Summary
Qui, presentiamo un protocollo per testare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando un tracciante altamente sensibile e non radioattivo. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina.
Abstract
La perdita di albumina nelle urine (albuminuria) predice l'esito cardiovascolare. In condizioni fisiologiche, piccole quantità di albumina vengono filtrate dal glomerulus e riassorbite nel sistema tubolare fino al raggiungimento del limite di assorbimento. I primi aumenti nella filtrazione dell'albumina patologica possono, quindi, essere persi analizzando l'albuminuria. Pertanto, l'uso di traccianti per testare la permselettività glomerare appare vantaggioso. Fluorescentemente etichettato tracer fluoresceinisociocionanato (FITC)-polisucrosi (cioè FITC-Ficoll), può essere utilizzato per studiare la permselettività glomerare. Le molecole di fitC-polisucrosi vengono liberamente filtrate dal glomerulus ma non riassorbite nel sistema tubolare. Nei topi e nei ratti, la polisucrosi FITC è stata studiata in modelli di permeabilità glomerare utilizzando procedure tecnicamente complesse (ad esempio, misurazioni radioattive, cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC], filtrazione del gel). Abbiamo modificato e facilitato un protocollo basato su tracciante FITC-polysucrosi per testare precoce e piccoli aumenti della permeabilità glomerare al polidiagnosi DI FITC 70 (dimensioni dell'albumina) nei topi. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina (5 o L). Questo protocollo contiene informazioni su come il tracciante FITC-polysucrose 70 viene applicato per via endovenosa e l'urina viene raccolta attraverso un semplice catetere urinario. L'urina viene analizzata tramite un lettore di piastra di fluorescenza e normalizzata in un marcatore di concentrazione delle urine (creatinina), evitando così procedure tecnicamente complesse.
Introduction
I difetti funzionali o strutturali all'interno della barriera di filtrazione glomeulare aumentano la permeabilità glomerare all'albumina, con conseguente individuazione dell'albumina nelle urine (albuminuria). Albuminuria predice l'esito cardiovascolare ed è un marcatore importante per lesioni glomeriule1. Anche bassi livelli di albuminuria, che si trovano all'interno della gamma normale, sono associati ad un aumento del rischio cardiovascolare1.
In condizioni fisiologiche, l'albumina viene filtrata attraverso il glomerulus ed è quasi completamente riassorbita nel sistema tubolare2,3. Nei topi, il rilevamento dell'albumina nelle urine è di solito eseguita da un saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA) da 24 h di raccolta delle urine. Se si usa l'urina di una raccolta di urina di 24 ore o di un'urina spot, piccole differenze nelle concentrazioni di albumine possono essere perse a causa di problemi di sensibilità all'analisi. La maggior parte dei ricercatori, quindi, utilizza modelli animali in cui l'albuminuria è indotta da robuste lesioni renali a causa di tossine, farmaci e chirurgia renale.
Pertanto, la scoperta di un metodo sensibile per rilevare piccoli e transitori cambiamenti nella permeabilità glomerare è molto importante per il campo. Rippe et al. hanno presentato un modello di ratto per testare la permeabilità glomerare applicando un tracciante fluorescente, vale a dire FITC-polysucrose 70 (cioè FITC-Ficoll 70), con le dimensioni dell'albumina4. L'applicazione tracer consente di testare le modifiche a breve termine nella permeabilità glomerare (in pochi minuti) ed è molto sensibile4. Due studi hanno utilizzato il metodo del tracciante nei topi5,6. Nonostante i suoi benefici, questo metodo, purtroppo, ha svantaggi: è tecnicamente molto complesso, radioattivo e invasivo. Ulteriori analisi delle urine viene effettuata solo utilizzando la filtrazione in gel o l'esclusione delle dimensioni HPLC5,6.
All'interno di questo documento, presentiamo un metodo alternativo, sensibile, non radioattivo e veloce per misurare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando fluorescentmente etichettato FITC-polysucrose 70. Con l'introduzione di un catetere transuretrale, la raccolta delle urine è meno invasiva della puntura della vescica, dell'uretrotomia e dell'applicazione del catetere soprapubico e consente la raccolta delle urine almeno ogni 30 min. lettore di piastre fluorescenti. Le concentrazioni di traccianti nelle urine sono normalizzate alle concentrazioni di creatinina nelle urine utilizzando un saggio di creatinina enzimatico.
