Summary
Здесь мы представляем протокол для проверки glomerular проницаемости у мышей с помощью высокочувствительных, нерадиоактивных трассировщик. Этот метод позволяет проводить повторные анализы мочи с небольшими объемами мочи.
Abstract
Потеря альбумина в моче (альбуминурия) предсказывает сердечно-сосудистый исход. В физиологических условиях, небольшое количество альбумина фильтруется гломерулем и поглощается в трубчатой системе до достижения предела поглощения. Раннее увеличение патологической фильтрации альбумина может, таким образом, быть пропущено при анализе альбуминурии. Поэтому использование трассеров для проверки гломерулярной пермякции представляется выгодным. Флуоресцентно помеченный трассик флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-полисукроз (т.е. FITC-Ficoll), может быть использован для изучения гломерулярной пермской вертики. Молекулы FITC-полисурозы свободно фильтруются гломерулем, но не поглощаются в трубчатой системе. У мышей и крыс, FITC-полисукроз был исследован в моделях гломерулярной проницаемости с помощью технически сложных процедур (т.е. радиоактивных измерений, высокопроизводительных жидких хроматографии (HPLC), фильтрации геля). Мы модифицировали и облегчили FITC-полисахарозный протокол на основе трассировщика для раннего и небольшого увеличения гломерулярной проницаемости fitC-polysucrose 70 (размер альбумина) у мышей. Этот метод позволяет проводить повторные анализы мочи с небольшими объемами мочи (5 кЛ). Этот протокол содержит информацию о том, как трассировщик FITC-полисукроз 70 применяется внутривенно и моча собирается с помощью простого мочевого катетера. Моча анализируется с помощью флуоресценционного считывателя пластин и нормализуется до маркера концентрации мочи (креатинин), тем самым избегая технически сложных процедур.
Introduction
Функциональные или структурные дефекты в пределах гломерулярного барьера фильтрации увеличивают гломерулярную проницаемость альбумина, в результате чего обнаружение альбумина в моче (альбуминурия). Альбуминурия предсказывает сердечно-сосудистые результаты и является важным маркером для glomerular травмы1. Даже низкие уровни альбуминурии, лежащие в пределах нормального диапазона, связаны с повышенным сердечно-сосудистым риском1.
В физиологических условиях альбумин фильтруется через гломерулус и почтиполностью поглощается в трубчатой системе 2,3. У мышей, обнаружение альбумина в моче, как правило, осуществляется альбумина фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA) от 24 ч сбора мочи. Если моча из 24 ч мочи или пятно мочи используется, небольшие различия в концентрации альбумина могут быть упущены из-за проблем с чувствительностью анализа. Большинство исследователей, таким образом, используют животные модели, в которых альбуминурия индуцируется надежной почечной травмы из-за токсинов, наркотиков и почечной хирургии.
Таким образом, поиск чувствительного метода для обнаружения небольших и переходных изменений в гломерулярной проницаемости очень важен для поля. Rippe et al. представили крысиную модель для проверки гломерулярной проницаемости, применяя флуоресцентно помеченный трассировщик, а именно FITC-polysucrose 70 (т.е. FITC-Ficoll 70), размером с альбумин4. Приложение трассировщик позволяет тестирование краткосрочных изменений в glomerular проницаемость (в течение нескольких минут) и очень чувствительны4. Два исследования использовали метод трассировщика у мышей5,6. Несмотря на свои преимущества, этот метод, к сожалению, имеет недостатки: он технически очень сложный, радиоактивный и инвазивный. Дальнейший анализ мочи осуществляется только с помощью гель фильтрации или размера исключения HPLC5,6.
В этой работе мы представляем альтернативный, чувствительный, нерадиоактивный и быстрый метод измерения гломерулярной проницаемости у мышей с помощью флуоресцентно помеченного FITC-полисуроз7. Вводя трансуретральный катетер, сбор мочи является менее инвазивным, чем прокол мочевого пузыря, уретотомия и супрапубического катетера применения, и позволяет сбор мочи по крайней мере каждые 30 минут. Анализ мочи выполняется из небольших количествах (5 л) с использованием флуоресцентный считыватель пластин. Концентрации трейда в моче нормализуются до креатинина концентрации в моче с помощью ферментативного анализа креатинина.
