeşitli bağlama sitelerde vardır. Ancak, sadece 2 bağlayıcı siteleri farklı mutant RNA'ların izlenmektedir (Şekil 4;4modifiye). Böylece, sitenin yönetmen mutational yaklaşım csgD birincil ve/veya ikincil yapıların tanımlar mRNA Hfq tam bağlama için önemlidir.
Birlikte ele alındığında, bu site yönettiği mutagenesis 2 veya 3 adım PCR yaklaşımla gen düzenlemesi çoğu düzeyi hem de protein-RNA etkileşimleri hakkında biyolojik sonuçlara yapmak aşağı akım deneyleri birlikte gerçekleştirmek mümkündür .
| Adım | Sıcaklık | Zaman |
| İlk denatürasyon | 98° C | 2 dk |
| Denatürasyon | 98° C | 10 s |
| Tavlama | 55° C | 10 s |
| Uzantısı | 72° C | 15 s |
| (30 döngüleri) | ||
| Son uzantısı | 72° C | 5 dk |
| Basılı tutun | 4 ° C |
Tablo 1: PCR programı
| Reaktif | Denetim tepki | 20 fmol tepki | 100 fmol tepki |
| ligaz arabellek x 10 | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Vektör DNA sindirmek | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Sindirilir PCR ürünü | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | 19 µL | 19 µL | 19 µL |
| Ligaz | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tablo 2: Birleştirmesini tepkiler
| Astar adı | Sıra | Mutasyonlar için - kullanılan | ||
| 2-1A ya da 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - ve 3-yuvarlak PCR csgD | ||
| 2-3A veya 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - ve 3-yuvarlak PCR csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | csgD -Tarih 3-yuvarlak PCR ile değiştirir 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | csgD -Tarih 3-yuvarlak PCR ile değiştirir 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-yuvarlak PCR McaS üzerinde | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-yuvarlak PCR McaS üzerinde | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | McaS-Tarih 3-yuvarlak PCR ile değiştirir 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | McaS-Tarih 3-yuvarlak PCR ile değiştirir 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | csgD üzerinde-2-yuvarlak PCR 11 siler nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | csgD üzerinde-2-yuvarlak PCR ile değiştirir 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | csgD üzerinde-2-yuvarlak PCR 11 siler nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-yuvarlak PCR csgD üzerinde-siler 9 nt ve yerine 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-yuvarlak PCR csgD üzerinde-siler 9 nt ve yerine 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tablo 3: mutagenesis sitesi yönettiği ve T7 şablon sentezi için kullanılan astar
Kalın: Restriksiyon enzimi tanıma siteleri (BamHI, PstI ve AatII)
Altı çizili: nükleotit mutasyonlar
Şekil 1: PCR strateji için site yönettiği mutagenesis. A) üç astar 2-adım PCR yaklaşımda site yönettiği mutasyonlar bir gen için ilgi tanıtmak için kullanılır. Astar 1 ve 3 gen güçlendirir (PCR ürünü ben), astar 2 belirli mutasyonlar (*) tanıtır. Astar çiftleri 1 + 2 yükselterek faiz DNA PCR ürünü II (adım 1) sentezlemek için iki ucundaki küçük bir parçası. Elde edilen PCR ürünü, daha sonra site yönettiği mutasyon (adım 2) dahil PCR ürünü III sentezlemek için bir astar astar 3 ile birlikte kullanılır. B) dört astar 3 adımlı PCR yaklaşımda site yönettiği mutasyonlar bir gen için ilgi tanıtmak için kullanılır. Astar 1 ve 4 yükselterek gen (PCR ürünü ben), astarlar 2 ve 3 tanıttı iken belirli mutasyonlar (*). Astar çiftleri 1 + 2 ve 3 + 4 PCR ürünü sentezlemek için PCR iki ilk adımda kullanılan II ve III (adım 1 ve 2). Üçüncü adımda, PCR ürünleri II ve III PCR ürünü IV dahil site Yönetmen: mutasyon ile (adım 3) sentezlemek için astar çift 1 + 4 ile şablon olarak kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: site yönettiği mutagenesis PCR ürünleri. PCR astar ve metinde açıklandığı gibi şablonlar ile gerçekleştirilmiştir. PCR