Pertanto, questo nuovo metodo offre uno strumento sensibile per studiare le lesioni più precoci glomerari con una maggiore permeabilità glomerare.
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Protocol
Le indagini sono state condotte secondo le linee guida delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (US National Institutes of Health Publication No. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con le pertinenti approvazioni istituzionali (governo statale Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numero di riferimento 84-02.04.2012.A397).
1. Preparazione di strumenti, soluzioni e attrezzature
- Ricostituire il cloruro di sodio sterile (NaCl) allo 0,9% di cloruro di sodio sterile (NaCl) a una concentrazione finale di 10 mg/mL (cioè 100 mg in 10 mL di NaCl).
- Diallyze soluzione FITC-polysucrosi 70 per rimuovere le molecole FITC gratuite durante la notte a 4 gradi centigradi (taglio del peso molecolare [MWCO] a 10.000). Utilizzare 1 L dello 0,9% di NaCl sterile per 10 mL di FITC-polysucrose 70 in costante agitazione. Proteggere dalla luce. Aliquota la dialisce FITC-polysucrose 70 e conservarla a -20 gradi centigradi.
- Per il FITC-polisucrose 70 bolus, aggiungere la soluzione 4 -L L di 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 a 996 - L dello 0,9% NaCl (la concentrazione finale di FITC-polisucrosi 70: 40 g/mL).
- Per la soluzione di infusione equilibrata, aggiungere 20 -L di una soluzione da 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 a 9,98 mL dello 0,9% sterile NaCl, con una concentrazione finale di 20g/mL.
- Per la soluzione sperimentale, aggiungere farmaci o sostanze alla soluzione di infusione (ad esempio, per l'angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] per un topo da 25 g, aggiungere 3 L di Ang II di una soluzione da 1 mM).
- Per l'intervento, preparare un rasoio, due morsetti chirurgici, un paio di forbici chirurgiche, due pinzette, due pinzette sottili, un paio di forbici fini e tamponi. Preparare due fili di seta da 10 cm (da 4-0 a 6-0) per le procedure di ligazione.
- Per il posizionamento di un catetere venoso centrale, preparare una siringa da 10 mL con un ago da 21 G. Posizionare la punta dell'ago in un catetere lungo 30 cm (con un diametro interno [ID] di 0,58 mm). Collegare il catetere da 0,58 mm a un catetere di 10 cm (con ID di 0,28 mm). Tagliare la punta del catetere più piccolo obliquo per creare una punta affilata che viene introdotta nella vena giugulare.
- Preparare l'anestesia (ad esempio, anestesia intraperitoneale ketamina, 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina, 5 mg/kg di peso corporeo).
- Preparare un angiocate da 22 G scartando l'ago e segnando il catetere di 1 cm dalla punta. Preriscaldare la piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi.
- Preparare un dispositivo di pressione sanguigna e cambiare la membrana di misurazione della pressione sanguigna, se necessario.
2. Fase di preparazione
- Catetere urinario
NOTA: La sezione 2.1 segue il protocollo descritto da Reis etal. Figura 1 e Figura supplementare 1 Mostra il posizionamento di un catetere urinario nei topi femminili.- Anestesizzare il topo con ketamina/xylazina (vedere il punto 1.8). Utilizzare il test del pizzico di dita dei immi per confermare l'anestesia corretta. Per mantenere l'anestesia, ripetere l'anestesia (ad esempio, con la metà del dosaggio) dopo 60 min. L'anestesia corretta è confermata se il test del pizzico della dita non si traducono in ritiro riflesso.
NOTA: in questo protocollo vengono utilizzati mouse FVB femminili. - Posizionare il mouse in recumbency dorsale su un pad di riscaldamento a 37 gradi centigradi. Stringere l'addome inferiore e trovare l'ostium uretrale (ad esempio, al microscopio).
- Utilizzare la parte plastica del catetere di un angiocater da 22 G e lubrificarla con gel xilocaina. Introdurlo con attenzione 3 mm nell'ostio uretrale parallelamente all'asse uretrale distale (Figura 1A).
- Ruotare la parte superiore dell'angiocatere di 180 gradi mantenendo la punta all'interno dell'ostio uretrale e mantenendo l'asse dell'uretra (Figura 1B).