Таким образом, этот новый метод предлагает чувствительный инструмент для изучения ранней гломерулярной травмы с повышенной гломерулярной проницаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования проводились в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Публикация Национальных институтов здравоохранения США No 85-23, пересмотренный 1996 год). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими институциональными разрешениями (государственное правительство Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) справочный номер 84-02.04.2012.A397).
1. Подготовка инструментов, решений и оборудования
- Восстановите FITC-polysucrose 70 с 0,9% стерильного хлорида натрия (NaCl) до конечной концентрации 10 мг/мл (т.е. 100 мг в 10 мл NaCl).
- Диализ FITC-полисукоз 70 раствор для удаления свободных молекул FITC в одночасье при 4 градусах Цельсия (молекулярный вес отсечения (MWCO) на 10 000). Используйте 1 l 0.9% стерильных NaCl на 10 мл FITC-полисукозоза 70 при постоянном перемешивании. Защитите от света. Aliquot диализированный FITC-полисуроз 70 и хранить его при -20 градусах Цельсия.
- Для FITC-polysucrose 70 bolus добавьте 4 qL 10 мг/мл FITC-полисукроз 70 раствора до 996 л 0,9% NaCl (окончательная концентрация FITC-полисахаррозы 70: 40 мкг/мл).
- Для раствора эквилибриации инфузии добавьте 20 л 10 мг/мЛ FITC-полисуроз 70 к 9,98 мл стерильного NaCl, уступая конечной концентрации 20 мкг/мл.
- Для экспериментального раствора добавьте препараты или вещества в раствор инфузии (например, для ангиотензина II «Анг II» (Анг II) для 25 г мыши, добавьте 3 л Анг II раствора 1 мМ).
- Для операции приготовьте одну бритву, два хирургических зажима, одну пару хирургических ножниц, два пинцета, два тонких пинцета, одну пару тонких ножниц и тампоны. Приготовьте две шелковые нити 10 см (4-0- 6-0) для перевязок.
- Для размещения центрального венозного катетера приготовьте шприц калибра 10 мл с помощью иглы 21 Г. Поместите кончик иглы в катетер длиной 30 см (с внутренним диаметром 0,58 мм). Подключите катетер калибра 0,58 мм к катетеру 10 см (с идентификатором 0,28 мм). Вырезать кончик меньшекатия косой, чтобы создать острый кончик, который вводится в яремной вены.
- Приготовьте анестезию (т.е. интраперитонеальную анестезию кетамина, 100 мг/кг массы тела и ксилазин, 5 мг/кг массы тела).
- Подготовьте 22 G ангиокатетер, отбросив иглу и пометив катетер 1 см от кончика. Разогреть грелку до 37 градусов по Цельсию.
- Подготовьте устройство кровяного давления и при необходимости измените мембрану измерения артериального давления.
2. Этап подготовки
- Мочевый катетер
ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 2.1 следует протоколу, как описано Reis et al.7. На рисунке 1 и дополнительной рисунке 1 показано размещение мочевого катетера у самок мышей.- Анестезируемая мышь кетамин/ксилазин (см. шаг 1.8). Используйте тест на нос и щепотку для подтверждения правильной анестезии. Для поддержания анестезии повторяйте анестезию (например, с половиной дозы) после 60 мин. Правильная анестезия подтверждается, если тест на щепотку ног не приводит к рефлекторным снятию.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются женские мыши FVB. - Расположите мышь в царской реанисте на гробе 37 градусов по Цельсию. Затяните нижнюю часть живота и найдите уретраальный осиум (например, под микроскопом).
- Используйте пластиковую часть катетера 22 G ангиокатетера и смазать его ксилокаин гель. Введите его тщательно 3 мм в уретральный осий при параллельном дистальной оси уретры(рисунок 1A).
