Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Resumo

A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.

Introdução

Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular¹. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado¹.

condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular^2,3. Em camundongos, a detecção de albumina na urina é geralmente realizada por um ensaio imunoenzimático de albumina (ELISA) a partir de 24 h de coleta de urina. Se a urina de uma coleta de urina de 24 h ou urina local for usada, pequenas diferenças nas concentrações de albumina podem ser perdidas devido a problemas de sensibilidade do ensaio. A maioria dos pesquisadores, portanto, usam modelos animais em que a albuminúria é induzida por lesão renal robusta devido a toxinas, drogas e Cirurgia renal.

Portanto, o achado de um método sensível para detectar alterações pequenas e transitórias na permeabilidade glomerular é muito importante para o campo. Rippe et al. apresentaram um modelo de rato para testar a permeabilidade glomerular aplicando um traçador fluorescentamente rotulado, a saber FITC-polysacarose 70 (ou seja, FITC-Ficoll 70), no tamanho da albumina⁴. A aplicação do traçador permite o teste de mudanças a curto prazo na permeabilidade glomerular (dentro dos minutos) e é muito sensível⁴. Dois estudos utilizaram o método Tracer em camundongos^5,6. Apesar de seus benefícios, este método, infelizmente, tem desvantagens: é tecnicamente muito complexo, radioativo e invasivo. Uma análise mais adicional da urina é conseguida somente usando a filtração do gel ou a HPLC^5,6da tamanho-exclusão.

Neste trabalho, apresentamos um método alternativo, sensível, não radioativo e rápido para medir a permeabilidade glomerular em camundongos utilizando FITC-polysacarose 70 fluorescentamente rotulado. Introduzindo um cateter transuretral, a coleção da urina é menos invasora do que a punctura da bexiga, o Urethrotomy, e a aplicação suprapúbica do cateter, e permite a coleção da urina pelo menos cada 30 minutos. a análise de urina é realizada a partir de pequenas quantidades (5μl) leitor de placas fluorescentes. As concentrações de traçador na urina são normalizadas para concentrações de creatinina na urina usando um ensaio de creatinina enzimática.

Conseqüentemente, este método novo oferece uma ferramenta sensível para estudar ferimento glomerular adiantado com permeabilidade glomerular aumentada.

Protocolo

As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes delineadas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (institutos nacionais de saúde da publicação n º 85-23, revisado em 1996). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as aprovações institucionais relevantes (governo estadual Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referência 84-02.04.2012. A397).

1. preparação de instrumentos, soluções e equipamentos

1. Reconstituir FITC-polysacarose 70 com 0,9% de cloreto de sódio estéril (NaCl) a uma concentração final de 10 mg/mL (i.e., 100 mg em 10 mL de NaCl).
2. Dialyze FITC-polysacarose 70 solução para remover moléculas FITC livres durante a noite a 4 ° c (corte de peso molecular [MWCO] em 10.000). Use 1 L de 0,9% de NaCl estéril por 10 mL de FITC-polysacarose 70 agitação constante. Proteja da luz. Aliquot o FITC-polysacarose diafiltrado 70 e armazená-lo em-20 ° c.
3. Para o FITC-polysacarose 70 bolus, adicionar 4 μL de 10 mg/mL FITC-polysacarose 70 solução para 996 μL de 0,9% NaCl (a concentração final de FITC-polysacarose 70:40 μg/mL).
4. Para a solução de infusão de equilibração, adicione 20 μL de uma solução de FITC-polysacarose 70 de 10 mg/mL a 9,98 mL de NaCl estéril de 0,9% que rende a uma concentração final de 20 μg/mL.
5. Para a solução experimental, adicione medicamentos ou substâncias à solução de perfusão (por exemplo, para a angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para um rato de 25 g, adicione 3 μL de Ang II de uma solução de 1 mM).
6. Para a cirurgia, prepare uma máquina de barbear, duas braçadeiras cirúrgicas, um par de tesouras cirúrgicas, duas pinças, duas pinças finas, um par de tesouras finas e cotonetes. Prepare linhas de seda de 2 10 cm (4-0 a 6-0) para procedimentos de ligadura.
7. Para a colocação de um cateter venoso central, prepare uma seringa de 10 mL com uma agulha de 21 G. Coloque a ponta da agulha em um cateter de 30 cm de comprimento (com um diâmetro interno [ID] de 0,58 mm). Ligue o cateter de 0,58 mm a um cateter de 10 cm (com um ID de 0,28 mm). Corte a ponta do cateter mais pequeno oblíquo para criar uma ponta afiada que seja introduzida na veia de jugular.
8. Prepare a anestesia (i.e., anestesia intraperitoneal cetamina, 100 mg/kg de peso corporal, e xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).
9. Prepare um angiocatômetro de 22 G descartando a agulha e marcando o cateter a 1 cm da ponta. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 ° c.
10. Prepare um dispositivo de pressão arterial e mude a membrana de medição de pressão sanguínea, se necessário.