- Introdurre il catetere 7 mm più avanti nel mouse in modo che sia posizionato all'interno della vescica (Figura 1C). Non forzare il catetere oltre la resistenza. Correggere la posizione del catetere fin dall'inizio se si avverte resistenza. Prendere nota che se la posizione del catetere urinario è corretta, l'urina potrebbe già apparire all'interno del catetere.
- Posizionare un tubo marrone di 1,5 ml sopra la parte superiore dell'angiocater per raccogliere l'urina. Applicare 1 mL di 0,9% NaCl sottocutaneamente per migliorare la produzione di urina.
- Anestesizzare il topo con ketamina/xylazina (vedere il punto 1.8). Utilizzare il test del pizzico di dita dei immi per confermare l'anestesia corretta. Per mantenere l'anestesia, ripetere l'anestesia (ad esempio, con la metà del dosaggio) dopo 60 min. L'anestesia corretta è confermata se il test del pizzico della dita non si traducono in ritiro riflesso.
- Catetere venoso centrale
- Rasare il collo del mouse e posizionarlo in recumbency con la testa verso il chirurgo. Hyperestendere la testa del mouse con un nastro.
- Disinfettare il collo con il 70% di isopropanolo. Fare una piccola incisione cutanea (5 mm) sotto la mascella, utilizzando una pinzetta e un paio di forbici. Tagliare la pelle di circa 1 cm nella direzione dello sterno fino a raggiungere il centro dello sterno.
- Sezionare attentamente la pelle sul lato destro del collo, utilizzando un paio di forbici. Fare un'incisione rettangolare della pelle sul lato destro del mouse per esporre il tessuto molle del collo. Usa un paio di forbici e una pinzetta. Fissare i lembi della pelle con due morsetti.
NOTA: La vena giugulare corre lungo il lato sinistro della ghiandola tiroidea o è leggermente coperta dal lobo destro della ghiandola tiroidea. Dopo questo passaggio, utilizzare un microscopio per l'intervento chirurgico. - Esporre con attenzione la vena giugulare mediante preparazione smussata, utilizzando la punta della pinzetta fine. Evitare lesioni arami di vena.
NOTA: Potrebbe essere necessario rimuovere i tessuti con forbici fini. Fare attenzione quando si utilizzano le forbici per rimuovere il tessuto in quanto aumenta il rischio di sanguinamento. - Posizionare e chiudere una legatura con un filo di seta (da 4-0 a 6-0) nella parte distale della vena giugulare visibile (verso la testa del topo). Mettere la tensione sulla legatura fissando il filo di seta con un nastro adesivo per garantire una leggera tensione sulla vena giugulare. Preparare una legatura intorno alla parte prossimale della vena giugulare.
- Riempire il catetere con la soluzione di infusione di conquistimento (vedere il punto 1.4) e fissare il catetere con un nastro in modo che il catetere sia allineante la vena giugulare. Controllo delle bolle per evitare l'embolia dell'aria.
- Sollevare la vena giugulare con pinzette sottili sul sito di inserimento (il sito di inserimento è 1–2 mm proximal della legatura). Allineare il tubo parallelo alla vena giugulare. Forare la vena giugulare, puntando al lume, e inserire per circa 2-4 mm, parallelamente all'asse della vena giugulare. Evitare movimenti vivaci.
- Chiudere la legatura per fissare il catetere. Controllo della tenuta della legatura esaminando attentamente il microscopio. Mettere un tampb umido sul sito di chirurgia.
- Misurazione della pressione sanguigna
- Posizionare il polsino di coda nella parte inferiore della coda del mouse mentre il mouse giace in recumbency dorsale. Avviare le misurazioni e ripeterle 10 volte per punto temporale. Costruire una media dalle misurazioni.
- Regolare la posizione del polsino della coda se le misurazioni della pressione sanguigna non sembrano corrette e vengono prodotti dati falsi.
3. Fase di equilibratore
- Cambiare il tubo di raccolta urinaria prima dell'inizio della fase di equilibratura e posizionarlo sul ghiaccio.
- Introdurre una siringa da 10 mL riempita con soluzione di fase di equilibraton FITC (vedi punto 1.4) con un ago da 21 G e il catetere più grande (con un ID di 0,58 mm) e posizionarlo nella pompa della siringa.