- Поверните верхнюю часть ангиокатетера 180 ", сохраняя кончик в уретральной остюи и поддержания оси уретры (Рисунок 1B).
- Введите катетер 7 мм дальше в мышь, так что он находится в мочевом пузыре(рисунок 1C). Не заставляйте катетер выйти за пределы сопротивления. Исправьте положение катетера с самого начала, если ощущается сопротивление. Принять к сведению, что если положение мочевого катетера является правильным, моча может уже появиться в катетере.
- Поместите 1,5 мл коричневой трубки поверх ангиокатера для сбора мочи. Нанесите 1 мл 0,9% NaCl подкожно для повышения производства мочи.
- Анестезируемая мышь кетамин/ксилазин (см. шаг 1.8). Используйте тест на нос и щепотку для подтверждения правильной анестезии. Для поддержания анестезии повторяйте анестезию (например, с половиной дозы) после 60 мин. Правильная анестезия подтверждается, если тест на щепотку ног не приводит к рефлекторным снятию.
- Центральный венозный катетер
- Бритье шеи мыши и поместите его в лежачих голову к хирургу. Гипернатягивайте голову мыши лентой.
- Дезинфицировать шею 70% изопропанола. Сделайте небольшой разрез кожи (5 мм) ниже челюсти, используя пинцет и ножницы. Вырезать кожу примерно на 1 см в направлении грудины до середины грудины достигается.
- Тщательно вскрыть кожу на правой стороне шеи, используя ножницы. Сделайте прямоугольный разрез кожи на правой стороне мыши, чтобы разоблачить мягкую ткань шеи. Используйте ножницы и пинцет. Закрепите кожу лоскутами двумя зажимами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яремная вена проходит вдоль левой стороны щитовидной железы или слегка покрыта правой долей щитовидной железы. После этого шага используйте микроскоп для операции. - Тщательно разоблачить яремную вену тупой подготовки, используя кончик тонкого пинцета. Избегайте травм венвиных ветвей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется удалить ткани мелкими ножницами. Будьте осторожны при использовании ножниц для удаления тканей, как это увеличивает риск кровотечения. - Поместите и закройте лигатуру шелковой нитью (4-0 к 6-0) в дистальной части видимой яремной вены (к голове мыши). Положите напряжение на лигатуру, закрепив шелковую нить лентой, чтобы обеспечить небольшое напряжение на яремной вены. Подготовьте лигатуру вокруг проксимальной части яремной вены.
- Заполните катетер раствором эквилиберации инфузии (см. шаг 1.4) и зафиксните катетер лентой так, чтобы катетер выровнял яремную вену. Контроль за пузырьками, чтобы избежать эмболии воздуха.
- Поднимите яремную вену мелкими пинцетом в месте вставки (место вставки 1-2 мм проксимальна лигатуры). Выровнять трубки параллельно яремной вены. Проколить яремную вену, направленную на просвет, и вставить примерно 2-4 мм, параллельно оси яремной вены. Избегайте оживленных движений.
- Закройте лигатуру, чтобы починить катетер. Контроль за герметичность лигатуры путем тщательного просмотра через микроскоп. Положите влажный тампон над местом операции.
- Измерение артериального давления
- Поместите хвост-манжеты в нижней части хвоста мыши в то время как мышь лежит в царских recumbency. Начните измерения и повторите их 10x в точке времени. Создайте среднее из измерений.
- Отрегулируйте положение хвостовой манжеты, если измерения артериального давления не кажутся правильными и ложные данные производятся.
3. Этап равновесия
- Измените трубку для сбора мочи до начала фазы равновесия и поместите ее на лед.
- Ввести 10 мл шприц заполнены FITC эквилибриации фазы решения (см. шаг 1.4) с 21 G иглы и большего катетера (с ID 0,58 мм) и поместить его в шприц насос.