ürünlerinin % 2 özel jel etidyum bromür ile çalıştırmak (~ 0,5 µg/mL) (Tablo reçetesi) DNA merdiven 1 µg ile karıştırın. Doğru boyutu bantları ile kırmızı bir kare olarak görüntülenir. A) çoğu PCR reaksiyonları içinde tek bir doğru boyutta görünür grubudur. Ancak, PCR reaksiyon gerçekte hangi görünür iki grup vardır üst bant (hemen üzerinde 300 bp) doğru uzunluğa sahiptir. Beklendiği gibi PCR ürünleri II ve IIIC uzunluğu toplamı eşit PCR ürünleri uzunluğu için ı ve IV (A: csgD PCR ürünleri, B: McaS PCR ürünleri, astar 1A/B + 4A/B, II + III kullanılarak güçlendirilmiş ı: vahşi tipi csgD/McaS: Orta PCR ürünleri astar B/1A/B + 2A ve 3A/B + 4A/B, sırasıyla, kullanılarak güçlendirilmiş IV: mutasyona uğramış PCR ürünü güçlendirilmiş astar 1A/B + 4A/B ara PCR ürünleri ile II ve III şablon olarak kullanılması). Tüm PCR reaksiyonları içinde tek bir doğru boyutta görünür grubudur. Bu durumda, PCR reaksiyonları III II eklendi PCR ürünlerinin neredeyse tüm molekülleri PCR ürünleri III sentezlemek için kullanılmıştır. Sadece PCR IIIE PCR ürünü yalan hala görünür için (IA: vahşi türü csgD PCR ürünü güçlendirilmiş astar 1A + 3A, IIC-G: ara PCR ürünleri güçlendirilmiş astar 1A kullanarak kullanarak + 2 C-G, PCR IIIC-G: mutasyona uğramış astar 3A PCR ürünleri IA ile kullanılması güçlendirilmiş ürünler ve IIC-G şablon olarak) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: csgD sitesi yönettiği ve McaS mutantlar ile In vivo deneme. Belirtilen vektörel çizimler yataklık suşları Western blot analizi. Suşları üssel faz için yetiştirilen ve 10 dk 5 dk indüksiyon ile 1 mM arabinoz (csgD) ardından 1 mM IPTG (McaS) ile indüklenen. Α-bayrak antikorlar bayrak öğesini CsgD hedef için kullanılan ve α-GroEL antikorlar temizlik protein GroEL (10.000 ve 50.000 kere, sırasıyla seyreltilmiş) hedeflemek için kullanılmıştır. Fare ve tavşan HRP Birleşik antikorları (2.000 kez seyreltilmiş) ikincil antikor kullanılmıştır. Bu rakam2değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Vitro deney csgD sitesi Yönetmen: mutantlar ile. Emsan tüp bebek kopya etmek csgD vahşi türü (WT) ve mutant (Panel C-G) RNA'ların Hfq bağlama ile ilgili. CsgD gen (WT ve mutant C-G) radiolabeled ve karışık 0, 0,25, 0.5, 1 veya 2 µM monomeric Hfq. hibridizasyon reaksiyonlar sigara denaturing polyacrylamide jeller üzerinde çalıştırılan. Ötelenen bantları göreli yoğunluğunu sayılabilir ve sigmoid eğrisi için veri takıldı. Ayrılma sabit (Kd) değerleri SigmaPlot kullanılarak belirlenmiştir. Bu rakam4ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Site yönettiği mutagenesis farklı uygulamaları geniş bir dizi var ve burada, bir içinde vivo ve tüp bebek deney temsilcisi sonuçlarından nasıl biyolojik sonuçlar yöntemi kullanarak yapmak için örnek olarak dahil edildi. Site yönettiği mutagenesis uzun süre RNA etkileşim çalışmaları için altın standart olmuştur. Aşağı akım deneyleri ve deneyler gen ürünlerinde fonksiyonları içinde belirli DNA siteleri ve onların önemi hakkında sonuçlara (örneğin, Batı leke veya Emsan) ile ilgili mutasyonlar tanıtımı ile birlikte teknik gücü yatıyor soru. Site yönettiği mutagenesis yapmak karar verirken, astar tasarım dikkatle tekniği en kazanmak için planlanmalıdır (mutasyona örneğin hangi sitelerin); doğru çıkıntılar ve kısıtlama siteleri içerir ve astar/şablon özellikleri dikkat etmeyi unutmayın.
Bu protokol için açıklanan gerçek mutagenesis PCR üzerinde dayanır. Protokolü'nün en önemli bölümü bu nedenle bunun için koşullar. PCR, degradeler Mg2 + konsantrasyonları, DMSO konsantrasyon ve sıcaklıklarında tavlama adım dahil olmak üzere en iyi duruma getirme çeşitli yolları vardır. Daha fazla bilgi için bkz:3. En iyi duruma getirme PCR reaksiyon yanı sıra iki şeyler tabii ki site yönettiği mutagenesis yaparken yapmak değer olduğunu: yüksek kalite şablonlar ve dikkatle tasarlanmış astar.
