Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

قياس حساس للغاية من نفاذية الكبيبي في الفئران مع الفلورسيين إيزوثيوسيانات-بوليسوكروز 70

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لاختبار نفاذية الكبيبي في الفئران باستخدام تعقب حساس للغاية وغير مشع. تسمح هذه الطريقة بتحليل البول المتكرر مع أحجام البول الصغيرة.

Abstract

فقدان الزلال في البول (الزلال) يتوقع نتائج القلب والأوعية الدموية. في ظل الظروف الفسيولوجية، يتم تصفية كميات صغيرة من الزلال من قبل glomerulus وإعادة استيعابها في النظام أنبوبي حتى يتم التوصل إلى حد الامتصاص. الزيادات المبكرة في الترشيح الزلال المرضية قد, وبالتالي, قد غاب عن طريق تحليل الزلال. ولذلك، فإن استخدام التتبع لاختبار الانتقائية الكبيبية يبدو مفيداً. يمكن استخدام الفلورسنت المسمى الفلورسين إيزوثيوسينات (FITC)-بوليسوكروز (أي FITC-Ficoll)، لدراسة الانتقيط الكبيبي. يتم تصفية جزيئات FITC-polysucrose بحرية من قبل الكبيبي دون أن يتم إعادة امتصاصها في النظام الأنبوبي. في الفئران والجرذان، تم التحقيق في فيتك-بوليسوروس في نماذج من نفاذية الكبيبي باستخدام إجراءات معقدة تقنيا (أي القياسات المشعة، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء [HPLC]، والترشيح هلام). قمنا بتعديل وتسهيل بروتوكول يستند إلى التتبع FITC-polysucrose لاختبار الزيادات المبكرة والصغيرة في نفاذية الكبيبي إلى FITC-polysucrose 70 (حجم الزلال) في الفئران. تسمح هذه الطريقة بتحليل البول المتكرر مع أحجام البول الصغيرة (5 ميكرولتر). يحتوي هذا البروتوكول على معلومات حول كيفية تطبيق جهاز تتبع FITC-polysucrose 70 عن طريق الوريد ويتم جمع البول عن طريق قسطرة بولية بسيطة. يتم تحليل البول عن طريق قارئ لوحة الفلورة وتطبيعها إلى علامة تركيز البول (الكرياتينين)، وبالتالي تجنب الإجراءات المعقدة تقنيا.

Introduction

العيوب الوظيفية أو الهيكلية داخل حاجز الترشيح الكبيبي زيادة نفاذية الكبيبي إلى الزلال، مما أدى إلى الكشف عن الزلال في البول (الزلال). الزلال يتوقع نتائج القلب والأوعية الدموية وهو علامة هامة لإصابة الكبيبي1. حتى انخفاض مستويات الزلال، والكذب ضمن النطاق الطبيعي، وترتبط مع زيادة خطر القلب والأوعية الدموية1.

في ظل الظروف الفسيولوجية، يتم تصفية الزلال من خلال glomerulus ويتم إعادة امتصاصه تماما تقريبا في نظام أنبوبي2،3. في الفئران، وعادة ما يتم الكشف عن الزلال في البول عن طريق اختبار المناعية المرتبطة بإنزيم الزلال (ELISA) من 24 ساعة من جمع البول. إذا تم استخدام البول من جمع البول 24 ساعة أو البول بقعة، قد غاب عن اختلافات صغيرة في تركيزات الزلال بسبب مشاكل الحساسية اختبار. معظم الباحثين، لذلك، استخدام النماذج الحيوانية التي يتم فيها الزلال بسبب إصابة الكلى القوية بسبب السموم والأدوية وجراحة الكلى.

ولذلك، فإن العثور على طريقة حساسة للكشف عن التغيرات الصغيرة والعابرة في نفاذية الكبيبية مهم جدا ً للحقل. وقد قدم Rippe وآخرون نموذج الفئران لاختبار نفاذية الكبيبي عن طريق تطبيق التتبع المسمى الفلورسنت، وهي FITC-polysucrose 70 (أي، FITC-Ficoll 70)، في حجم الزلال4. يسمح تطبيق التتبع باختبار التغيرات قصيرة الأجل في نفاذية الكبيبي (فيغضون دقائق) وهو حساس جدا4 . وقد استخدمت دراستان طريقة التتبع في الفئران5،6. على الرغم من فوائده، وهذا الأسلوب، للأسف، لديه عيوب: فمن الناحية الفنية معقدة جدا، والمشعة، والغازية. يتم إجراء مزيد من التحليل للبول فقط باستخدام الترشيح هلام أو حجم استبعاد HPLC5،6.

ضمن هذه الورقة، نقدم طريقة بديلة، حساسة، غير مشعة، وسريعة لقياس نفاذية الكبيبي في الفئران باستخدام الفلورسنت المسمى FITC-polysucrose 70. من خلال إدخال قسطرة عبر القسطرة، جمع البول هو أقل الغازية من ثقب المثانة، استئصال الإحليل، وتطبيق القسطرة فوق العانة، ويسمح جمع البول كل 30 دقيقة على الأقل. قارئ لوحة الفلورسنت. يتم تطبيع تركيزات التتبع في البول إلى تركيزات الكرياتينين في البول باستخدام اختبار الكرياتينين الأنزيمي.