2. fase de preparação

1. Cateter urinário
   Nota: a seção 2,1 segue o protocolo conforme descrito por reis et al.⁷. A Figura 1 e a Figura 1 suplementar mostram a colocação de um cateter urinário em camundongos fêmeas.
   1. Anestesie o rato com cetamina/xilazina (ver passo 1,8). Use o teste do dedo do pé-pitada para confirmar a anestesia apropriada. Para manter a anestesia, repita a anestesia (por exemplo, com metade da dosagem) após 60 min. a anestesia apropriada é confirmada se o teste da pitada do dedo do pé não resultar na retirada do reflexo.
      Nota: ratos FVB fêmeas são utilizados neste protocolo.
   2. Posicione o mouse na recumbência dorsal em uma almofada de aquecimento de 37 ° c. Aperte o abdômen inferior e encontrar o óstio uretral (por exemplo, um microscópio).
   3. Use a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifica-a com o gel do xilocaína. Introduza-o com cuidado 3 milímetros no óstio uretral ao paralelalizar o eixo uretral longe do ponto de origem (Figura 1a).
   4. Gire a parte superior do angiocatheter 180 ° mantendo a ponta dentro do óstio uretral e mantendo o eixo da uretra (Figura 1b).
   5. Introduzir o cateter 7 mm mais no rato para que seja colocado dentro da bexiga (Figura 1C). Não force o cateter para além da resistência. Corrija a posição do cateter desde o início se a resistência for sentida. Tome nota de que se a posição do cateter urinário estiver correcta, a urina já pode aparecer dentro do cateter.
   6. Coloc um tubo marrom de 1,5 mL sobre a parte superior do angiocatheter para recolher a urina. Aplique 1 ml de 0,9% de NaCl por via subcutânea para realçar a produção de urina.
2. Cateter venoso central
   1. Raspar o pescoço do mouse e colocá-lo em decúbito com a cabeça em direção ao cirurgião. Hyperextend a cabeça do rato com uma fita.
   2. Desinfecte o pescoço com isopropanol a 70%. Faça uma incisão pequena da pele (5 milímetros) abaixo do jawline, usando um pinça e um par de tesouras. Corte a pele aproximadamente 1 cm na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido.
   3. Dissecar cuidadosamente a pele no lado direito do pescoço, usando um par de tesouras. Faça uma incisão retangular da pele para o lado direito do mouse para expor o tecido mole do pescoço. Use um par de tesouras e um tweezer. Fixar as abas da pele com duas braçadeiras.
      Nota: a veia jugular corre ao longo do lado esquerdo da glândula tireóide ou é ligeiramente coberta pelo lobo direito da glândula tireóide. Após esta etapa, use um microscópio para a cirurgia.
   4. Expor cuidadosamente a veia jugular por meio de uma preparação sem corte, usando a ponta da pinça fina. Evite lesões nos ramos das veias.
      Nota: pode ser necessário remover o tecido com tesouras finas. Tenha cuidado ao usar tesouras para remover o tecido, pois aumenta o risco de sangramento.
   5. Coloc e feche uma ligadura com uma linha de seda (4-0 a 6-0) na parte longe do ponto de origem da veia de jugular visível (para a cabeça do rato). Põr a tensão sobre a ligadura fixando a linha de seda com uma fita para assegurar a tensão ligeira na veia de jugular. Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular.
   6. Encha o cateter com a solução de infusão de equilíbrio (ver passo 1,4) e fixe o cateter com uma fita para que o cateter alinhe a veia jugular. Controle de bolhas para evitar o embolismo aéreo.
   7. Levante a veia jugular com pinças finas no local de inserção (o local de inserção é de 1 – 2 mm proximal da ligadura). Alinhe a tubagem paralela à veia jugular. Perfure a veia jugular, visando o lúmen, e insira por aproximadamente 2 – 4 mm, paralelhando o eixo da veia jugular. Evite quaisquer movimentos Brisk.
   8. Feche a ligadura para fixar o cateter. Controle para a estanqueidade da ligadura através da visualização cuidadosa através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia.
3. Medição da pressão arterial
   1. Coloque a cauda-manguito na parte inferior da cauda do mouse, enquanto o mouse se coloca em recumbency dorsal. Iniciar as medições e repeti-los 10x por ponto de tempo. Construa uma média a partir das medições.
   2. Ajuste a posição da cauda-braçadeira se as medidas da pressão sanguínea não parecerem corretos e os dados falsos são produzidos.