Yüksek kaliteli şablon için PCR kez sahip bir başarılı ve başarısız PCR arasındaki fark yapar. O DNA şablon sağlamak için bir hücre lysate kullanmak mümkün olmakla birlikte, DNA saflaştırılmış (genomik-, vektör veya PCR-DNA) her zaman tercih edilir. Şablon miktar için geliyor, Ayrıca, sık sık daha az daha fazla olur; Özellikle 3-adım PCR (adım 4.2.5) son adımında. Örneğin, şablon optimum bulmak için 10 x seyreltme dizi deneyin.
En uygun astar tasarım faiz ve polimeraz DNA'ın özelliklerine bağlıdır. Mümkün olduğunda, her zaman buna göre astar tasarımı deneyin. Ancak, birçok durumda astar belirli bir sitede tasarlanmış olması gerekir ve bu nedenle belirli ölçütlere göre tasarlanmamış. Bu gibi durumlarda, daha fazlasını yapmak gerekli olabilir PCR duruma getirilmesi koşulları yerine (bkz. yukarıda ve PCR6Protokolü), ama doğru koşullar ile bile zor PCR genellikle başarılı.
Birkaç alternatif yöntemler için site yönetmen-mutagenesis Kunkel'ın yöntemi10, tüm plazmid mutagenesis11, kaset mutagenesis12, de novo gen sentezi ve CRISPR13,14gibi kullanılabilir.
Kunkel'ın Yöntem ve bütün plazmid mutagenesis zaten bir plazmid (vektör) olmak ilgi DNA kullanır ve bir tek iplikçik veya çift mutasyona uğramış DNA iplikçiğinin sırasıyla sentezlemek için astar kullanır. 2 veya 3 adım PCR sadece faiz DNA parçası sentezler, ancak her iki teknikleri sentezlenmiş ve için kullanılan dönüştürme, tüm plazmid ediliyor. Bir dezavantajı 2 - veya 3-adım PCR, ise DNA ilgi iki kez, orada mutasyon riski artan sentezlenmiş gerekir ki. Öte yandan, plazmid sentezlenmiş, böylece bunun yerine burada mutasyon riski indirim yok. Ayrıca, 2 - veya 3-adım PCR kullanarak, bir vahşi türü değişken bir vektör önceden, klonlanmış böylece klonlama zaman tarafından birkaç gün indirim gerekmez.
Kaset mutagenesis astar veya polimerazlar kullanımı dayanmaz. Bunun yerine, küçük bir DNA parçası sentezlenmiş ve faiz DNA enzimleri kullanımı ile dahil de novo var. Bu yöntem, ancak, uygun kısıtlama siteler her zaman mevcut değil hedefli Makinası yakınındaki varlığını kullanır. Bu yaklaşım aynı zamanda önceden, klonlama zaman 2 veya 3 adım PCR yöntemine göre artan vektör içine klonlanmış için vahşi türü değişken gerektirir.
De novo gen sentezi (büyük DNA parçalarının) azalan maliyet ile ticari olarak istenen sırayı sıralamaya göre mutasyonlar tanıtmak için giderek daha uygun hale geliyor. Bu yöntem ise hala pahalı bahsedilen diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında. De novo yazı zaman sentez yöntemi burada sunulan yaklaşık 3 kat daha pahalıdır.
Başka bir gelişmekte olan seçenek genom değişiklikler için merakla beklenen CRISPR yöntemidir. Bu yöntem son derece etkilidir ve ökaryotik hücreler için kullanılan diğer teknikleri göre uyarlanabilir. Ancak, göreli kolaylık ve daha basit organizmada bakteri klonlama için birçok kullanılabilir teknikleri ile CRISPR nadiren geleneksel klonlama daha daha uygundur. Bu nedenle, CRISPR kullanışlılığı çoğunlukla okudu organizma üzerinde bağlıdır.
Site yönettiği mutagenesis yapmak için tercih dikkatle tasarlamak önemlidir; aşağı akım uygulamaları de gerçek tekniği açısından her ikisi de. Burada açıklanan 2 ve 3 adım PCR yöntemi neredeyse herhangi bir mutasyon çalışma için geçerlidir ve onun düşük maliyetli ile herhangi bir laboratuvar bütçeye uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Güney Danimarka Üniversitesi açık erişim ilkesi hibe teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