ولذلك، فإن هذه الطريقة الجديدة توفر أداة حساسة لدراسة الإصابة الكبيبية المبكرة مع زيادة نفاذية الكبيبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت التحقيقات وفقا للمبادئ التوجيهية المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة رقم 85-23، المنقحة لعام 1996). وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للموافقات المؤسسية ذات الصلة (حكومة الولاية Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] الرقم المرجعي 84-02.04.2012.A397).

1- إعداد الأدوات والحلول والمعدات

  1. إعادة تشكيل FITC-polysucrose 70 مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم المعقم (كلوريد الصوديوم) إلى تركيز نهائي من 10 ملغ / مل (أي، 100 ملغ في 10 مل من كلوريد الصوديوم).
  2. Dialyze FITC-polysucrose 70 الحل لإزالة جزيئات FITC الحرة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (قطع الوزن الجزيئي [MWCO] في 10,000). استخدم 1 لتر من حمض الكلس العقيم بنسبة 0.9% لكل 10 مل من فيتك-بوليسوكروس 70 تحت التحريك المستمر. حماية من الضوء. Aliquot في FITC-polysucrose dialyzed 70 وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. بالنسبة لـ FITC-polysucrose 70 bolus، أضف 4 ميكرولتر من 10 ملغ/مل فيتك-بوليسوكروز 70 محلول إلى 996 ميكرولتر من 0.9٪ كل
  4. لحل ضخ الاعتدال، إضافة 20 درجة مئوية من 10 ملغ / مل فيتك-بوليسوكروز 70 الحل إلى 9.98 مل من 0.9٪ المعقمة NACl العائد إلى تركيز نهائي من 20 ميكروغرام / مل.
  5. للحل التجريبي، أضف الأدوية أو المواد إلى محلول التسريب (على سبيل المثال، للأنجيوتنسين الثاني [Ang II] [100 نانوغرام/كغ/دقيقة] لفأر 25 غرام، أضف 3 ميكروت من Ang II من محلول 1 mM).
  6. للجراحة، وإعداد واحد للمحملة، واثنين من المشابك الجراحية، زوج واحد من مقص الجراحية، وملاقط اثنين، وملاقط غرامة اثنين، زوج واحد من مقص غرامة، ومسحات. إعداد اثنين من المواضيع الحرير 10 سم (4-0 إلى 6-0) لإجراءات الربط.
  7. لوضع قسطرة وريدي مركزي، قم بإعداد حقنة 10 مل مع إبرة 21 G. ضع طرف الإبرة في قسطرة طولها 30 سم (بقطر داخلي [ID] يبلغ 0.58 مم). قم بتوصيل القسطرة عيار 0.58 مم بقسطرة مقاس 10 سم (مع بطاقة هوية تبلغ 0.28 مم). قطع غيض من القسطرة أصغر منحرف لخلق طرف حاد التي يتم إدخالها في الوريد الوداجي.
  8. إعداد التخدير (أي، الكيتامين التخدير داخل العين، 100 ملغ / كغ من وزن الجسم، وزيلازين، 5 ملغ / كغ من وزن الجسم).
  9. إعداد 22 G القسطرة الوعائية عن طريق التخلص من الإبرة ووضع علامة على القسطرة 1 سم من الطرف. سخني وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
  10. إعداد جهاز ضغط الدم وتغيير غشاء قياس ضغط الدم إذا لزم الأمر.