- Сложите тампон и поместите его вокруг малотоннажного катетера (с идентификатором 0,28 мм), который вводится в яремную вену. Положите катетер внутри тампона. Поместите зажим над тампоном, чтобы отменить ретроградный кровоток или эмболию воздуха. Соедините 27 G иглу с 1 мл шприц заполнены FITC болюс в конце малого судна катетер.
- Откройте зажим и нанесите fitC bolus (100 л). Закройте зажим снова и соедините больший катетер с меньшим катетером. Запуск шприца насоса с 0,008 мл /мин (0,480 мл / ч). Продолжить настой в течение 60 мин.
4. Экспериментальная фаза
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, влияние наркотиков на glomerular пермьизбирательность может быть исследована.
- Измените мочевых труб (время точки 0 мин) на другой 1,5 мл коричневой трубки. Положите тампон вокруг катетера маломерного судна и закройте зажим, как указано в шаге 3.3.
- Отключите большой катетер от катетера маломерного судна. Измените шприцы на экспериментальные фазовые решения (см. шаг 1.5). Пусть инфузионный насос работает так, что большой катетер наполнен раствором равновесия.
- Воссоедините катетеры, избегая эмболии воздуха, и вновь откройте зажим. Запуск шприца насоса на 0,008 мл / мин.
- Продолжить запуск шприц насос в течение 60 минут и собирать мочу в мочевой трубке после этого (моча 60 мин). Поместите трубку мочи на лед.
- Пожертвуйте мышью путем вывиха шейки матки во время анестезии. Перед утилизацией мышь наблюдается в течение 5 минут, чтобы убедиться, что она мертва.
5. Анализ мочи
-
Измерение флуоресценции
- Оттепель мочевого бассейна и разбавить его 1:10 с фосфат-буфером солевая (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мочевый бассейн представляет собой бассейн мочи, которая была собрана из здоровых мышей в 12-24 ч мочи коллекции в метаболической клетке. - Подготовьте стандарты для измерения флуоресценции. Возьмите 10 коричневых трубок 1,5 мл и пометьте их пустыми (1:10 разбавленного бассейна мочи) и следующие концентрации FITC-polysucrose 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160 мкг/мл).
- Пипет 246 л разбавленного бассейна мочи в коричневую трубку 1,5 мл и добавить 4 л концентрации запасов FITC-polysucrose 70 (см. шаг 1.1), чтобы получить окончательную концентрацию 160 мкг/мл FITC-polysucrose 70. Пипетка 100 л разбавленного бассейна мочи во все остальные трубки.
- Разбавить 1:2 путем трубоукладки 100 л из 160 мкг/мЛ FITC-полисуроз 70 трубки в 80 мкг/мл трубки и продолжать с другими концентрациями. Обеспечить надлежащую смесь разбавленных концентраций (например, путем вихря трубки перед продолжением).
- Разбавить образцы мочи мыши (0 мин, 60 мин) 1:10 с разбавленным мочевого бассейна.
- Пипетка 5 зл и каждая стандартная концентрация FITC-polysucrose 70 и образцы мочи мыши в виде трипликируется в черной 384-хорошей пластине. Центрифуге пластины на 1000 х г в течение 15 с, чтобы избежать пузырьков.
- Проанализируйте 384-ну колодец в считывателе пластин. Выполните возбуждение на уровне 496 нм и измерьте флуоресценцию на уровне 525 нм.
- Оттепель мочевого бассейна и разбавить его 1:10 с фосфат-буфером солевая (PBS).
-
Измерение креатинина
- Следуйте инструкциям производителя. Вкратце, приготовьте стандарты креатинина, разбавив 10 мкм стандартного раствора креатинина 100 мМ с 990 зл и буфером креатинина для подготовки стандартного решения 1 мМ.
- Добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 л стандартного раствора креатинина 1 мМ в 96-колодственную пластину для генерации стандартов 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нмоль/колодца, соответственно. Добавьте крематининовый буфер асссея к каждой скважине, чтобы довести объем до 50 зл.