3. fase de equilibração

1. Alterar o tubo de coleta urinária antes da fase de equilíbrio começa e colocá-lo no gelo.
2. Introduza uma seringa de 10 mL preenchida com uma solução de fase de equilibração FITC (ver passo 1,4) com uma agulha de 21 G e o cateter maior (com um ID de 0,58 mm) e coloque-o na bomba da seringa.
3. Dobre um cotonete e coloque-o em torno do cateter da pequeno-embarcação (com uma identificação de 0,28 milímetros) que seja introduzido na veia de jugular. Coloque o cateter dentro do cotonete. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia aérea. Ligue uma agulha de 27 G com uma seringa de 1 mL preenchida com o bolus FITC até ao fim do cateter de pequeno vaso.
4. Abra o grampo e aplique o bolus FITC (100 μL). Feche a braçadeira novamente e conecte o cateter maior com o cateter menor. Iniciar a bomba da seringa com 0, 8 mL/min (0,480 mL/h). Continuar a perfusão durante 60 min.

4. fase experimental

Nota: nesta fase, o efeito de fármacos na permseletividade glomerular pode ser investigado.

1. Mude o tubo urinário (ponto de tempo 0 min) para outro tubo castanho 1,5 mL. Coloque um cotonete em torno do cateter de pequeno vaso e feche um grampo como indicado na etapa 3,3.
2. Desconecte o cateter grande do cateter da pequeno-embarcação. Mude as seringas para as soluções de fase experimental (ver passo 1,5). Deixe a bomba da infusão funcionar de modo que o grande cateter esteja enchido com a solução do equilíbrio.
3. Reconecte os cateteres evitando o embolismo de ar e reabra a braçadeira. Ligue a bomba da seringa a 0, 8 mL/min.
4. Continue a correr a bomba da seringa para 60 min e recolher a urina dentro do tubo urinário depois disso (urina 60 min). Coloque o tubo de urina no gelo.
5. Sacrifique o rato por luxação cervical durante a anestesia. Antes da eliminação, o rato é observado durante 5 minutos para garantir que está morto.