- Piegare un tampone e metterlo intorno al catetere della piccola nave (con id di 0,28 mm) che viene introdotto nella vena giugulare. Posare il catetere all'interno del tampone. Mettere un morsetto sopra il tampone per abolire il flusso sanguigno retrogrado o l'embolia dell'aria. Collegare un ago da 27 G con una siringa da 1 mL riempita con il bolo FITC fino alla fine del catetere a piccola nave.
- Aprire il morsetto e applicare il bolus FITC (100 l). Chiudere nuovamente il morsetto e collegare il catetere più grande con il catetere più piccolo. Avviare la pompa della siringa con 0,008 mL/min (0,480 mL/h). Continuare l'infusione per 60 min.
4. Fase sperimentale
NOTA: In questa fase, l'effetto dei farmaci sulla permselettività glomerare può essere studiato.
- Cambiare il tubo urinario (punto temporale 0 min) ad un altro tubo marrone da 1,5 ml. Mettere un tampone intorno al catetere della piccola nave e chiudere un morsetto come indicato al punto 3.3.
- Scollegare il catetere grande dal catetere della piccola nave. Modificare le siringhe per le soluzioni di fase sperimentale (vedere il passaggio 1.5). Lasciare correre la pompa di infusione in modo che il grande catetere sia riempito con la soluzione equilibration.
- Ricollegare i cateteri evitando l'embolia dell'aria e riaprire il morsetto. Avviare la pompa della siringa a 0,008 mL/min.
- Continuare a far funzionare la pompa della siringa per 60 min e raccogliere l'urina all'interno del tubo urinario in seguito (urina 60 min). Posizionare il tubo delle urine sul ghiaccio.
- Sacrificare il topo dalla lussazione cervicale durante l'anestesia. Prima dello smaltimento il topo viene osservato per 5 minuti per assicurarsi che sia morto.
5. Analisi dell'urina
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Misurazione della fluorescenza
- Scongelare la piscina urinaria e diluirla 1:10 con salina tampone fosfato (PBS).
NOTA: La piscina urinaria è una pozza di urina che è stata raccolta da topi sani in una raccolta di urina 12-24 h in una gabbia metabolica. - Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza. Prendete 10 tubi marroni da 1,5 mL ed etichettateli per il vuoto (1:10 diluito pool di urina) e le seguenti 70 concentrazioni DI FITC-polysucrose (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 g/mL).
- Pipet 246 - L di pozza di urina diluita in un tubo marrone da 1,5 ml e aggiungete 4 -L della concentrazione di scorte FITC-polysucrose 70 (vedi passo 1.1) per ottenere una concentrazione finale di 160 g/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 L della pozza di urina diluita in tutti gli altri tubi.
- Diluire 1:2 con la pipa 100 l del tubo FITC-polysucrose 70 da 160 g/mL nel tubo 80 g/mL e continuare con le altre concentrazioni. Assicurare una corretta miscela delle concentrazioni diluite (ad esempio, vorticendo il tubo prima di continuare).
- Diluire i campioni di urina di topo (0 min, 60 min) 1:10 con piscina urinaria diluita.
- Pipetta 5 - L di ogni concentrazione standard di FITC-polysucrose 70 e dei campioni di urina di topo come triplicati in una piastra nera di 384 pozze. Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 15 s per evitare bolle.
- Analizzare la piastra 384-po in un lettore di lamiere. Eseguire l'eccitazione a 496 nm e misurare la fluorescenza a 525 nm.
- Scongelare la piscina urinaria e diluirla 1:10 con salina tampone fosfato (PBS).
-
Misurazione della creatinina
- Seguire le istruzioni del produttore. In breve, preparate gli standard di creatinina diluindo 10 L della soluzione standard di 100 m di creatinina con 990 tamponi di assaggio creatinina per preparare una soluzione standard da 1 mM.
- Aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 L della soluzione standard di 1 mM creatinina in una piastra di 96 pozze per generare rispettivamente gli standard 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol/well. Aggiungere il tampone di assaggio creatinina in ogni pozzo per portare il volume a 50.L.
- Preparare le miscele di reazione aggiungendo un buffer di 42-44 gradi di assaggio di creatinina, 2 l di creatina, 2 anni di creatinina, 2 -L di miscela di enzimi creatinina e 2 -L di sonda creatinina. Per il vuoto, utilizzare 44 l di buffer di asina creatinina, 2 litri di creatina, 2 l di miscela di enzimi creatinina e 1-2 di sonda di creatinina.
- Aggiungere 50 l del mix di reazione appropriato ad ogni pozzo nella piastra 96-well e incubarlo per 60 min su uno shaker orizzontale a 37 gradi centigradi. Proteggere la piastra dalla luce durante l'incubazione. Misurare l'assorbimento a 570 nm su un lettore di lamiere.
- Calcolare le concentrazioni di creatinina sottraendo il valore vuoto da tutte le letture. Il risultato avrà l'unità nanomole/microlitro. Moltiplicare la concentrazione di creatinina per il peso molecolare della creatinina (113.12 ng/nmol) per ricevere l'unità nanogrammi/microlitro.
6. Analisi dei dati
- Calcolare la concentrazione di urina FITC-polysucrose 70 dalla curva standard.
- Fare riferimento al FITC-polysucrose 70 concentrazioni di urina alle concentrazioni di creatinina nel campione di urina rappresentativo.
- Fare riferimento ai campioni di urina 60 min per urina 0 min campioni di controlli e topi trattati.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 2, il metodo per testare la permeabilità glomerare nei topi è costruito in tre fasi. La prima fase è chiamata fase di preparazione, in cui sono posizionati un catetere urinario e un catetere venoso centrale. La seconda fase è chiamata fase di equilibratione, a partire da un'iniezione di bolus endovenosa di FITC-polysucrose 70 e seguita dalla continua infusione di FITC-polysucrose 70 per 60 min. L'ultima fase è chiamata fase sperimentale. In questa fase, l'infusione di FITC-polysucrose 70 continua e i farmaci o altre sostanze possono essere testati per influenzare la permeabilità glomerare. L'urina viene raccolta alla fine di ogni fase.
Per studiare la permeabilità glomerare all'interno di questo modello di tracciante, è essenziale posizionare un catetere urinario correttamente e senza ferire la mucosa. Il posizionamento di un catetere urinario in una vescica del topo femminile è dimostrato nella Figura 1. Il catetere è posto 3 mm nell'ostio uretrale, parallelo all'asse uretrale craniocaudale (Figura 1A). Il catetere viene ruotato di 180 gradi verso la coda del topo (Figura 1B) e ha introdotto 7 mm più avanti nella vescica, parallela alla colonna vertebrale murina (Figura 1C, D).
Come descritto in precedenza, i metodi precedenti per testare la permeabilità glomerare nei topi utilizzavano HPLC per purificare i 70 segnali da campioni di urina5,6. Poiché questo metodo utilizza la misurazione della fluorescenza senza una precedente purificazione del tracciante, sono state analizzate le urine di topo e di policroco FITC e 70 nell'urina di topo. La figura 3A mostra la scansione a fluorescenza di PBS con un picco di fluorescenza a 325 nm, che sembra essere un effetto del flash di eccitazione a 290 nm. La scansione della fluorescenza dell'urina di topo nativo mostra un massimo di fluorescenza a 395 nm (Figura 3B). FitC-polysucrose 70 disciolto nelle urine di topo mostra un massimo di fluorescenza a 525 nm (Figura 3C, D). La figura 3C mostra che l'urina di topo non disturba la misurazione della fluorescenza del FITC-polisucrosi 70 nell'urina del topo. L'aumento delle concentrazioni di FITC-polysucrose 70 mostra un aumento dell'intensità della fluorescenza (Figura 3E).
Per dimostrare che questo metodo è in grado di rilevare le differenze nella permeabilità glomerare, Ang II è stato applicato nella fase sperimentale del modello. Ang II ha aumentato la permeabilità glomerare nei topi 60 min dopo una somministrazione continua in dosaggi non rilevanti per la pressione sanguigna (Figura 4A, B). L'aumento della permeabilità glomerare dovuto ad Ang II potrebbe essere bloccato da un bloccante recettore Ang II (ARB), vale a dire candesartan (Figura 4A). Ang II washout diminuito permealità glomerare (Figura 4A). La pressione sanguigna è stata misurata tramite il metodo tail-cuff e non ha mostrato differenze significative tra i gruppi (Figura 4B). Gli animali polisucrosi 70 e FITC-polysucrose a 70 infusi a 70 infuso fungono da controlli per gli animali trattati con 70 e ang II (Figura 4C).