2- مرحلة الإعداد

  1. القسطرة البولية
    ملاحظة: يتبع القسم 2-1 البروتوكول كما وصفه Reis et al.7. ويبين الشكل 1 والشكل التكميلي 1 وضع قسطرة بولية في الفئران الإناث.
    1. التخدير الماوس مع الكيتامين / xylazine (انظر الخطوة 1.8). استخدم اختبار قرصة القدم لتأكيد التخدير السليم. للحفاظ على التخدير، كرر التخدير (على سبيل المثال، مع نصف الجرعة) بعد 60 دقيقة.
      ملاحظة: يتم استخدام فئران FVB الإناث في هذا البروتوكول.
    2. ضع الماوس في درجة حرارة الظهر على وسادة تدفئة بزاوية 37 درجة مئوية. تشديد أسفل البطن والعثور على ostium مجرى البول (على سبيل المثال، تحت المجهر).
    3. استخدام الجزء البلاستيكي من القسطرة من 22 G القسطرة الوعائية وتليين مع هلام xylocaine. إدخاله بعناية 3 ملم في ostium مجرى البول مع موازية لمحور مجرى البول القاصي (الشكل1A).
    4. بدوره الجزء العلوي من القسطرة الوعائية 180 درجة عن طريق الحفاظ على طرف داخل ostium مجرى البول والحفاظ على محور مجرى البول (الشكل1B).
    5. إدخال القسطرة 7 ملم أبعد في الماوس بحيث يتم وضعها داخل المثانة (الشكل1C). لا تجبر القسطرة على تجاوز المقاومة. تصحيح موقف القسطرة من البداية إذا شعرت بالمقاومة. لاحظ أنه إذا كان موضع القسطرة البولية صحيحاً، فقد يظهر البول بالفعل داخل القسطرة.
    6. ضع أنبوب بني 1.5 مل فوق الجزء العلوي من القسطرة الوعائية لجمع البول. تطبيق 1 مل من 0.9٪ NaCl subcutaneously لتعزيز إنتاج البول.
  2. القسطرة الوريدية المركزية
    1. اكسر يرقبة الفأر ووضعها في التراكم مع الرأس نحو الجراح. فرط تمديد رأس الماوس مع شريط.
    2. تطهير الرقبة مع 70٪ إيزوبروبانول. قم بعمل شق جلدي صغير (5 مم) أسفل خط الفك، باستخدام ملاقط وزوج من المقصات. قطع الجلد حوالي 1 سم في اتجاه القص حتى يتم الوصول إلى منتصف القص.
    3. تشريح بعناية الجلد على الجانب الأيمن من الرقبة، وذلك باستخدام زوج من مقص. إجراء شق مستطيل من الجلد إلى الجانب الأيمن من الماوس لفضح الأنسجة الرخوة للرقبة. استخدام زوج من مقص وملاقط. إصلاح اللوحات الجلد مع اثنين من المشابك.
      ملاحظة: الوريد الوداجي يمتد على طول الجانب الأيسر من الغدة الدرقية أو يتم تغطيتها قليلا من الفص الأيمن للغدة الدرقية. بعد هذه الخطوة، استخدم المجهر للجراحة.
    4. كشف بعناية الوريد الوداجي عن طريق إعداد حادة، وذلك باستخدام غيض من ملاقط غرامة. تجنب الإصابة بفروع الوريد.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري إزالة الأنسجة مع مقص غرامة. كن حذرا عند استخدام مقص لإزالة الأنسجة كما أنه يزيد من خطر النزيف.
    5. وضع وإغلاق الرباط مع خيط الحرير (4-0 إلى 6-0) في الجزء القاصي من الوريد الوداجي مرئية (نحو رأس الماوس). وضع التوتر على الرباط عن طريق إصلاح خيط الحرير مع شريط لضمان توتر طفيف على الوريد الوداجي. إعداد الرباط حول الجزء القريب من الوريد الوداجي.
    6. املأ القسطرة بمحلول التسريب المتساوي (انظر الخطوة 1.4) وقم بإصلاح القسطرة بشريط بحيث يقوم القسطرة بمحاذاة الوريد الوداجي. السيطرة على فقاعات لتجنب انسداد الهواء.
    7. ارفع الوريد الوداجي مع ملاقط رفيعة في موقع الإدراج (موقع الإدراج هو 1-2 مم قريب من الرباط). محاذاة الأنابيب موازية للوريد الوداجي. ثقب الوريد الوداجي، وتهدف إلى التجويف، وإدراج لحوالي 2-4 ملم، موازية لمحور الوريد الوداجي. تجنب أي حركات سريعة.
    8. أغلق الرباط لإصلاح القسطرة. السيطرة على ضيق الرباط عن طريق عرض بعناية من خلال المجهر. وضع مسحة رطبة على موقع الجراحة.
  3. قياس ضغط الدم
    1. وضع الذيل الكفة في الجزء السفلي من ذيل الماوس في حين يضع الماوس في recumbency الظهرية. بدء القياسات وتكرارها 10x لكل نقطة زمنية. بناء وسيلة من القياسات.
    2. ضبط موقف الذيل الكفة إذا كانت قياسات ضغط الدم لا تبدو صحيحة ويتم إنتاج بيانات كاذبة.

3- مرحلة التكافؤ

  1. تغيير أنبوب جمع البول قبل بدء مرحلة الاعتدال ووضعها على الجليد.
  2. إدخال حقنة 10 مل مليئة بمحلول مرحلة معادلة الفيت (انظر الخطوة 1.4) مع إبرة 21 G والقسطرة أكبر (مع معرف 0.58 ملم) ووضعها في مضخة الحقنة.
  3. أضعاف مسحة ووضعها حول قسطرة السفينة الصغيرة (مع معرف من 0.28 ملم) التي يتم إدخالها في الوريد الوداجي. وضع القسطرة داخل المسحة. وضع المشبك على مسحة لإلغاء تدفق الدم الرجعية أو انسداد الهواء. قم بتوصيل إبرة 27 G مع حقنة 1 مل مليئة ببولات FITC إلى نهاية قسطرة الأوعية الصغيرة.
  4. فتح المشبك وتطبيق bolus FITC (100 درجة مئوية). أغلق المشبك مرة أخرى واربط القسطرة الأكبر بالقسطرة الأصغر. بدء مضخة حقنة مع 0.008 مل / دقيقة (0.480 مل / ساعة). استمر في التسريب لمدة 60 دقيقة.

