Summary
Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.
Abstract
Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.
Introduction
As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocondrial pode afetar qualquer órgão do corpo em qualquer idade e é uma das principais causas metabólicas, relacionadas ao envelhecimento6, e doenças neurodegenerativas7. Mitocôndrias intactas estão mecanicamente relacionadas à função mitocondrial. Assim, quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial8. A sintetização de citrato, uma enzima limitante da taxa na primeira etapa do ciclo do ácido tricarboxílico9,é localizada na matriz mitocondrial dentro das células eucarióticas e, portanto, pode ser usada como um marcador quantitativo para a presença de massa mitocondrial intacta9,10. A atividade de sintese de citrato também pode ser usada como um fator de normalização para proteínas mitocondriais intactas11,12.
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster,é um excelente sistema modelo para estudar a função mitocondrial, como muitas moléculas e vias que desempenham papéis fundamentais na mitocôndria são evolutivamente conservados de Drosophila para os seres humanos13,14,15. Aqui, apresentamos um protocolo para um método rápido e simples para a medição da atividade de sinteta de citrato por um ensaio colorimétrico no tecido Drosophila homogeneia16 em um formato de placa de 96 poços. No ensaio de atividade de citrato synthase, citrato synthase no tecido Drosophila homogeneizar catalisa a reação de oxaloacetate com coenzima acetil A (acetil CoA) para formar o citrato CoA-SH e H+. O CoA-SH reage posteriormente com 5,5'-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para gerar um produto colorido, 2-nitro-5-thiobenzoato (TNB), que pode ser facilmente medido espectrofotomicamente a 412 nm. A atividade de sintetizador de citrato pode ser refletida pela taxa de produção de cores.
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Protocol
1. Ensaio de atividade de citrato de citrato colorimtricpara D. melanogaster16
- Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras de triplicado para cada genótipo.
- Prepare 500 μL de tampão de extração de gelo-frio contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.
- Anestesia adulto voa com CO2 em uma almofada de anestesia e isolar os tecidos desejados. Para isolar os thoraxes adultos da mosca, por exemplo, repara os thoraxes da mosca por um par de fórceps, e isola então os abdômens da mosca cortando ao longo da beira do tórax e do abdômen usando um par de tesouras. Recolher os thoraxes voar para o ensaio de atividade synthase citrato muscular.
NOTA: Determine o peso fresco do tecido nesta etapa se usá-lo para normalizar a atividade do synthase da citrata. - Transfira 10 thoraxes de mosca adulto para 100 μL de tampão de extração de gelo-frio imediatamente e homogeneize com um pilão no gelo. Para manter as amostras geladas, homogeneize as amostras para 5-10 s no gelo, em seguida, ter as amostras sentar no gelo por 5 s, e repita até que todos os tecidos do tubo são homogeneizados completamente.
NOTA: Fita do tubo, verifique as homogeneizações para se certificar de que não há coágulos nas homogeneizações e que os tecidos no tubo são homogeneizados completamente. Todos os tratamentos de amostra devem ser realizados no gelo. - Tome 10 μL de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de conteúdo proteico. Mantenha as amostras para medição de proteínano gelo.
NOTA: As amostras de proteína podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para análise posterior. As concentrações de proteínas servem como parâmetro interno para a normalização das atividades de sintetização de citrato. - Adicione 400 μL de tampão de extração de gelo-frio para cada amostra restante para fazer um volume total de 500 μL. Misture bem por tubulação suavemente para cima e para baixo, pelo menos, 5x, evitando a formação de bolhas. Para cada reação, adicione 1 μL de lysate celular diluída a 150 μL da solução de reação recém-preparada (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetil CoA, 1 m oxaloáptico ácido). Misture bem e imediatamente por tubulação suave, evitando a formação de bolhas. Medir a absorção em 412 nm cada 10-30 s para 4 min em 25 °C usando um leitor de placa capaz de medir a absorção em 412 nm em intervalos mínimos de 10 s.
NOTA: Mude a ponta antes de pipetting um reagent diferente e evite dar forma a bolhas nos poços. A mistura incompleta dos reagentes pode causar variações nas medidas. O ensaio de atividade de sintetização de citrato deve ser feito à temperatura ambiente imediatamente após as amostras serem coletadas, pois este ensaio é usado para quantificar a massa mitocondrial intacta. O buffer de reação deve ser preparado imediatamente antes do uso e não deve ser armazenado. - Dados do enredo como absorção de densidade óptica (OD) (abs) (eixo Y) versus tempo (em minutos) (Eixo X). Em seguida, calcule a inclinação para a parte linear da curva, onde a taxa de reação é
Divida o valor pela concentração de proteína da amostra para normalizar a atividade de sintese de citrato. A atividade de sintese de citrato é calculada como
NOTA: A concentração da proteína da amostra pode ser medida por um jogo do ensaio da concentração da proteína.