Figura 1: Posizionamento di un catetere urinario nei topi femminili. Vista laterale dell'addome del topo. (A) Il catetere marcato e lubrificato viene introdotto 3 mm nell'ostium uretrale esterno di un topo femmina. L'asse craniocaudale dell'uretra è parallelo al catetere. Un'attenta tensione sull'addome inferiore con l'indice sinistro facilita l'introduzione del catetere nell'ostio uretrale esterno. (B) Il catetere viene ruotato di 180 gradi verso la coda del mouse. La punta del catetere rimane di 3 mm all'interno dell'ostio uretrale esterno. (C) Il catetere è ora introdotto 7 mm più avanti nella vescica. La direzione del catetere è allineata con la colonna vertebrale murina. (D) Vista ventrale dell'addome del topo. Il catetere è posizionato 10 mm nel mouse. (E) L'urina appare con un corretto inserimento nella vescica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica delle procedure sperimentali in una sequenza temporale. Dopo la narcosi del topo, viene posizionato un catetere urinario. Il catetere venoso centrale viene impiantato e si ottiene l'urina di base (0 min). Successivamente, il fitC-polysucrose 70 bolo viene applicato attraverso il catetere venoso centrale e viene avviata un'infusione continua di FITC-polysucrose 70. La fase di equilibratione per FITC-polysucrose 70 dura 60 min. L'urina viene raccolta dopo la fase di fase (0 min) e prima dell'inizio della fase sperimentale. All'interno di questa fase, possono essere applicati farmaci o altre sostanze (come l'angiotensina II). Al termine della fase sperimentale, l'urina viene ottenuta per l'analisi (60 min). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fluorescenza di PBS e urina di topo con e senza FITC-polysucrose 70. (A) La scansione della frequenza di fluorescenza (eccitazione di 290 nm, emissione di 325-700 nm) di PBS mostra un segnale a 325 nm, che sembra essere un effetto del flash di eccitazione a 290 nm. (B) Nella scansione di frequenza dell'urina nativa del topo (piscina di urina diluita a 1:10 e 1:20), c'è un segnale con un massimo di 395 nm, probabilmente causato dall'autofluorescenza delle proteine urinarie. (C) L'urina del topo contenente il FITC-polysucrose 70 (40 g/mL) mostra un picco del segnale a 525 nm che non interferisce con la misurazione dell'autofluorescenza delle urine. (D) Ingrandimento del picco di fluorescenza 70 polisurosi 70 FITC a seconda della lunghezza d'onda di emissione. Diverse concentrazioni di FITC-polysucrose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 g/mL) sono visualizzate. (E) L'aumento delle 70 concentrazioni di FITC-poliocrosi mostra un aumento dell'intensità della fluorescenza all'emissione di 525 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'angiotensina II (Ang II) aumenta la permeabilità glomerare. (A) Ang II aumenta significativamente la permeabilità glomerare nei topi, misurata mediante rilevamento FITC-polisucrosi 70 nelle urine dei topi (media : SEM; n - 5; p < 0.004, testato dal test Kruskal-Wallis). FITC-polisucrosi 70 concentrazioni nelle urine sono state riferite alle concentrazioni di creatinina di urina. Le colonne bianche (0 min) rappresentano i 70 livelli prima dell'inizio della stimolazione Ang II, le colonne nere (60 min) rappresentano il FITC-polisucroso 70 livelli 60 min dopo l'inizio della stimolazione Ang II e le colonne grigie (120 min o ulteriori 60 min di stimolazione Ang II o 60 min di ang II washout. (B) La pressione sanguigna sistolica è stata monitorata con il metodo del polsino della coda (media - SEM). Non sono state notate differenze significative di pressione sanguigna tra i gruppi di controllo e trattati con Ang II. (C) Polysucrosi 70 e FITC-polysucrose 70 non alterano significativamente la permeabilità glomerare nei topi. Ang II aumenta la permeabilità glomerare nei topi in modo significativo (media : SEM; n - 7, p < 0,005). Questa cifra è stata modificata da Konigshausen et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Schematico diagramma del posizionamento di un catetere urinario nei topi femminili. Vista laterale dell'addome del topo. (A) Il catetere marcato e lubrificato viene introdotto 3 mm nell'ostium uretrale esterno di un topo femmina. L'asse craniocaudale dell'uretra è parallelo al catetere. Un'attenta tensione sull'addome inferiore con l'indice sinistro facilita l'introduzione del catetere nell'ostio uretrale esterno. (B) Il catetere viene ruotato di 180 gradi verso la coda del mouse. La punta del catetere rimane di 3 mm all'interno dell'ostio uretrale esterno. (C) Il catetere è ora introdotto 7 mm più avanti nella vescica. La direzione del catetere è allineata con la colonna vertebrale murina. (D) Vista ventrale dell'addome del topo. Il catetere viene introdotto 3 mm nell'ostio uretrale esterno di un topo femmina. (E) Dopo che il catetere è stato girato di 180 gradi, viene introdotto 7 mm più avanti nella vescica del mouse. La direzione del catetere è allineata con la colonna vertebrale murina. Questa cifra è stata modificata da Reis et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo presentato consente allo sperimentatore di testare la permeabilità glomerare nei topi in modo molto sensibile utilizzando un tracciante. Con questo metodo, aumenti a breve termine nella permeabilità glomerare possono essere diagnosticati utilizzando solo piccole quantità di urina. I passaggi più critici per padroneggiare con successo questa tecnica sono 1) lo sviluppo di competenze manuali nella chirurgia del mouse, soprattutto nella concanulazione di una vena centrale, 2) ponendo il catetere urinario senza danneggiare la mucosa, e 3) competenza manuale nella gestione Piastre 384 pozzetto con piccoli volumi di campioni.
Quando si posiziona il catetere venoso centrale, è essenziale che il catetere non penetri nella vena giugulare. Per evitare la penetrazione, si consiglia di mettere la tensione sulla vena giugulare con una legatura distale (vedi passo 2.2.7) e di sollevare la vena giugulare con pinzette sottili per estendere il lume della vena giugulare. Per mantenere il sito di inserimento piccolo, cercare di evitare movimenti grossolani durante l'inserimento del catetere e garantire sempre la migliore vista del campo chirurgico rimuovendo il tessuto supplementare. Il passo più critico nel posizionamento del catetere urinario è l'inserimento finale nella vescica. Se si avverte resistenza, si consiglia di ricominciare dall'inizio per non causare tracce false e lesioni alla mucosa. Rotazione del catetere, lubrificazione e movimenti delicati, così come l'allenamento, aiutano nei casi difficili7.
FITC-polysucrose 70 è un polimero fluorescente etichettato, ramificato e cross-linked di saccarosio e epichlorohydrin9. Si comporta in soluzione come una molecola globulare con una forma sferica e con una bassa asimmetria di forma ma con una deformabilità molecolare9. Come altre molecole di saccarosio, FITC-polysucrose 70 viene filtrato dal glomerulus e non riassorbito nel sistema tubolare4. Per evitare molecole FITC libere nell'infusione, abbiamo dialyzed la soluzione FITC-polysucrose 70 prima dell'applicazione ai topi. È possibile immagazzinare dialisse FITC-polysucrosi 70 molecole a -20 gradi centigradi per mesi. Poiché il FITC-polysucrose 70 viene applicato per via endovenosa in questo e in altri protocolli, è essenziale che nessun sangue contamina i campioni di urina. Pertanto, il catetere urinario deve essere posizionato con cautela e le sostanze anticoagulanti all'interno dell'esperimento devono essere evitate. La curva standard per FITC-polysucrose 70 viene disciolta nel pool di urina del topo per ottenere i risultati più accurati. A causa delle differenze di concentrazione nelle urine in diversi punti temporali sperimentali e tra i gruppi, le concentrazioni di FITC-polysucrosi 70 devono essere riferite a un marcatore nelle urine che riflette la concentrazione delle urine (ad esempio, la creatinina). È improbabile che l'interferenza della fluorescenza 70 del polisucrosi 70 con la misurazione della creatinina in un saggio enzimatico.
L'analisi della fluorescenza FITC-polisucrosi 70 deve essere eseguita in piastre nere 384-well, in quanto in queste piastre possono essere misurati piccoli volumi di urina di 5 gradi centigradi. Si sconsiglia di riutilizzare gli stessi pozzi all'interno delle piastre 384-well, anche dopo aver lavato le piastre, in quanto la fluorescenza è ancora misurabile. Poiché le bolle interferiscono con la lettura della fluorescenza, le piastre devono essere centrifuse prima dell'analisi. In alternativa, le bolle possono essere distrutte manualmente con la punta di una pipetta.
L'uso di polisucrosi per testare la permselettività glomerare è stato descritto quasi 40 anni fa10. Fluorescently labeled polysucrose è stato studiato in studi di lesioni glomeriul quasi esclusivamente nei ratti negli ultimi anni4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Questo può avere ragioni anatomiche a causa di procedure chirurgiche più facili nei ratti che nei topi. Nei ratti, l'uretrotomia viene utilizzata per ottenere campioni di urina4,5,9,12,13,14,21. Per analizzare campioni di plasma e urina, le sonde sono soggette a cromatografia ad esclusione di dimensioni elevate4,5,9,12,13,14 ,21. Inoltre, il tasso di filtrazione glomelare (GFR) è misurato da radioattivo 51Cr-ethylenediamine acido tetraceotico (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Due studi precedenti hanno applicato FITC-polysucrose 70 nei topi5,6. Nei topi, un catetere urinario soprapubico viene introdotto nella vescica6,20. Le sonde urinarie e plasmatiche sono sottoposte a filtrazione in gel prima dell'analisi della fluorescenza FITC-polysucrosi 70. Simile a quanto nei ratti, il GFR è stato analizzato tramite radioattività6,20. La seconda pubblicazione relativa all'applicazione di FITC-polysucrose 70 nei topi utilizza un modello di peritoneabilità peritoneale e, pertanto, non ha analizzato l'urina di topo per la fluorescenza FITC-polysucrose 7022. Il metodo presentato è stato quindi modificato per facilitare il campionamento e l'analisi delle urine. I campioni di urina possono essere facilmente ottenuti attraverso un catetere urinario transuretrale non invasivo. L'analisi dell'urina per la fluorescenza FITC-polysucrosi 70 viene eseguita senza alcuna precedente cromatografia ad esclusione di dimensioni ad alte prestazioni o filtrazione del gel. Facendo riferimento alla fluorescenza di FITC-polisucrosi 70 alla creatinina delle urine di topo, la misurazione del GFR con un test radioattivo non è necessaria.
Aumenti della pressione sanguigna migliorano la permealità glomerare. Pertanto, il monitoraggio della pressione sanguigna è essenziale durante l'indagine sulla permeabilità glomerare. Le misurazioni più accurate della pressione sanguigna nei topi vengono eseguite tramite un catetere arterioso centrale23 che necessita di eparinizzazione del catetere per prevenire la coagulazione. Abbiamo riscontrato problemi con l'ematuria dopo l'eparinizzazione a basso dosaggio e il posizionamento del catetere urinario. Pertanto, abbiamo deciso di eseguire la tecnica del polsino della coda per misurare la pressione sanguigna, che non è invasiva e non ha bisogno di eparinizzazione. A seconda della profondità dell'anestesia, il monitoraggio della pressione sanguigna con il metodo del polsino di coda è a volte impegnativo. Le membrane di pressione sanguigna devono essere controllate in anticipo e la posizione del mouse deve essere ottimizzata prima della registrazione della pressione sanguigna.
Oltre alle sfide nella misurazione della pressione sanguigna, questa tecnica è limitata anche producendo unità arbitrarie di FITC-polysucrose 70. Finora, questa tecnica è stata studiata solo negli animali e, quindi, la sua rilevanza per il filtro glomerare umano è ancora sconosciuta. Gli intervalli di tempo per studiare gli aumenti della permeabilità glomerare dipendono dalla produzione di urina di topo. Pertanto, aumenti a breve termine nella permeabilità glomerare (in minuti) possono essere mancati a causa della mancanza di produzione di urina di topo. In questo protocollo, FITC-polisucrosi 70 è normalizzato alla creatinina urina, che viene rimosso dal sangue principalmente attraverso la filtrazione glomerare, ma anche dalla secrezione tubolare prossimale. Questo introdurrà un errore quando si stima la permeabilità glomerare utilizzando questo metodo, riducendo la distanza frazionaria misurata di polisucrosi24.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christina Schwandt, Blanka Duvnjak e Nicola Kuhr per l'eccezionale assistenza tecnica e il dottor Dennis Sohn per il suo aiuto nella scansione della fluorescenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. e L.S. Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