- Подготовьте реакционные смеси, добавив 42-44 л креатинина ассеабуфера, 2 злител креатиназы, 2 Зл креатининазы, 2 Зл азимоза креатинина и 2 Л креатинина. Для заготовки используйте 44 злител креатинина, 2 злителкреазы, 2 Зла смеси ферментов креатинина и 1-2 л креатинина.
- Добавьте 50 qL соответствующей реакции смеси для каждого колодца в 96-хорошо пластины и инкубировать его в течение 60 минут на горизонтальной шейкер при 37 градусов по Цельсию. Защитите пластину от света во время инкубации. Измерьте абсорбцию на 570 нм на плите считывателя.
- Рассчитайте концентрации креатинина, вычитая пустое значение из всех показаний. В результате будет единица наномол/микролитр. Умножьте концентрацию креатинина на молекулярный вес креатинина (113,12 нг/нмоль), чтобы получить единицу нанограмм/микролитр.
6. Анализ данных
- Рассчитайте концентрацию мочи FITC-polysucrose 70 от стандартной кривой.
- Справка FITC-полисуроуз 70 концентрации мочи на концентрации креатинина в репрезентативной мочи.
- Справка мочи 60 мин образцы мочи 0 мин образцы контроля и лечение мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 2, метод проверки гломерулярной проницаемости у мышей строится в три фазы. Первая фаза называется фазой подготовки, в которой помещаются мочевой катетер и центральный венозный катетер. Второй этап называется фазой равновесия, начиная с внутривенной инъекции болиса FITC-полисуроз 70 и с последующим непрерывным вливанием FITC-полисуроз7 на 60 мин. Последняя фаза называется экспериментальной фазой. На этом этапе продолжается вливание FITC-полисукроз 70 и лекарства или другие вещества могут быть проверены на влияние на гломерулярную проницаемость. Моча собирается в конце каждого этапа.
Для исследования glomerular проницаемость в этой модели трассировщика, важно разместить мочевой катетер правильно и без травмы слизистой оболочки. Размещение мочевого катетера в женский мышеловец демонстрируется на рисунке 1. Катетер помещается 3 мм в уретраальный остюй, параллельно оси кренооза(рисунок 1A). Катетер поворачивается на 180 градусов к хвосту мыши(рисунок 1B)и вводится 7 мм дальше в мочевой пузырь, параллельно морином позвоночника (рисунок1C, D).
Как описано выше, предыдущие методы для проверки glomerular проницаемости у мышей использовали HPLC для очистки FITC-полисукроз 70 сигналов из образцов мочи5,6. Поскольку этот метод использует измерения флуоресценции без предыдущего очищения трассировщика, PBS, мыши мочи, и FITC-полисуроуз 70 в моче мыши были проанализированы. На рисунке 3A показана флуоресценция PBS с пиком флуоресценции на уровне 325 нм, что, кажется, эффект вспышки возбуждения на 290 нм. Флуоресценция сканирования родной мочи мыши показывает флуоресценцию максимум на 395 нм(рисунок 3B). FITC-полисуроз 70 растворенный в моче мыши отображает максимальную флуоресценцию на 525 нм(рисунок 3C,D). Рисунок 3C показывает, что мышь мочи не нарушает флуоресценции измерения FITC-полисукроз 70 в моче мыши. Повышение концентраций FITC-полисуроз 70 показывает повышенную интенсивность флуоресценции(рисунок 3E).
Чтобы доказать, что этот метод способен обнаруживать различия в гломерулярной проницаемости, Ang II был применен в экспериментальной фазе модели. Анг II увеличил glomerular проницаемость у мышей 60 мин после непрерывного введения в некровных давления соответствующих дозах(Рисунок 4A, B). Увеличение гломерулярной проницаемости из-за Анг II может быть заблокирован блокатором Ang II-рецепторов (ARB), а именно кандессаран(рисунок 4A). Анг II вымывания снижение glomerular проницаемость(Рисунок 4A). Кровяное давление измерялось методом хвостовой манжеты и не проявляло существенных различий между группами(рисунок 4B). Полисукроз 70- и FITC-полисукроз 70-настоянные животные служат в качестве контроля для FITC-полисахарроз7 70- и Анг II обработанных животных (Рисунок 4C).