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Representative Results
A Figura 1 apresenta um exemplo das curvas cinéticas para a absorção de OD em 412 nm ao longo do tempo obtida usando o ensaio colorítrico da atividade synthase citrato para medir as homogeneas do tecido drosophila thorax de diferentes genótipos. É sabido que o PGC-1α é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Pgc-1α é funcionalmente conservado entre Drosophila e os seres humanos. Drosophila Drosophila RNF34 (dRNF34) é uma ligase de ubiquitina E3 para Drosophila PGC-1α, dPGC-1, e promove a degradação da proteína dPGC-117. Transmissão de microscopia eletrônica e DNA mitocondrial qPCR mostraram que knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumenta o conteúdo mitocondrial, que é suprimido pelo knockdown de dPGC-117 . Com base nesses resultados, hipotetizou que knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumentaria a atividade de sintese de citrato mitocondrial, que deve ser revertida por knockdown de dPGC-1. Na verdade, usando o ensaio colorimétrico da atividade synthase citrato descrito aqui, descobrimos que knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumentou a atividade de sintese de citrato mitocondrial, que foi revertida pelo knockdown de dPGC-1. Especificamente usando o método descrito aqui, uma taxa enzimática linear inicial foi estabelecida para cada ensaio(Figura 1). As linhas de tendência com suas fórmulas e coeficiente de determinação (R2)são mostradas no gráfico(Figura 1). As inclinações das linhas de tendência representam as taxas máximas de reação, que são equivalentes das atividades máximas de sintetização de citrato dos diferentes genótipos. As pistas para os diferentes genótipos são diferentes(Figura 1). O coeficiente da determinação está mais próximo de 1; as fórmulas das linhas de tendência são mais confiáveis. A concentração de proteínas normalizou as atividades máximas de sintetizador de citrato de diferentes genótipos foram calculadas a partir dos dados da Figura 1 (Figura 2). A atividade máxima de citrato synthase de thoraxes mosca com músculo específico dRNF34 knockdown aumentou, que foi revertida por músculo específico dPGC-1 knockdown (Figura 2).
Figura 1: Um exemplo das curvas cinéticas para o ensaio colorimétrico da atividade de sintetização de citrato. Os homogeneados de tórax de mosca adulto(a)24B-Gal4>+ (b) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), e (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi (II), dPGC-1RNAi foram submetidos ao ensaio colorimmétrico da atividade synthase de caixa. Os eixos horizontais representam tempos de reação, e os eixos verticais representam absorveções de OD em 412 nm. Uma taxa enzimática linear foi estabelecida para cada genótipo. As linhas de tendência foram traçadas e as fórmulas e R2 das linhas de tendência são mostradas no gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: As atividades máximas de sintetização de citrato calculadas a partir das curvas cinéticas e normalizadas pela concentração de proteínas. A atividade máxima de citrato synthase de thoraxes mosca com músculo específico dRNF34 knockdown aumentou, que foi revertida por músculo específico dPGC-1 knockdown. Todos os dados são representados como meios ± SEM (*p < 0,01, por teste ANOVA, e teste de Tukey para múltiplas comparações, n = 3, 10 thoraxes por replicar). Este número é modificado a partir de Wei et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w1118 como um controle. Geralmente, nós pensamos w1118 é um bom controle, porque é o fundo genético para a maioria de tensões de Drosophila e é muito mais fácil backcross do que Canton-S. A alimentação e a manutenção de estoque devem ser exatamente as mesmas para todos os grupos experimentais. Em nossos experimentos, as moscas são normalmente mantidas a 25 °C e 50-60% de umidade relativa. A etapa de preparação da amostra também deve ser realizada com cautela. As cruzes que são configuradas para o experimento devem estar em uma escala semelhante e apropriada. Para criar uma cruz, 3-4 moscas adultas virgens femininas são mantidas com 2-3 moscas adultas masculinas em um frasco de 4 cm de altura, 15 cm de altura de frasco fornecido com alimentos frescos. A receita de alimentos pode variar (por exemplo, dieta rica em gordura, dieta normal, dieta rica em açúcar), dependendo do design experimental. Dois dias depois, a geração parental de moscas é transferida para um novo frasco com alimentos frescos. Cuidar das larvas eclodidas no alimento inclui a adição de um pouco de água, se necessário. Quando a geração filial de moscas começa a eclodir, os frascos são capotados a cada 24 h, as moscas do genótipo desejado são coletadas em um novo frasco para o experimento, e a data da escotilha das moscas é marcada em cada frasco. Aproximadamente 20-30 moscas coletadas do mesmo genótipo, sexo e idade são mantidas em um frasco com alimentos. As moscas coletadas devem ser transferidas para frascos frescos com alimentos apropriados a cada dois dias até que os experimentos sejam realizados. Para evitar o efeito da idade na atividade de sintetizador de citrato, as moscas dos diferentes grupos testados devem eclodir no mesmo dia. Além disso, o sexo das moscas deve ser igualado. Normalmente, o tamanho corporal das fêmeas é maior do que o dos machos, portanto, a concentração de proteínas de corpos femininos é maior do que a dos corpos masculinos.