5. análise de urina

1. Medição de fluorescência
   1. Descongelar a piscina urinária e dilui-lo 1:10 com tampão fosfato salina (PBS).
      Nota: a piscina urinária é um conjunto de urina que foi coletado de camundongos saudáveis em uma coleta de urina de 12 a 24 h em uma gaiola metabólica.
   2. Prepare padrões para a medição de fluorescência. Tomar 10 tubos castanhos 1,5 mL e rotulá-los para o espaço em branco (1:10 urina diluída) e as seguintes concentrações de FITC-polysacarose 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μg/mL).
   3. Pipet 246 μL de piscina de urina diluída num tubo castanho 1,5 mL e adicionar 4 μL da concentração de FITC-polysacarose 70 (ver passo 1,1) para obter uma concentração final de 160 μg/mL FITC-polysacarose 70. Pipet 100 μL da piscina de urina diluída em todos os outros tubos.
   4. Diluir 1:2 pipetando 100 μL do tubo de 160 μg/mL de FITC-polysacarose 70 para o tubo de 80 μg/mL e continuar com as outras concentrações. Assegure a mistura adequada das concentrações diluídas (por exemplo, por vortexing o tubo antes de continuar).
   5. Diluir as amostras de urina do rato (0 min, 60 min) 1:10 com piscina urinária diluída.
   6. Pipete 5 μL de cada concentração de FITC-polysacarose 70 padrão e das amostras de urina do rato como triplica numa placa preta 384-well. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 15 s para evitar bolhas.
   7. Analise a placa 384-well em um leitor da placa. Realize a excitação a 496 nm e meça a fluorescência a 525 nm.
2. Medição da creatinina
   1. Siga as instruções do fabricante. Em resumo, prepare os padrões de creatinina diluindo 10 μL da solução padrão de creatinina de 100 mM com 990 μL de tampão de ensaio de creatinina para preparar uma solução padrão de 1 mM.
   2. Adicione 0, 2, 4, 6, 8 e 10 μL da solução padrão de 1 mM de creatinina em uma placa 96-well para gerar padrões de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol/poço, respectivamente. Adicione o tampão do ensaio da creatinina a cada poço para trazer o volume a 50 μL.
   3. Prepare as misturas de reacção adicionando 42 – 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de creatininase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 2 μL de sonda de creatinina. Para o espaço em branco, use 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 1 – 2 μL de sonda de creatinina.
   4. Adicionar 50 μL da mistura de reacção adequada a cada poço na placa de 96 poços e incubar-o durante 60 min num agitador horizontal a 37 ° c. Proteja a placa da luz durante a incubação. Meça a absorvência em 570 nanômetro em um leitor da placa.
   5. Calcule as concentrações de creatinina subtraindo o valor em branco de todas as leituras. O resultado terá a unidade nanomoles/microlitro. Multiplicar a concentração de creatinina pelo peso molecular da creatinina (113,12 ng/nmol) para receber a unidade nanogramas/microlitro.

6. análise de dados

1. Calcule a concentração de urina FITC-polysacarose 70 da curva padrão.
2. Consulte as concentrações de urina FITC-polysacarose 70 em concentrações de creatinina na amostra de urina representativa.
3. Consulte as amostras de urina 60 min para amostras de urina 0 min de controles e camundongos tratados.

Resultados

Conforme representado na Figura 2, o método para testar a permeabilidade glomerular em camundongos é construído em três fases. A primeira fase é denominada fase de preparação, na qual se colocam um cateter urinário e um cateter venoso central. A segunda fase é chamada de fase de equilíbrio, iniciando com uma injeção intravenosa de bóculo de FITC-polysacarose 70 e seguida pela infusão contínua de FITC-polysacarose 70 por 60 min. A última fase é chamada de fase...

Discussão

O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) perícia manual em ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Motic SMZ168 BL	Motic	microscópio SMZ168BL	para cirurgia de camundongos
KL1500LCD	Pulch e Lorenz microscopia	150500	luz para cirurgia de camundongos
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	tesoura fina
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	para corte de pescoço
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	para cirurgia
Prä parierklemme	Aesculap	BJ008R	para cirurgia
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	fio de seda
Cetamina 10%	Medistar		anestesia
Rompun (xilazina) 2%	anestesia Bayer
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,28 mm OD 0,61 mm	Portex	800/100/100	Cateter
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,58 mm OD 0,96 mm	Cateter Portex	800/100/200
Aparelho Harvard 11 Plus	Aparelho Harvard	70-2209	bomba de seringa
BD Insyte Autoguard	BD	381823	cateter urinário
Detector multimodo DTX 880	Beckman Coulter		leitor de placas
384 poços microtitulação	Nunc	262260	384 placas de 384 poços
Kit de Ensaio de Creatinina	Sigma-Aldrich	MAK080	para medir a concentração de creatinina
placa de 96 poços	Nunc	260836	para ensaio de creatinina
Polissuccrose marcada com FITC 70	TBD Consultoria	FP70	FITC-ficoll
Angiotensina II	Sigma-Aldrich	A9525	usado para testar a permeabilidade glomerular
BP-98A	Softron		para medição da pressão arterial
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	placa de aquecimento para cirurgia de camundongos
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		para cateter urinário
Exacta	Aesculap	GT415	shaver