Рисунок 1: Размещение мочевого катетера у самок мышей. Боковой вид мыши ногой живота. (A) Отмеченный и смазанный катетер вводится 3 мм во внешний уретраальный осиу женской мыши. Оси черепозаводского уретры параллельна с катетером. Тщательное натяжение на нижней части живота левым указательным пальцем облегчает введение катетера во внешний уретраальный осиум. (B) Катетер поворачивается на 180 градусов к хвосту мыши. Кончик катетера остается 3 мм во внешнем уретраальном остиуме. (C) Катетер в настоящее время вводится 7 мм дальше в мочевой пузырь. Направление катетера выравнивается с морин-позвоночником. (D) Вентральный вид мыши живота. Катетер помещается 10 мм в мышь. (E) Моча появляется с правильной вставкой в мочевой пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация экспериментальных процедур на временной шкале. После наркоза мыши помещается мочевой катетер. Имплантируется центральный венозный катетер и получена базовая моча (0 мин). После этого FITC-polysucrose 70 bolus наносится через центральный венозный катетер и начинается непрерывный вливание FITC-полисуроз 70. Уравновешительная фаза для FITC-полисукроз 70 длится 60 мин. Моча собирается после фазы равновесия (0 мин) и до начала экспериментальной фазы. В течение этой фазы, наркотики или другие вещества (например, ангиотензин II) могут быть применены. В конце экспериментальной фазы моча получается для анализа (60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Флуоресценция PBS и мыши мочи с и без FITC-полисукроз 70. (A) Флуоресценция частоты сканирования (возбуждение 290 нм, выброс 325-700 нм) PBS показывает сигнал на 325 нм, который, кажется, эффект возбуждения вспышки на 290 нм. (B) В частотном сканировании мыши родной мочи (моча бассейн разбавленной в 1:10 и 1:20), есть сигнал с максимумом на 395 нм, вероятно, вызванные мочевого белка автофлуоресценции. (C) Мышь мочи, содержащей FITC-полисукроз 70 (40 мкг/мл) показывает пик сигнала на 525 нм, что не мешает измерению аутофлуоресценции мочи. (D) Увеличение FITC-полисукрозы 70 флуоресценции пик в зависимости от длины волны выбросов. Отображаются различные концентрации FITC-полисукроз70 (1.25, 2.5, 5, 10, 20 и 40 мкг/мл). (E) Увеличение FITC-полисуроз 70 концентраций показывают увеличение интенсивности флуоресценции при эмиссии 525 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Ангиотензин II (Анг II) увеличивает гломерулярную проницаемость. (A) Анг II значительно увеличивает гломерулярной проницаемости у мышей, измеряется FITC-полисуроуз 70 обнаружения в моче мышей (средний - SEM; n No 5; р Злт; 0,004, протестированный тестом Крускал-Валлиса). FITC-полисуроз 70 концентраций в моче были упомянуты к концентрации креатинина мочи. Белые колонны (0 мин) представляют FITC-polysucrose 70 уровней до начала стимуляции Анг II, черные колонны (60 мин) представляют FITC-полисахаррозы 70 уровней 60 мин после начала стимуляции Ang II, и серые колонны (120 мин или 60 мин) после дополнительные 60 мин стимуляции Анг II или 60 мин вымывания Ang II. (B) Систолическое кровяное давление контролировалось методом хвостовой манжеты (средний - SEM). Никаких значительных различий в кровяном давлении между контрольной и Анг II-обработанных групп были отмечены. (C) Полисахарроз70 и FITC-полисахаррозы 70 не изменяют glomerular проницаемость у мышей значительно. Ang II значительно повышает гломерулярную проницаемость у мышей (средний - SEM; n No 7, стр. Эта цифра была изменена с Konigshausen и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Схематическая диаграмма размещения мочевого катетера у самок мышей. Боковой вид мыши ногой живота. (A) Отмеченный и смазанный катетер вводится 3 мм во внешний уретраальный осиу женской мыши. Оси черепозаводского уретры параллельна с катетером. Тщательное натяжение на нижней части живота левым указательным