4- المرحلة التجريبية

ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن التحقيق في تأثير الأدوية على الانتقائية الكبيبية.

  1. تغيير الأنبوب البولي (نقطة زمنية 0 دقيقة) إلى أنبوب بني آخر 1.5 مل. وضع مسحة حول قسطرة الأوعية الصغيرة وإغلاق المشبك كما هو مبين في الخطوة 3.3.
  2. افصل القسطرة الكبيرة عن قسطرة الأوعية الصغيرة. تغيير المحاقن إلى حلول المرحلة التجريبية (انظر الخطوة 1.5). دع مضخة التسريب تعمل بحيث يتم تعبئة القسطرة الكبيرة مع محلول التوازن.
  3. أعد توصيل القسطرة مع تجنب انسداد الهواء وإعادة فتح المشبك. بدء ضخ الحقنة في 0.008 مل / دقيقة.
  4. استمر في تشغيل مضخة الحقنة لمدة 60 دقيقة وجمع البول داخل الأنبوب البولي بعد ذلك (البول 60 دقيقة). ضع أنبوب البول على الثلج.
  5. التضحية بالماوس عن طريق خلع عنق الرحم أثناء التخدير. قبل التخلص من الفأر لوحظ لمدة 5 دقائق للتأكد من أنه ميت.

5. تحليل البول

  1. قياس الفلورة
    1. إذابة بركة البول والتخفيف من 1:10 مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
      ملاحظة: تجمع البول هو بركة من البول التي تم جمعها من الفئران السليمة في جمع البول 12-24 ساعة في قفص التمثيل الغذائي.
    2. إعداد معايير لقياس الفلورة. خذ 10 أنابيب بنية 1.5 مل ووسمها لفارغة (1:10 بركة البول المخففة) وتركيزات FITC-polysucrose 70 التالية (0.625، 1.25، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80، و 160 ميكروغرام / مل).
    3. Pipet 246 μL من تجمع البول المخفف في أنبوب بني 1.5 مل وإضافة 4 ميكرولتر من تركيز المخزون FITC-polysucrose 70 (انظر الخطوة 1.1) للحصول على تركيز نهائي من 160 ميكروغرام / مل فيتك-بوليسوكروز 70. Pipet 100 درجة مئوية من تجمع البول المخفف في جميع الأنابيب الأخرى.
    4. تخفيف 1:2 عن طريق الأنابيب 100 درجة مئوية من 160 ميكروغرام / مل فيتك-بوليسوكروس 70 أنبوب في أنبوب 80 ميكروغرام / مل والاستمرار مع تركيزات أخرى. ضمان المزيج السليم من التركيزات المخففة (على سبيل المثال، عن طريق دوامة الأنبوب قبل الاستمرار).
    5. تمييع عينات بول الماوس (0 دقيقة، 60 دقيقة) 1:10 مع تجمع بولي مخفف.
    6. ماصة 5 ميكرولتر من كل تركيز FITC-polysucrose 70 القياسية وعينات بول الماوس كما triplicates في لوحة سوداء 384 جيدا. طرد مركزي لوحة في 1000 × ز لمدة 15 s لتجنب فقاعات.
    7. تحليل لوحة 384 جيدا في قارئ لوحة. أداء الإثارة في 496 نانومتر وقياس الفلورة في 525 نانومتر.
  2. قياس الكرياتينين
    1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة. باختصار، إعداد معايير الكرياتينين عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من الحل القياسي الكرياتينين 100 مل مع 990 درجة مئوية من الكرياتينين اختبار العازلة لإعداد حل قياسي 1 MM.
    2. إضافة 0، 2، 4، 6، 8، و 10 ميكرولتر من 1 mM الكرياتينين الحل القياسي في لوحة 96 جيدا لتوليد 0، 2، 4، 6، 8، و 10 معايير nmol / جيدا، على التوالي. إضافة المخزن المؤقت للقراءة إلى كل بئر لجعل حجم إلى 50 درجة مئوية.
    3. إعداد يمزج رد الفعل عن طريق إضافة 42-44 درجة مئوية من الكرياتينين فحص العازلة، 2 ميكرولتر من الكرياتيناز، 2 ميكرولتر من الكرياتيناز، 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم الكرياتينين، و 2 ميكرولتر من مسبار الكرياتينين. للفراغ، استخدم 44 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكرياتينين، 2 ميكرولتر من الكرياتيناز، 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم الكرياتينين، و1-2 ميكرولتر من مسبار الكرياتينين.
    4. إضافة 50 درجة مئوية من مزيج رد الفعل المناسب لكل بئر في لوحة 96 جيدا واحتضانه لمدة 60 دقيقة على شاكر أفقي في 37 درجة مئوية. حماية لوحة من الضوء أثناء الحضانة. قياس امتصاص في 570 نانومتر على قارئ لوحة.
    5. حساب تركيزات الكرياتينين عن طريق طرح القيمة الفارغة من جميع القراءات. والنتيجة سيكون وحدة nanomoles / ميكرولتر. مضاعفة تركيز الكرياتينين بالوزن الجزيئي للكرياتينين (113.12 نانو /نمول) لتلقي وحدة نانوغرام / ميكرولتر.