O ensaio de atividade de sintetizador de citrato também pode ser usado para medir a atividade de sintetização de citrato em larvas. Para este fim, cada amostra pode consistir em cinco larvas instar errante terceiro. As terceiras larvas instar podem ser distinguidas por um anel laranja escuro na ponta de seus spiracles posteriores, que está faltando ou fracamente presente nas segundas larvas instar.
Na etapa 6, as razões de diluição das amostras podem variar para diferentes amostras. Para as amostras que são medidas primeiramente, diversas relações da diluição têm que ser tentadas determinar uma relação apropriada da diluição para estabelecer uma taxa enzimática linear no ensaio. O tempo total de medição para a atividade enzimática máxima que estabelece uma taxa enzimática linear no ensaio varia dependendo da relação enzima-substrato. Se o substrato é extremamente overdose em comparação com a enzima, então a atividade enzimática ou a taxa de reação atinge máximo, o que permite o estabelecimento de uma taxa enzimática linear no ensaio. À medida que a reação continua, a quantidade do substrato diminui, e a atividade enzimática ou a taxa de reação diminui. Se uma taxa enzimática linear não pode ser traçada, o que significa que o substrato não é overdoseem comparação com a enzima, diluir ainda mais o tecido homogeneiza com solução de reação ou encurtar o tempo de intervalo para as leituras de 412 nm até que uma parcela de taxa enzimática linear seja Estabelecido. O tempo de intervalo para a leitura de 412 nm não deve ser mais do que 30 s. A duração para a leitura de 412 nm é baseada na taxa de reação e tempo. A leitura do espectrômetro deve parar quando nenhuma mudança de cor adicional é observada para todas as reações.
A atividade de sintese de citrato pode ser normalizada pela concentração de proteína da amostra, amostra de peso fresco ou número celular. O peso fresco da amostra pode ser medido antes de homogeneizar como na etapa 3. O número celular também pode ser usado para normalizar o lysate de células cultivadas, mas as células devem ser completamente lysed. O conteúdo de DNA não é uma boa opção para um controle interno, pois o procedimento de extração de DNA pode introduzir variações nas amostras, particularmente para amostras contendo uma pequena quantidade de DNA.
Se nenhuma mudança de cor é observada após a reação, várias medidas diferentes de solução de problemas podem ser tomadas:
1. Verifique a etapa de preparação da amostra, certificando-se de lidar com as amostras corretamente, manter as amostras no gelo e evitar vários ciclos de congelamento-degelo.
2. Tente usar uma maior concentração de proteínas, porque algumas amostras podem ter níveis de expressão muito mais baixos de sintetizador de citrato que são indetectáveis pelo ensaio de atividade de sintetizador de citrato.
3. Note-se que alguns kits comercialmente disponíveis para o ensaio de atividade de citrato synthase não podem ser usados para Drosophila, porque estes kits determinam a atividade de sintese de citrato mitocondrial com base na imunocaptura de sintetizador de citrato de mamíferos e o anticorpo synthase de citrato de mamíferos pode não reconhecer o synthase de citrato Drosophila.
Da mesma forma, se houver uma discrepância entre as amostras:
1. Certifique-se de que não há bolhas nos poços.
2. Examine se isso é causado pela má técnica de pipetting.
Em contraste com a medição da atividade de sintese de citrato por um ensaio colorimétrico em mitocôndrias purificadas, que requer quase 200 moscas para a purificação das mitocôndrias de cada genótipo19, apresentamos um protocolo para um ensaio rápido e simples para a medição da atividade de sintetização de citrato por um método colorimétrico em tecido homogeneie ou em extratos de células inteiras16. Para cada amostra, apenas dez moscas eclodidas no mesmo dia são necessárias; para amostras triplicadas de cada genótipo, 30 moscas são necessárias. O protocolo descrito é aplicável não só à Drosophila, mas também a outros sistemas, como células cultivadas e tecidos de mamíferos.
Além do ensaio de atividade de sintetizador de citrato, outros métodos podem ser usados para quantificar a massa mitocondrial. Em comparação com outros métodos quantitativos comumente usados de mitocôndrias, como a medição do conteúdo de DNA mitocondrial por qPCR e quantificação de proteínas mitocondriais por borrão ocidental, que detectam todas as mitocôndrias, independentemente de sua função, o ensaio de atividade de sintetização de citrato é usado para quantificar a presença de massa mitocondrial intacta. Ao contrário do ensaio respiratório mitocondrial, que precisa de purificação mitocondrial e equipamento de ensaio especializado16, o ensaio de atividade de sintetizador de citrato permite aos pesquisadores realizar medições rápidas por espectrofotometria com preparação simples de amostras, como extrato de células inteiras ou homogeneado de tecido, e nenhuma necessidade de isolamento mitocondrial. Assim, o ensaio de atividade sintetizada de citrato é um ensaio rápido e econômico para a quantificação da massa mitocondrial intacta.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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