пальцем облегчает введение катетера во внешний уретраальный осиум. (B) Катетер поворачивается на 180 градусов к хвосту мыши. Кончик катетера остается 3 мм во внешнем уретраальном остиуме. (C) Катетер в настоящее время вводится 7 мм дальше в мочевой пузырь. Направление катетера выравнивается с морин-позвоночником. (D) Вентральный вид мыши живота. Катетер вводится 3 мм во внешний уретраальный осиу самоки мыши. (E) После того, как катетер поворачивается на 180 градусов, он вводится на 7 мм дальше в мышеловачный пузырь. Направление катетера выравнивается с морин-позвоночником. Эта цифра была изменена от Reis и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный метод позволяет исследователю проверить glomerular проницаемость у мышей в очень чувствительным образом с помощью трассировщика. С помощью этого метода, краткосрочное увеличение гломерулярной проницаемости может быть диагностировано с использованием только небольшое количество мочи. Наиболее важными шагами для успешного освоения этой техники являются 1) развитие ручного опыта в хирургии мыши, особенно в каннулуляции центральной вены, 2) размещение мочевого катетера без ущерба для слизистой оболочки, и 3) ручной опыт в обработке 384-колодцы с небольшими объемами образцов.
При размещении центрального венозного катетера важно, чтобы катетер не проникал в яремную вену. Чтобы избежать проникновения, мы рекомендуем напрягать яремную вену дистальной лигатурой (см. шаг 2.2.7) и поднять яремную вену тонкими пинцетом, чтобы продлить просвет яремной вены. Чтобы сохранить место вставки небольшой, старайтесь избегать грубых движений при вставке катетера и всегда обеспечить лучший вид хирургического поля, удалив дополнительную ткань. Наиболее важным шагом в размещении мочевого катетера является окончательная вставка в мочевой пузырь. При наличии сопротивления мы рекомендуем начинать с самого начала, чтобы не вызывать ложных следов и травмсивать слизистую оболочку. Вращение катетера, смазка и нежные движения, а также тренировки помогают в сложных случаях7.
FITC-полисуроз 70 является флуоресцентно помечены, разветвленной и кросс-связанных полимер сахарозы и эпиглорохидрина9. Он ведет себя в растворе как шаровая молекула с сферической формой и с низкой асимметрией формы, но с молекулярной деформацией9. Как и другие молекулы сахарозы, FITC-полисукроз 70 фильтруется glomerulus и не поглощается в трубчатой системе4. Чтобы избежать свободных молекул FITC в настой, мы диализировали FITC-полисукроз 70 раствор перед применением к мышам. Можно хранить диализированные FITC-полисукроз 70 молекул при -20 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев. Поскольку FITC-polysucrose 70 применяется внутривенно в этом и других протоколах, важно, чтобы кровь не загрязннесла образцы мочи. Поэтому, мочевой катетер должен быть помещен с осторожностью и антикоагулянтных веществ в рамках эксперимента следует избегать. Стандартная кривая для FITC-polysucrose 70 растворяется в бассейне с мочой мыши, чтобы получить наиболее точные результаты. Из-за разницы в концентрации мочи в различных экспериментальных временных точках и между группами, FITC-полисукроз 70 концентраций должны быть ссылки на маркер в моче, который отражает концентрацию мочи (например, креатинин). Вмешательство FITC-полисуроз 70 флуоресценции с измерением креатинина в ферментативном ассее вряд ли.
Анализ FITC-полисуроз 70 флуоресценции должен быть выполнен в черных 384-хорошо пластин, как небольшие объемы мочи 5 ЗЛ могут быть измерены в этих пластинах. Мы не рекомендуем повторно использовать те же скважины в 384-колодцев, даже после мытья пластин, так как флуоресценция все еще измерима. Как пузырьки вмешиваться в чтении флуоресценции, пластины должны быть центрифуги до анализа. Кроме того, пузыри могут быть уничтожены вручную кончиком пипетки.