6 - تحليل البيانات

  1. حساب تركيز البول FITC-polysucrose 70 من المنحنى القياسي.
  2. مرجع فيتك-بوليسوكروز 70 تركيزات البول إلى تركيزات الكرياتينين في عينة البول التمثيلية.
  3. الرجوع إلى البول 60 دقيقة عينات إلى البول 0 دقيقة عينات من الضوابط والفئران المعالجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكما هو موضح في الشكل 2، يتم بناء طريقة اختبار نفاذية الكبيبي في الفئران على ثلاث مراحل. وتسمى المرحلة الأولى مرحلة الإعداد، حيث يتم وضع القسطرة البولية والقسطرة الوريدية المركزية. وتسمى المرحلة الثانية مرحلة التوازن، بدءا من حقن البولات الوريدي من FITC-polysucrose 70 وتليها التسريب المستمر من FITC-polysucrose 70 لمدة 60 دقيقة. وتسمى المرحلة الأخيرة المرحلة التجريبية. في هذه المرحلة، يستمر ضخ FITC-polysucrose 70 ويمكن اختبار الأدوية أو غيرها من المواد للتأثير على نفاذية الكبيبي. يتم جمع البول في نهاية كل مرحلة.

للتحقيق في نفاذية الكبيبي داخل هذا النموذج التتبع، فمن الضروري لوضع القسطرة البولية بشكل صحيح ودون إصابة الغشاء المخاطي. يظهر وضع القسطرة البولية في مثانة الفئران الأنثوية في الشكل 1. يتم وضع القسطرة 3 ملم في ostium مجرى البول، بالتوازي مع محور مجرى البول الجمجمة (الشكل1A). يتم تحويل القسطرة 180 درجة نحو ذيل الماوس (الشكل1B)وأدخل 7 ملم إلى أبعد من المثانة، موازية للعمود الفقري المورين (الشكل1C،D).

كما هو موضح أعلاه، والأساليب السابقة لاختبار نفاذية الكبيبي في الفئران المستخدمة HPLC لتنقية FITC-polysucrose 70 إشارات من عينات البول5،6. كما يستخدم هذا الأسلوب قياس الفلورة دون تنقية سابقة من التتبع، PBS، بول الماوس، وFITC-polysucrose 70 في بول الماوس تم تحليلها. الشكل 3A يظهر مسح الفلورة من PBS مع ذروة الفلورة في 325 نانومتر، والذي يبدو أن يكون تأثير فلاش الإثارة في 290 نانومتر. يظهر مسح الفلورة لبول الماوس الأصلي حدًا أقصى للفلورة عند 395 نانومتر (الشكل3B). FITC-polysucrose 70 المذاب في بول الماوس يعرض الحد الأقصى للفلورة في 525 نانومتر (الشكل3C،D). ويبين الشكل 3C أن بول الماوس لا يزعج قياس الفلورة من FITC-polysucrose 70 في بول الماوس. زيادة تركيزات FITC-polysucrose 70 تظهر زيادة كثافة الفلورة (الشكل3E).

ولإثبات أن هذه الطريقة قادرة على الكشف عن الاختلافات في نفاذية الكبيبي، طُبقت Ang II في المرحلة التجريبية من النموذج. أنغ الثاني زيادة نفاذية الكبيبي في الفئران 60 دقيقة بعد إدارة مستمرة في جرعات غير الدموية ذات الصلة الضغط (الشكل4A،B). الزيادة في نفاذية الكبيبي بسبب أنغ الثاني يمكن أن تكون مسدودة من قبل مانع مستقبلات أنغ الثاني (ARB)، وهي كانديسارتان (الشكل4A). انخفض غسل أنغ الثاني نفاذية الكبيبي (الشكل4A). تم قياس ضغط الدم عن طريق طريقة الذيل الكفة ولم تظهر اختلافات كبيرة بين المجموعات (الشكل4B). [بولسوروس] 70- و [فيتك-بولسوروس] [70-ينغرسّ] الحيوانات [بووووووووس] كتحكمات ل [فيتك-بولسوروس] 70- و [أنغ] [إيي-كّد] (شكل4[ك]).