Использование полисахарозов для тестирования гломерулярной пермякости было описано почти 40 лет назад10. Флуоресцентно помечены полисахароз был исследован в glomerular исследования травмы почти исключительно у крыс в последние годы4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Это может иметь анатомические причины из-за более легких хирургических процедур у крыс, чем у мышей. У крыс уретротомия используется дляполучения образцов мочи 4,5,9,12,13,14,21. Для анализа образцов плазмы и мочи, зонды подвергаются высокопроизводительной размерной хроматографии4,5,9,12,13,14 ,21. Кроме того, гломерулярная скорость фильтрации (GFR) измеряется радиоактивным 51Cr-этиленедиамин тетраацетической кислоты (ЭДТА)4,5,9,12,13 ,14,21. Два предыдущих исследования применили FITC-полисукроз 70 у мышей5,6. У мышей, супрапубический мочевой катетер вводится в мочевой пузырь6,20. Мочевые и плазменные зонды подвергаются фильтрации геля перед анализом FITC-полисурозы 70 флуоресценции. Как и у крыс, GFR был проанализирован с помощью радиоактивности6,20. Вторая публикация, касающаяся применения FITC-полисукроз 70 у мышей использует модель перитонеальной проницаемости и, следовательно, не анализировать мочу мыши для FITC-полисукрозы 70 флуоресценции22. Поэтому представленный метод был модифицирован для облегчения отбора проб мочи и анализа. Образцы мочи могут быть легко получены с помощью неинвазивного трансуретрального мочевого катетера. Анализ мочи для FITC-полисуроз 70 флуоресценции выполняется без каких-либо предыдущих высокопроизводительных размер овсяных хроматографии или фильтрации геля. Ссылаясь на FITC-полисуроз 70 флуоресценции на креминин мочи мыши, измерение GFR с радиоактивным анализом не требуется.
Повышение артериального давления повышает гломерулярную проницаемость. Таким образом, мониторинг артериального давления имеет важное значение при исследовании glomerular проницаемости. Наиболее точные измерения артериального давления у мышей выполняются с помощью центрального артериального катетера23, нуждающихся в гепаринации катетера для предотвращения свертывания. У нас возникли проблемы с гематурией после низкодозной гепаринизации и размещения мочевого катетера. Поэтому мы решили выполнить методику хвостовой манжеты для измерения артериального давления, которая неинвазивна и не нуждается в гепаринизации. В зависимости от глубины анестезии, мониторинг артериального давления с помощью метода хвостовой манжеты иногда является сложной задачей. Мембраны кровяного давления должны быть проверены заранее и положение мыши должны быть оптимизированы до записи кровяного давления.
В дополнение к проблемам в измерении артериального давления, этот метод также ограничен, производя произвольные единицы FITC-полисуроз 70. До сих пор этот метод исследовался только у животных, и, следовательно, его отношение к человеческому гломерулярному фильтру до сих пор неизвестно. Временные интервалы для исследования увеличения гломерулярной проницаемости зависит от производства мочи мыши. Таким образом, очень кратковременное увеличение гломерулярной проницаемости (в минутах) может быть пропущено из-за отсутствия производства мочи мыши. В этом протоколе FITC-polysucrose 70 нормализуется с креатинином мочи, который удаляется из крови в основном через гломерулярную фильтрацию, но также и проксимальной трубчатой секреции. Это позволит ввести ошибку при оценке glomerular проницаемости с помощьюэтого метода, уменьшая измеренный дробный очистки полисахароз24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Кристину Швандт, Бланку Дувняк и Николу Кур за исключительную техническую помощь и доктора Денниса Сона за помощь в сканировании флуоресценции. Это исследование было поддержано грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 в Л.К.Р. и Л.С. Фонднера не принимала никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