Figure 1
الشكل 1: وضع قسطرة بولية في الفئران الإناث. عرض جانبي لبطن الماوس. (أ) يتم إدخال القسطرة ملحوظ ومشحم 3 ملم في ostium مجرى البول الخارجي للفأرالإناث. ويقابل المحور الجمجمة من مجرى البول مع القسطرة. التوتر الدقيق على أسفل البطن مع السبابة اليسرى يسهل إدخال القسطرة في ostium مجرى البول الخارجي. (ب) يتم تحويل القسطرة 180 درجة نحو ذيل الماوس. يبقى طرف القسطرة 3 مم داخل ostium مجرى البول الخارجي. (ج) يتم الآن إدخال القسطرة 7 ملم أخرى في المثانة. يتم محاذاة اتجاه القسطرة مع العمود الفقري للمورين. (D) عرض بطني لبطن الماوس. يتم وضع القسطرة 10 ملم في الماوس. (E) يظهر البول مع الإدراج الصحيح في المثانة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توضيح تخطيطي للإجراءات التجريبية على جدول زمني. بعد نار الفأر ، يتم وضع قسطرة بولية. يتم زرع القسطرة الوريدية المركزية ويتم الحصول على البول الأساسي (0 دقيقة). بعد ذلك، يتم تطبيق فيتك-بوليسوكروز 70 بولوس عن طريق القسطرة الوريدية المركزية وبدأ ضخ مستمر من FITC-polysucrose 70. مرحلة معادلة لFITC-polysucrose 70 يستمر 60 دقيقة. يتم جمع البول بعد مرحلة التوازن (0 دقيقة) وقبل بدء المرحلة التجريبية. في هذه المرحلة، يمكن تطبيق الأدوية أو غيرها من المواد (مثل أنجيوتنسين الثاني). في نهاية المرحلة التجريبية ، يتم الحصول على البول للتحليل (60 دقيقة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فلورة من PBS والبول الماوس مع وبدون FITC-polysucrose 70. (A) مسح تردد الفلورة (الإثارة من 290 نانومتر، انبعاث 325-700 نانومتر) من PBS يظهر إشارة في 325 نانومتر، والذي يبدو أن يكون تأثير فلاش الإثارة في 290 نانومتر. (ب) في فحص تردد البول الأصلي للماوس (تجمع البول المخفف في 1:10 و 1:20)، هناك إشارة بحد أقصى عند 395 نانومتر، ربما بسبب الفلورة الذاتية للبروتين البولي. (C) يظهر بول الماوس الذي يحتوي على FITC-polysucrose 70 (40 ميكروغرام/مل) ذروة إشارة عند 525 نانومتر لا تتداخل مع قياس الفلورة البول. (د) تكبير قمة الفلورة FITC-polysucrose 70 اعتمادا ً على الطول الموجي للانبعاثات. يتم عرض تركيزات مختلفة من FITC-polysucrose 70 (1.25، 2.5، 5، 10، 20، و 40 ميكروغرام / مل) . (E) زيادة FITC-polysucrose 70 تركيزات تظهر زيادة في كثافة الفلورة في انبعاث 525 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يزيد أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) من نفاذية الكبيبي. (أ) أنغ الثاني يزيد بشكل كبير من نفاذية الكبيبي في الفئران، ويقاس باكتشاف FITC-polysucrose 70 في بول الفئران (متوسط + SEM; (ن) = 5؛ p < 0.004, اختبارها من قبل اختبار Kruskal-Wallis). تم الإشارة إلى تركيزات فيتك-بوليسوكروس 70 في البول إلى تركيزات الكرياتينين البول. الأعمدة البيضاء (0 دقيقة) تمثل FITC-polysucrose 70 مستويات قبل بدء التحفيز Ang II، والأعمدة السوداء (60 دقيقة) تمثل FITC-polysucrose 70 مستويات 60 دقيقة بعد بدء التحفيز Ang II، والأعمدة الرمادية (120 دقيقة أو +60 دقيقة) بعد إضافية 60 دقيقة من أنغ الثاني التحفيز أو 60 دقيقة من غسل آنغ الثاني. (ب) تم رصد ضغط الدم الانقباضي من خلال طريقة الذيل الكفة (متوسط + SEM). لم تلاحظ أي اختلافات كبيرة في ضغط الدم بين المكافحة والمجموعات المعالجة بآنغ II. (C) Polysucrose 70 و FITC-polysucrose 70 لا يغير نفاذية الكبيبي في الفئران بشكل كبير. أنغ الثاني يزيد من نفاذية الكبيبي في الفئران بشكل ملحوظ (يعني + SEM; n = 7، p < 0.005). وقد تم تعديل هذا الرقم من كونيغهاوزن وآخرون8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 1
الشكل التكميلي 1: رسم تخطيطي لوضع قسطرة بولية في الفئران الإناث. عرض جانبي لبطن الماوس. (أ) يتم إدخال القسطرة ملحوظ ومشحم 3 ملم في ostium مجرى البول الخارجي للفأرالإناث. ويقابل المحور الجمجمة من مجرى البول مع القسطرة. التوتر الدقيق على أسفل البطن مع السبابة اليسرى يسهل إدخال القسطرة في ostium مجرى البول الخارجي. (ب) يتم تحويل القسطرة 180 درجة نحو ذيل الماوس. يبقى طرف القسطرة 3 مم داخل ostium مجرى البول الخارجي. (ج) يتم الآن إدخال القسطرة 7 ملم أخرى في المثانة. يتم محاذاة اتجاه القسطرة مع العمود الفقري للمورين. (D) عرض بطني لبطن الماوس. يتم إدخال القسطرة 3 ملم في ostium مجرى البول الخارجي للفأر الإناث. (E) بعد أن يتم تحويل القسطرة 180 درجة، يتم تقديمه 7 ملم أخرى في المثانة الماوس. يتم محاذاة اتجاه القسطرة مع العمود الفقري للمورين. وقد تم تعديل هذا الرقم من Reis et al.7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة تمكن المحقق من اختبار نفاذية الكبيبي في الفئران بطريقة حساسة جدا باستخدام التتبع. مع هذه الطريقة، يمكن تشخيص الزيادات على المدى القصير في نفاذية الكبيبي باستخدام كميات صغيرة فقط من البول. الخطوات الأكثر أهمية لإتقان هذه التقنية بنجاح هي 1) تطوير الخبرة اليدوية في جراحة الماوس، وخاصة في تعليب الوريد المركزي، 2) وضع القسطرة البولية دون الإضرار الغشاء المخاطي، و 3) الخبرة اليدوية في التعامل مع 384-جيدا لوحات مع كميات صغيرة من العينات.

عند وضع القسطرة الوريدية المركزية، من الضروري ألا تخترق القسطرة الوريد الوداجي. لتجنب الاختراق، نوصي بوضع التوتر على الوريد الوداجي مع الرباط القاصي (انظر الخطوة 2.2.7) ورفع الوريد الوداجي مع ملاقط غرامة لتوسيع تجويف الوريد الوداجي. للحفاظ على موقع الإدراج صغير، حاول تجنب الحركات الإجمالية أثناء إدخال القسطرة وضمان أفضل عرض للمجال الجراحي عن طريق إزالة الأنسجة الإضافية. الخطوة الأكثر أهمية في وضع القسطرة البولية هي الإدراج النهائي في المثانة. إذا شعرت المقاومة، نوصي بدءا من البداية من أجل عدم التسبب في مسارات كاذبة وإصابة الغشاء المخاطي. دوران القسطرة، تزييت، والحركات لطيف، فضلا عن التدريب، تساعد في الحالات الصعبة7.

FITC-polysucrose 70 هو البوليمر الفلورسنت المسمى، متفرعة، وعبر مرتبطةمن السكروز وepichlorohydrin 9. فإنه يتصرف في الحل كجزيء كروي مع شكل كروي ومع عدم التماثل شكل منخفض ولكن مع تشوه الجزيئية9. مثل جزيئات السكروز الأخرى، يتم تصفية FITC-polysucrose 70 من قبل glomerulus ولا يتم إعادة امتصاصها في نظام أنبوبي4. لتجنب جزيئات FITC الحرة في التسريب، ونحن dialyzed حل FITC-polysucrose 70 قبل التطبيق على الفئران. فمن الممكن لتخزين dialyzed FITC-polysucrose 70 جزيئات في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. كما يتم تطبيق FITC-polysucrose 70 عن طريق الوريد في هذا وغيرها من البروتوكولات، فمن الضروري أن لا تلوث الدم عينات البول. لذلك، يجب وضع القسطرة البولية بحذر، وينبغي تجنب المواد المضادة للتخثر داخل التجربة. يتم حل المنحنى القياسي لFITC-polysucrose 70 في تجمع البول الماوس للحصول على النتائج الأكثر دقة. بسبب اختلافات التركيز في البول في نقاط زمنية تجريبية مختلفة وبين المجموعات، يجب الإشارة إلى تركيزات FITC-polysucrose 70 إلى علامة في البول تعكس تركيز البول (على سبيل المثال، الكرياتينين). من غير المرجح تداخل فيتك-بوليسوروس 70 الفلورة مع قياس الكرياتينين في الاختبار الأنزيمي.

وينبغي إجراء تحليل FITC-polysucrose 70 الفلورة في لوحات سوداء 384-جيدا كما يمكن قياس أحجام البول الصغيرة من 5 ميكرولتر في هذه اللوحات. لا ننصح بإعادة استخدام نفس الآبار داخل الأطباق التي يبلغ عددها 384 بئرًا، حتى بعد غسل الأطباق، حيث لا يزال الفلورة قابلًا للقياس. كما تتداخل فقاعات مع قراءة الفلورة، وينبغي أن تكون لوحات الطرد المركزي قبل التحليل. بدلا من ذلك، يمكن تدمير فقاعات يدويا مع غيض من ماصة.

وقد وصف استخدام polysucroses لاختبار permselectivity الكبيبي منذ ما يقرب من 40 عاما10. وقد تم التحقيق في الفلورسنت المسمى polysucrose في دراسات الإصابة الكبيبية حصرا تقريبا في الفئران في السنوات الماضية4،11،12،13،14،15 ،16،17،18،19،20. قد يكون هذا لأسباب تشريحية بسبب أسهل العمليات الجراحية في الفئران مما كانت عليه في الفئران. في الفئران، يستخدم استئصال الإحليلللحصول على عينات البول 4،5،9،12،13،14،21. لتحليل عينات البلازما والبول، تخضع المسبارات لنسبة عاليةالأداء استبعاد اللونية 4،5،9،12،13،14 ،21. بالإضافة إلى ذلك، يتم قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) بحمض رباعي الأسيتيكالمشع 51Cr-ethylenediamine (EDTA) 4،5،9،12،13 ،14،21. وقد طبقت دراستان سابقتان فيتك-بوليسوروس 70 في الفئران5،6. في الفئران ، يتم إدخال قسطرة بولية فوق العانة في المثانة6،20. تخضع تحقيقات البولية والبلازما لترشيح جل قبل تحليل FITC-polysucrose 70 الفلورة. مماثلة كما هو الحال في الفئران، تم تحليل GFR عن طريق النشاط الإشعاعي6،20. المنشور الثاني المتعلق بتطبيق FITC-polysucrose 70 في الفئران يستخدم نموذجا من نفاذية العضد، وبالتالي، لم يحلل بول الماوس لFITC-polysucrose 70 الفلورة22. ولذلك، تم تعديل الطريقة المعروضة لتسهيل أخذ عينات البول وتحليله. يمكن الحصول على عينات البول بسهولة من خلال قسطرة بولية غير الغازية. يتم إجراء تحليل البول لFITC-polysucrose 70 الفلورة دون أي الكروماتوغرافيا السابقة عالية الأداء استبعاد حجم أو الترشيح هلام. من خلال الرجوع إلى FITC-polysucrose 70 الفلورة إلى الكرياتينين البول الماوس، لا حاجة لقياس GFR مع فحص مشع.

الزيادات في ضغط الدم تعزيز نفاذية الكبيبي. لذلك، فإن مراقبة ضغط الدم أمر ضروري أثناء التحقيق في نفاذية الكبيبي. يتم إجراء قياسات ضغط الدم الأكثر دقة في الفئران عن طريق القسطرة الشريانية المركزية23 التي تحتاج إلى التقرحات القسطرة لمنع التخثر. لقد عانينا من مشاكل في بيلة دموية بعد الهبارة بجرعة منخفضة ووضع القسطرة البولية. لذلك، قررنا إجراء تقنية الكفة التيل لقياس ضغط الدم، وهو غير الغازية ولا تحتاج إلى التأنيب. اعتمادا على عمق التخدير، ورصد ضغط الدم مع طريقة الذيل الكفة هو في بعض الأحيان تحديا. أغشية ضغط الدم تحتاج إلى فحص مقدما، وينبغي تحسين موقف الماوس قبل تسجيل ضغط الدم.

بالإضافة إلى التحديات في قياس ضغط الدم، ويقتصر أيضا على هذه التقنية من خلال إنتاج وحدات تعسفية من FITC-polysucrose 70. وحتى الآن، لم يتم التحقيق في هذه التقنية إلا في الحيوانات، وبالتالي، فإن أهميتها بالنسبة لفلتر الكبيبي البشري لا تزال غير معروفة. تعتمد الفواصل الزمنية للتحقيق في الزيادات في نفاذية الكبيبي على إنتاج بول الماوس. ولذلك، قد غاب عن الزيادات على المدى القصير جدا في نفاذية الكبيبي (في دقائق) بسبب عدم وجود إنتاج البول الماوس. في هذا البروتوكول، يتم تطبيع FITC-polysucrose 70 إلى الكرياتينين البول، والتي تتم إزالتها من الدم أساسا عن طريق الترشيح الكبيبي، ولكن أيضا عن طريق إفراز أنبوبي قريب. وهذا سوف يحدث خطأ عند تقدير نفاذية الكبيبي باستخدام هذه الطريقة، والحد من إزالة كسور قياس polysucrose24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون كريستينا شواند، وبلانكا دوفنجاك، ونيكولا كور على مساعدتهم التقنية الاستثنائية، والدكتور دينيس سون على مساعدته في فحص الفلورة. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من شركة Forschungsgemeinschaft الألمانية (DFG) SFB 612 TP B18 إلى L.C.R. و L.S. لم يكن للمحول أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
  3. Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
  4. Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
  5. Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
  6. Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
  7. Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
  8. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  9. Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
  10. Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
  11. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
  12. Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
  13. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
  14. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
  15. Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
  16. Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
  17. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
  18. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
  19. Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
  20. Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
  21. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
  22. Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
  23. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
  24. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).

Tags

الطب العدد 150 نفاذية الكبيبي، متعدد السوس، التتبع، الزلال، القسطرة البولية الماوس، القسطرة الوريدية المركزية الماوس، الحجاب الحاجز الشق، glomerulus
قياس حساس للغاية من نفاذية الكبيبي في الفئران مع الفلورسيين إيزوثيوسيانات-بوليسوكروز 70
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter