Summary
本文描述了在IS形成过程中描述B淋巴细胞细胞极化事件的两种方法。第一,涉及细胞器招募的定量和突触膜的细胞骨架重组。第二种是生化方法,用于描述中心体组成的变化,这种物质对免疫突触发生极化。
Abstract
B细胞受体(BCR)对表面束缚抗原的识别触发免疫突触(IS)的形成,其中信号和抗原吸收均得到协调。IS 的形成涉及动态行为因重塑,并伴有偏振招募到中源体和相关细胞内细胞器(如溶酶体和Golgi设备)的突触膜。作用素重塑的初始阶段允许B细胞增加其细胞表面,并最大化在突触中收集的抗原-BCR复合物的数量。在某些情况下,当B细胞识别与刚性表面相关的抗原时,这个过程与地合体体招募和分泌相结合,从而促进抗原提取。被利用的抗原被内化成专门的内乳糖体隔间,用于加工成肽,这些肽被加载到主要组织相容性复合物II(MHC-II)分子上,以便进一步呈现给T帮助细胞。因此,研究与IS的形成相关的细胞器动力学对于理解B细胞是如何被激活的关键。在本文中,我们将讨论成像和用于研究细胞内细胞器定位和细胞骨架重组的变化的成像和生化技术,这些变化与B细胞中IS的形成有关。
Introduction
B淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分,负责产生针对不同威胁和入侵病原体的抗体。抗体的产生效率取决于B细胞在可溶性或表面束缚形式1、2中获取、处理和呈现抗原的能力。BCR对附着细胞表面的抗原的识别,导致形成称为IS3,4的紧密细胞间接触。在此动态平台中,均发生依赖 BCR 的下游信令和抗原内化到内生体隔间中。被吸收的抗原被处理并组装到MHC-II分子上,然后呈现给T淋巴细胞。生产性B-T相互作用,称为B-T细胞合作,允许B淋巴细胞接收适当的信号,促进其分化为产生抗体的血浆细胞或记忆细胞8。
B细胞的抗原提取有两种机制。第一种依赖于来自溶酶体的蛋白酶的分泌,这些蛋白酶在突触裂5、6处进行招募和融合。第二,取决于Myosin IIA介导的拉力,触发含有的抗原的内化到克拉辛涂层坑7的抗原的阴道。抗原提取模式依赖于发现抗原的膜的物理特性。然而,在这两种情况下,B细胞经历两个主要的重塑事件:行为细胞骨架重组和细胞器的极化到IS。Actin 细胞骨架重塑涉及初始扩散阶段,其中突触膜上的活性因子相关突起增加与抗原接触的表面。随后是收缩阶段,其中BCR与抗原结合集中在IS的中心,由分子马达和反应因子细胞骨架重塑8,9,10的协同作用, 11.细胞器的极化也依赖于细胞骨架的重塑.例如,通过相关行为因的局部去聚合,中心体与原子核脱钩,从而允许将这种细胞器重新定位到IS5,12。在B细胞中,将中心体重新定位到一个细胞杆(IS)将溶酶体招募到突触膜中,分泌后可促进表面束状抗原6的提取和/或处理。在IS招募的裂氧体富含MHC-II,这有利于在内皮腔中形成肽-MHC-II复合物,提交给T细胞13。此外,也观察到Golgi仪器被密切招募到IS14,这表明从分泌途径的Golgi衍生的囊泡可以参与抗原提取和/或处理。
总之,在突触形成期间,细胞内细胞器和细胞骨架在B细胞中重新排列是允许其进一步激活所需的高效抗原采集和处理的关键步骤。在这项工作中,我们介绍了如何在B细胞中执行成像和生化分析的详细方案,以研究与IS形成相关的细胞内重塑。这些技术包括:(i) 用抗原涂层珠和抗原涂层盖玻片激活的B细胞的免疫荧光和图像分析,允许对动员到IS和(ii)的细胞内成分进行可视化和定量。)通过在蔗糖梯度上超离心分离B细胞中中中质体富集的成分,从而能够识别与中质体相关的蛋白质,从而可能参与调节细胞极性。
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Protocol
注:使用 IIA1.6 B 单元执行以下步骤。
1. 用抗原涂层珠子活化B细胞
- 抗原涂层珠子的制备
- 要激活B细胞,请使用NH2-珠共价涂覆抗原(Ag涂层珠),这些抗原使用50μL(±20 x 106珠)的3μm NH 2-珠子,具有激活(BCR-配体+)或非激活(BCR-ligand-)抗原。
- 对于 IIA1.6 B 细胞,使用抗 IgG-F(ab')2片段作为 BCR-配体+ 和抗 IgM-F(ab')2或牛血清白蛋白 (BSA) 作为 BCR-配体-要激活原B细胞或IgM+ B细胞系,请使用抗IgM-F(ab')2作为BCR配体+和BSA作为BCR配体-。
注:为了避免配体与Fc受体结合,请使用F(ab')或F(ab')2抗体片段,而不是全长抗体。 - 要继续制备Ag涂层珠子,将珠子放入低蛋白结合微离心管中,以在样品操作过程中最大限度地恢复珠子。加入1mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS),以16,000 x g洗涤珠子和离心机5分钟。
- 用500μL 8%谷醛重新悬浮珠子,以激活NH2组,并在室温(RT)下旋转4小时。
注意:谷醛库存溶液只能用于化学烟气罩。按照材料安全数据表 (MSDS) 上的说明进行操作。 - 在 16,000 x g下离心珠 5 分钟,去除谷醛,用 1 mL 的 1x PBS 再清洗三次。
注意:谷醛溶液应作为危险化学品废物丢弃。 - 在 1x PBS 的 100 μL 中重新悬浮激活的磁珠。样品可分为两个低蛋白结合微离心管:BCR-配体50μL*,BCR-配体-50μL。
- 为了制备抗原溶液,请使用两个2 mL低蛋白结合微离心管,在150μL的PBS中含有100μg/mL抗原溶液:一个管与BCR-配体®,其他带BCR-配体-管。
- 将50μL的活性珠溶液加入含有150μL抗原溶液的每个管中,涡旋,在4°C下旋转过夜。
- 加入500 μL的10mg/mL BSA,以阻止珠子上剩余的活性NH2组,并在4°C下旋转1小时。
- 在 16,000 x g下在 4°C 下将珠子离心 5 分钟,然后去除上清液。用冷 1x PBS 再清洗珠子三次。
- 在 70 μL 的 1x PBS 中重新悬浮激活的磁珠。
- 要确定 Ag 涂层珠子的最终浓度,请稀释 PBS (1:200) 中的少量珠子,并使用流量计计数。然后在4°C储存,直到使用。
注:涂布珠子的储存时间不应超过1个月。
- 聚L-莱辛盖玻片的制备
- 在用Ag涂层珠子进行B细胞活化测定之前,准备多-L-莱辛涂层盖玻片(PLL-盖玻片)。使用含有 40 mL 0.01% 的 PLL 溶液的 50 mL 管,并将 12 mm 直径盖玻片浸入溶液中。在 RT 下旋转一夜。
- 用 1x PBS 清洗盖玻片,然后放在覆盖石蜡膜的 24 孔板盖上晾干。继续激活 B 细胞。
- B 细胞激活
- 要用珠子启动 B 细胞活化,首先将 IIA1.6 B 细胞系稀释至 1.5 x 106细胞/mL,在 CLICK 培养基中(RPMI-1640 辅以 2 mM L-阿兰宁-L-谷氨酰胺 = 55 μM β-二聚苯并乙醇 = 1 mM 丙酮 = 100 U/mL 青霉素 = 100 μg/mL链霉素) = 5% 热灭活胎儿牛血清 [FBS]。
- 将 100 μL(150,000 个细胞)的 IIA1.6 B 细胞与 Ag 涂层珠子在 0.6 mL 管中以 1:1 的比例结合。使用涡旋和种子轻轻混合到 PLL 盖玻片上。在细胞培养箱(37°C / 5% CO2) 中孵育不同时间点。典型的激活时间点是 0、30、60 和 120 分钟。对于时间 0,将 PLL 盖片放入 24 孔板盖的冰上。加入细胞-Ag涂层珠混合物,在冰上孵育5分钟。
注:重要的是通过涡旋混合,而不是上下移液,因为这可以减少样品中的珠子数量,因为它们积聚在移液器的塑料尖端。使用涂有 BCR 配体的珠子作为每次测定的负对照。我们建议首先激活最长的孵育时间,然后激活以下时间点。计算样本的激活间隔,以便它们同时准备好固定。 - 在每个盖玻片中加入100 μL的冷1xPBS,以阻止激活并继续免疫荧光方案。请参阅协议第 3 节。
2. 抗原涂层盖玻片上的B细胞活化
-
制备抗原涂层盖玻片
- 在激活前,制备抗原溶液(含有10μg/mL BCR-配体+和0.5μg/mL大鼠抗小鼠CD45R/B220的1xPBS)。
注:请考虑在测定前一天准备盖玻片。B220改善B细胞附着力,但是,BCR-Ligand®足以产生扩散反应。 - 将 12 mm 盖玻片放在覆盖石蜡薄膜的 24 孔板盖上,在每个盖玻片上加入 40 μL 的抗原溶液,并在 4°C 下孵育过夜。密封板,避免抗原溶液蒸发。
- 用 1x PBS 和空气干燥清洗盖玻片。
- 在激活前,制备抗原溶液(含有10μg/mL BCR-配体+和0.5μg/mL大鼠抗小鼠CD45R/B220的1xPBS)。
-
B 细胞激活
- 要开始激活,请在 CLICK 培养基 + 5% FBS 中稀释 IIA1.6 B 细胞至 1.5 x 106细胞/mL。
- 将100μL细胞添加到抗原涂层盖玻片(Ag-盖玻片)上,并在37°C / 5% CO2的细胞培养箱中激活不同时间点。典型的激活时间点是 0、30 和 60 分钟。
注: 如同第 1 节一样,我们建议从最长的激活时间点开始,以便同时修复所有示例。 - 对于时间 0,将包含 Ag 盖玻片的 24 孔板盖放在冰上并添加细胞。在冰上孵育5分钟。
- 小心地吸出每个 Ag 型盖玻片上的介质,然后加入 100 μL 的冷 1x PBS 以停止激活。继续使用免疫荧光方案。见第3节。
3. 免疫荧光
注:为避免IIA 1.6 B细胞的BCR对二级抗体产生交叉反应,请勿使用小鼠衍生的初级抗体。
- 拆下 1x PBS 并继续固定每个盖玻片。
注:要决定使用哪种固定介质,请检查抗体/染料数据表。例如,对于使用甲醛 (PFA) 固定介质的 phalloidin 标记,对于通过围心素进行中生菌标记使用甲醇固定。- 加入50 μL的1xPBS,辅以4%PFA,并在RT孵育10分钟。
注意:甲醛是有毒的。在使用这种化学品之前,请阅读 MSDS。PFA 解决方案应仅在戴手套和安全眼镜的化学烟罩下制造。PFA 溶液应作为危险化学品废物丢弃。 - 或者,加入50μL的冷甲醇,孵育20分钟。
- 加入50 μL的1xPBS,辅以4%PFA,并在RT孵育10分钟。
- 用 1x PBS 洗涤三次。
注:此时,盖玻片可在 4°C 下存储,在 1x PBS 中最多存储三天。 - 取出 1x PBS,并在每个盖玻片上加入 50 μL 的阻塞缓冲液(2% BSA = 1x PBS 中的 0.3M 甘氨酸)。在 RT 孵育 10 分钟。
- 轻轻吸气,加入50μL的渗透缓冲液(PB)(0.2%BSA = 0.05%皂苷在1xPBS中)。在 RT 孵育 20 分钟。
- 在 PB 中制备抗体或染料(每个盖玻片使用 30 μL),并在 RT 孵育 1 小时或在 4°C 下孵育 1 小时或过夜。有关详细信息,请参阅材料表。
- 要标记微管组织中心 (MTOC) 或心源体使用以下抗体:抗 α-图布林 (1:500)、抗 Cep55 (1:500)、抗 β-图布林 (1:500)、抗围念素 (1:1000)。
注:对于中质体标记B细胞,可以使用中辛-GFP表达质粒转染。 - 对于 Golgi 仪器进行标记,请使用防拉布6a (1:500)。
注:也可以使用其他抗体或染料。 - 要标记地索体,请使用防兰普1 (1:200)。
注:抗H2-DM和抗MHC-II也可用于标记抗原处理隔间15、16。 - 对于标记内质视网膜,请使用抗Sec61a (1:500)。
- 对于行为素细胞骨架,请考虑以下事项:聚合化行为素可以通过Phalloidin结合到荧光染料中可视化。
注:用LifeAct-GFP/RFP表达质粒转染的B细胞也可以用来标记行为蛋白。
- 要标记微管组织中心 (MTOC) 或心源体使用以下抗体:抗 α-图布林 (1:500)、抗 Cep55 (1:500)、抗 β-图布林 (1:500)、抗围念素 (1:1000)。
- 用 PBS 清洗盖玻片三次。
- 稀释PBS中的二级抗体或染料(每个盖玻片使用30μL),并在RT孵育1小时。
注:避免将样品暴露在直射光下,以保持荧光信号的质量。 - 用 PBS 清洗盖玻片三次。
- 从盖玻片中取出 PBS 解决方案。
- 将4μL的安装试剂添加到显微镜幻灯片中。将盖玻片安装到滑轨上,使单元侧朝下。让滑轨在 37°C 或 RT 过夜时干燥 30 分钟。
注:考虑使用"防褪色"安装试剂(参见材料表)。 - 在共聚焦或荧光显微镜上获取荧光图像,具有 60 倍或 100 倍油浸光物。对于每次采集,考虑透射的光或亮场,以轻松识别与珠子相互作用的B细胞。
注:拍摄三维 (3D) 图像,使用 z 堆栈覆盖整个单元格。我们建议采用 0.5 μm 厚的堆栈,但这取决于显微镜。
4. 图像分析
注: ImageJ 软件描述了以下算法。但是,这可以使用等效软件执行。此外,考虑在所有荧光强度测量中,我们使用集成荧光密度(ImageJ 中的"RawIntDen"),因为此参数会考虑图像每个像素中的荧光总量,并考虑区域。
- 用Ag涂层珠激活的B细胞中细胞器分布分析
注: 为了量化单元组件与 IS 的极化,我们将任意值定义为接近 IS 的度量值。该指数范围介于 -1(反极化)和 1(完全极化,珠子上的物体)之间,如 Reversat 等人之前提出的。12.- 估计中心体和高尔基仪器的极性指数(图1B)。
注:此算法可用于仅限于一点的细胞器。- 首先定义要分析的珠子和像元区域,使用圆工具选择来分隔两者的边界,然后将它们另存为感兴趣区域 (ROI)。参见图1、图2、图3和图4。
- 通过运行分析|分别测量细胞和珠子区域。从"结果"窗口获取的X 和 Y 值确定中心坐标。
- 使用 ImageJ 中的点工具选择手动确定中枢或 Golgi 仪器 (Ogelle) 的中心,并运行分析|测量。从"结果"窗口获取的X 和 Y 值确定坐标。
- 然后,使用角度工具选择绘制从 CC 到细胞 (a) 和 CC 到 BC (b) 的角度,然后运行分析 |测量。结果窗口中的角度值显示两个矢量 (a和b) 之间的角度 (*)。
- 使用以下公式计算极性指数:
- 估计裂索体极性指数 (图1F)。
注:我们使用此算法分析显示更分散分布(如流解体)的细胞器的极性。- 定义要分析的珠子和像元区域,使用圆工具选择来分隔两者的边界,并将其保存为 ROI。一旦珠子和细胞区域被震慑,设置荧光通道,并将图像投影到一个z堆栈(图片 |堆栈 |Z 项目 [总切片]),然后运行分析 |从结果窗口测量和提取质量中心 (MC) 坐标 (MX 和 MY)。
- 在更改 MC 的"细胞"之前应用相同的算法。因此, 角度 (*) 由 CC-MC (a) 和 CC-BC (b) 定义
- 使用以下公式计算极性:
- 估计突触区域的溶酶体招募(图2B)。
注:此算法用于量化与 IS 相邻的细胞器。- 确定珠子和像元区域后,确定 CC 和 BC 之间的矢量角度,然后旋转图像以达到 0° 角度。
- 设置荧光通道,并将图像投影到一个 z 堆栈中(图像 |堆栈 |Z-Project [Sum 切片]),消除所有落在细胞和珠子区域之外的荧光(运行编辑 = 在 ImageJ 中清除外部)。
- 使用矩形工具选择,在珠子旁边绘制一个矩形,并测量突触区域荧光 (SAF )。此矩形是单元格宽度的四分之一。
- 选择整个图像并运行分析 |测量获得整个细胞荧光 (WCF).
- 使用以下公式计算与 IS 相邻的细胞器荧光百分比:
- 量化细胞组件的招募到中心体。
注:该算法改编自Obino等人5,用于量化中位体区细胞器的富集性。简单地说,我们将中心体区域视为在荧光/半径图中中与中心体相关的细胞荧光保持不变或高于 70% 的域。在静止条件下设置此参数至关重要,因为激活时此半径可能会更改。- 确定珠和像元区域后,使用点工具选择定义中心体的定位(图3B)。
- 首先,通过在中心体周围绘制一个 3 μm 半径的圆,确定可以量化的中位体周围的最大区域。
- 使用 ImageJ 插件径向轮廓,它测量同心圆中的荧光并显示荧光/半径图。
- 确定至少保持 70% 荧光强度的最大半径。
- 使用以下公式计算荧光密度比:
=
注:荧光密度比表示中心体细胞器的浓度与整个细胞中的分布相比。
- 估计中心体和高尔基仪器的极性指数(图1B)。
- Ag-coverslips上激活的B细胞细胞的细胞分布和分布分析
- 估计IS的细胞器分布(图4B)。
注:此算法允许定量细胞器的XY分布及其在IS中心的浓度。我们定义中心和总突触区域之间的荧光密度比率。获得的值可能从负值到正值不等,分别表示细胞器的外围分布或中心分布。- 确定单元格与盖接触的切片。
注:要划定细胞边界,可以标记在IS外围富集的血浆膜或活性素。 - 将切片类型更改为 8 位,然后进行二元化 (进程 |二进制 |使二进制)并连接最近的外部点 进程 |二进制 |大纲。使用多边形工具选择分隔像元区域 (CA) 的边界.
注: 此步骤可用于增加单元格边界的对比度,并使其更易于识别。此外,此时可以应用 ImageJ 的分析粒子插件来自动确定 CA。但是,同一字段中的其他单元格可能会干扰结果。 - 以CA参数(高度和宽度)和分隔与边界分隔四分之一的高度和宽度值的中心圆角区域,将此区域视为像元中心区域 (CCA)。
- 使用以下公式计算 IS 中心荧光密度分布:
- 确定单元格与盖接触的切片。
- 测量Z平面中的细胞器分布(图4C)。
注:此分析确定细胞器荧光在激活到Ag覆盖玻片上的B细胞Z平面上的一般分布,显示每Z馏分荧光的百分比。- 要量化 Z 中的荧光分布,首先确定细胞与 Ag 盖玻片接触的 IS 平面,然后确定与细胞上限对应的平面。
- 在单元格中心之间画一条线。
- 在 Z 中重新切片图像(图像 |堆栈 |重新切片),以获取 XZ 图像。
- 测量高度并将 XZ 图像划分为从底部(IS 接口)到顶部(单元格上侧)的 10 个相同高度(Z 分数)的连续矩形,并量化每个矩形中的荧光信号。
- 用10个分数的总荧光之和来标准化每个Z分数的荧光强度。
- 绘制每个细胞 Z 部分的荧光强度百分比。
- 估计IS的细胞器分布(图4B)。
=
5. 从静息和活化B细胞中分离中体富集分数
注:在实验期间,将所有溶液保持在4°C,以避免蛋白质降解。该协议改编自以前的工作17,18。
- 在 2 mL 的 CLICK 介质 + 2% 热灭活 FBS(比率 1:1)中激活 2 x 107 B 细胞,用 Ag 涂层珠子进行激活。将非激活的 B 细胞视为静止 B 细胞。
- 加入细胞沙沙星D(2 μM)和诺科达索(0.2μM),在37°C下孵育1小时。
注:这些药物用于通过分别去聚合行为因子细胞骨架和微管来轻轻地从原子核分离中质体,以避免核污染。 - 用 5 mL 的冷 1x TBS(50 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl)清洗每个样品,然后用 1 mL 的 0.1x TBS 补充 8% 蔗糖。
- 用150μL的中源裂解缓冲液(1 mM HEPES,pH 7.2,0.5% NP-40,0.5 mM MgCl 2,0.1%β-Mercaptoto乙醇,1mM苯基硫磷(PMSF)或蛋白酶抑制剂鸡尾酒)和移液器上下,直到粘度减少,表示在样品中识别细胞分线。将样品放入 1.5 mL 管中。
- 在10,000 x g下在4°C下离心10分钟,将细胞器与细胞核分离。
- 小心地回收上清液,并将其放置在含有 60% 蔗糖的 300 μL 梯度缓冲液 (GB) (10 mM PIPES pH 7.2, 0.1% Triton X-100, 0.1% β-汞醇) 的 1.5 mL 管顶部。
- 在10,000 x g下在4°C下离心30分钟,将中心体浓缩在60%蔗糖分量中。
- 同时,在 2 mL 超离心管中制备不连续梯度,将 450 μL 的 GB + 70% 蔗糖覆盖在 270 μL 的 GB + 50% 蔗糖中,然后覆盖 270 μL 的 GB = 40% 蔗糖。
- 在第一次离心(中位体浓缩分数)后,丢弃上半部分(密度较低的部分),直到到达界面并涡旋管中的剩余样品。然后,覆盖在先前用中流体富集样品制备的不连续梯度之上。
注:小心不要破坏梯度,所有移液程序必须小心操作。 - 在 4°C 下以 40,000 x g离心 1 小时,加速最小,离心制动器设置关闭,以避免破坏梯度。
- 从顶部开始将 12 个 100 μL 的馏分收集到单独的管中。
- 使用β-图布林作为中源体标记物,通过免疫蛋白识别中源富集分数。
注:我们通常发现在分数6和8之间的中位富集提取物。
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Representative Results
本文展示了如何使用珠子或盖玻片上的固定抗原激活B细胞,以诱导IS的形成。我们提供有关如何通过免疫荧光识别和量化不同细胞器的极化的信息,以及如何使用生物化学方法。
B细胞通过免疫荧光成像使我们能够跟踪细胞器的动态,如中心体、Golgi仪器和乳糖体,这些细胞在B细胞激活时被招募到IS。可以获取定量参数,以测量这些细胞器与IS的极化,并在不同条件下进行比较。正如我们在图1A中所示,在B细胞激活时,中心体和高尔基装置被招募到IS。在B细胞中未观察到招募,该细胞受BCR-配体刺激,表明需要BCR参与才能将中流体和Golgi设备动员到IS(图1A)。为了获得每个细胞器的极性指数,作为测量其与IS的接近度,我们考虑了三个特征:细胞器和细胞中心之间的距离,珠中心与细胞中心之间的距离,以及两者之间的角度两个向量 (图 1B).此索引范围介于 -1(反极化)和 1(完全极化,珠子上的对象)之间。图 1C和1D显示了绘制每个细胞器极性指数与激活时间的图形。与免疫荧光染色一致,中位体和Golgi仪器在激活时间较长的时间点上显示更多的正极性指数,反映它们是如何逐渐被招募到IS的。该算法适用于限于一点的细胞器。
此外,我们通过应用前面提到的相同算法,量化了显示分散分布的细胞器的极化,如地对体体(图1E),但通过质量中心坐标改变点坐标。裂索体 (图 1F)我们可以观察到,在激活时,流水团池的极性指数达到更多的正值,这表明在B细胞激活时,乳散体正向突触活动(图1G)。
我们还定义了两种算法来确定与突触界面(珠)接触的细胞器和在突触附近接近的细胞器数量,但不一定在接触。如图2所示,我们量化了接触突触界面的溶酶体(图 2A),方法是将珠区域的 LAMP-1 信号除以细胞中的总荧光加上珠(图 2B)。请务必考虑,珠子区域的直径决定了所获得的百分比范围。例如,在显示的量化(图2B)中,我们绘制一个直径为3 μm的圆来测量珠子处的荧光,这是考虑到珠子尺寸(3 μm)的限制性参数。利用这个参数,结果表明溶酶体在B细胞激活时逐渐被招募到突触界面,达到总质量的10-15%(图2C)。所示的另一种方法是溶酶体对突触区域的定量。图2D显示,在IS处,地索体逐渐积累高达其其感其中体25%。总体而言,通过执行这两种类型的分析,可以评估IS细胞器的极化和对接。
在B细胞激活期间,中心体相关蛋白质池的变化被记录为5。例如,在B细胞激活期间改变其在中心体上的关联的蛋白质之一是行为素。在这种情况下,行为在这个地区内变得枯竭,这使得中心体从原子核中分离出来,将其两极分化推进到IS5。在这里,我们介绍在中心体中行为素的定量,以及它在B细胞激活时是如何耗尽的(图3)。为了定义用于量化相关行为因的中位体区域,我们测量了围绕中心体的同心圆中此标签的荧光强度。半径是根据标签至少70%的荧光强度保持的点定义的(图3B)。使用这种方法可以量化B细胞激活时中心体中行为素密度的降低,如图3C所示。
为了获得在IS界面上细胞器分布的更大分辨率,我们在抗原涂层的盖玻片上激活了B细胞,标记活性素,Golgi装置和内质视网膜(图4A)。在IS的细胞器的分布可以通过在中央和外围区域潜水突触区域,应用如图4B所示的标准来执行。这是基于以前的工作表明,BCR聚集在这个中心区域,这很可能对应于中央超分子激活复合体(cSMAC)10,19 。图4A显示,被招募到IS的细胞器,如Golgi仪器和内质视网膜显示相反的分布。事实上,它们的分布指标与图4C所示的免疫荧光染色有关。Golgi 仪器显示正值,这意味着它集中在 IS 的中心,而内质视点显示负值,这意味着它主要在 IS 的外围区域进行局部化。此外,还可以采用先前确定的突触区域的值,在B细胞激活期间测量扩散面积,如图4D和4E所示。这些结果显示,在B细胞激活时,传播面积增加,如前面描述10,20。
与珠子测定一样,我们可以通过拍摄抗原涂层覆盖唇上激活的B细胞的XZ图像,并测量整个Z维度的细胞器荧光(图4F),确定细胞器对免疫突触的分布。测量了Z平面中行为素的荧光强度,如图4F中的XZ平面所示,可以观察到突触界面(分数1和2)的步进增强(图4G)。
除了B细胞成像分析外,我们还对中位体富集分数进行分离,以量化中心体相关蛋白(图5A)。这种方法对于补充B细胞中IS形成的研究非常重要,因为中位体与突触膜极化,并且已被证明能够协调参与抗原提取和呈现21的溶酶体贩运。此方法以前被描述为使用大量的细胞 (1 x 109细胞)17,18,但我们有标准化的简化版本,它使用减少的细胞量,可以使用低体积执行超离心管(2-3 mL)。如图5B所示,我们通过免疫凝固分析了不同的细胞分,并通过伽马图布林染色确定了哪些细胞与中严重体富分分相对应。在这里,我们展示了一个蛋白质在中位体,如Actin和Arp2,以前已经报道5发生的变化,其积累的变化的例子。
图 1:细胞器对IS的极化。(A) 使用 BCR-配体® (0、 30、60 和 120 分钟) 或 BCR-配体-珠子(120 分钟)孵育的 IIA1.6 B 细胞中的 Golgi 装置 (Rab6a) 和微管 (β-图布林) 的免疫荧光染色。箭头表示中位体。BF = 亮字段。比例尺 = 3 μm . (B) 方案,描述如何计算细胞器(中位体或高尔基装置)对 IS 的极性指数。a = 细胞中心 (CC) 与细胞器之间的距离。b = 从 CC 到珠中心 (BC) 的距离。(C, D)代表点图显示不同激活点细胞器的极性指数。每个点表示一个单元格。(E) 用BCR-配体®(0、30、60和120分钟)或BCR-配体珠(120分钟)孵育的B细胞中,对结索体(Lamp1)的免疫荧光染色。BF = 亮字段。比例条 = 3 μm.(F)方案,表示如何计算裂索体极性指数。a = CC 到质量中心 (MC) 之间的距离。b = 从 CC 到 BC 的距离。(G)代表点图显示不同激活点处的地分体极性指数。每个点表示一个单元格。与西达克的后测试进行了双向方差分析。显示具有 SEM 的均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:在IS的积淀。(A) 用BCR-配体®(0、30、60和120分钟)或BCR-配体珠(120分钟)孵育的B细胞中乳吸体(Lamp1)的免疫荧光染色。BF = 亮场。比例尺 = 3 μm . (B) 方案描述如何计算细胞器的积累,如珠子和突触区域的溶酶体。指示了整个细胞(WCF)、珠光(BF)和突触区荧光(SAF)的荧光。(C, D)用于在珠子和突触区域积累溶酶体的代表条图。N = 1。20 > 单元格。与西达克的后测试进行了双向方差分析。显示具有 SEM 的均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:在IS形成期间,在中心体上对行为因进行定量。(A) 用BCR-配体®(0和60分钟)或BCR-配体珠(0和60分钟)孵育的B细胞中活性素(Phalloidin)和微管(β-图布林)的免疫荧光染色。箭头表示中位。比例尺 = 3 μm . (B) 方案,描述如何计算中位相关成分的招募或消耗。中心体面积是使用保持至少最大荧光70%的半径(X μm)计算的。(C) 代表性点图显示在激活(BCR-配体+)和非激活(BCR-配体-)条件下的中位体处的actin。N = 1。15 > 单元格。与西达克的后测试进行了双向方差分析。显示具有 SEM 的均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:细胞组分在突触界面的分布。(A) 活性素(Phalloidin)、内质视网膜(Sec61a)、Golgi仪器(转染KDELR-DN-GFP一种KDEL受体的负主导,在高尔基进行本地化)。B细胞被播种在涂有BCR-配体*的盖玻片上,在BF=明亮场60分钟。比例尺 = 5 μm . (B) 方案,描述如何确定细胞的分布区域和在 IS 中心招募细胞器。在该方案中,CA指示由皮质行为素划定的细胞区域,CCA指示中心细胞区域。(C) IS 处的 Golgi 仪器和内质视网膜分布,由条形图表示,其中值 >0 表示 IS 中心的富集,而 < 0 表示外设分布。N = 1。20 > 单元格。显示具有 SEM 的均值。(D) 在不同时间点(0、30 和 60 分钟)激活在 Ag 涂层盖玻片上的标记为 actin (Phalloidin) 的 B 细胞的代表性图像,显示 XZ 和 XY 平面。(E) 显示 E (F) 方案中 B 细胞分布面积的图形,描述如何确定 Z 平面中感兴趣信号的分布,以及每个 Z 分数的图解。矩形指示 IS 接口。(G) 在 Z 平面上作用因的分布,由荧光分布与每个 Z 分数的百分比的线图表示。矩形表示 IS 接口。N = 1。25 > 单元格。显示具有 SEM 的均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:中体富集B细胞的分量。(A) 如何通过蔗糖梯度超离心获得中感富集分数的工作流程。(B) 从休息和激活的B细胞(60分钟)中获得的部分的免疫球。通过标记 β-图布林来检测中源丰富的分数,并在虚线矩形(分数 6 到 8)中指示。中位相关蛋白(Actin 和 Arp2)在激活和休息条件下以中位体富分表示。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们描述了一个综合的方法,研究B淋巴细胞如何重新组织其细胞内结构,以促进IS的形成。这项研究包括使用成像技术来量化细胞器的细胞内分布,如在B细胞激活期间,如中位体、Golgi装置和乳索体,以及它们如何与IS极化。此外,我们描述了一种生物化学方法,用于研究B细胞激活后中体组合物的变化。
为了促进在B细胞中形成IS,我们使用固定抗原(抗原涂层珠子)代替可溶性免疫复合物,因为前者触发了离散接触部位的建立,其中细胞骨架重新排列和细胞器极化可以很容易地研究。成像B细胞活化的一个关键方面是样品的制备。所有图像采集理想情况下应获得1:1的细胞:珠比,以量化细胞器的极化到抗原接触的独特部位。然而,在某些情况下,B细胞可以捕获两个或两个以上珠子,从而难以选择单个位位抗原相遇。为了避免珠料聚集的形成,在将珠子添加到细胞之前,必须彻底涡旋抗原结合的珠子。此外,对于免疫荧光实验,我们建议从捕获多个珠子的定量细胞中排除,以避免在图像分析过程中出现误解。样品制备的另一个关键步骤是固定/渗透条件。例如,我们建议用甲醇固定细胞,以优化微管染色和4%PFA的phalloidin染色。当同时标记活性球细胞骨架和微管时,另一种选择是通过将具有LifeAct-GFP/RFP表达质粒的细胞与微管染色结合转染细胞来标记肌蛋白池。图像采集用于量化中位体和其他细胞内细胞器的极化,可以使用荧光显微镜进行。然而,为了在不同的z平面上获得准确的定量,例如在扩散测定中,需要共聚焦显微镜。
对于此处描述的中心分离方案,关键步骤是获取适量的样本,以便能够通过免疫蛋白来量化蛋白质。鉴于B细胞具有较大的细胞核,其细胞质小于其总细胞体积的30%,获得更高的细胞质蛋白产量可能具有挑战性。因此,我们建议在每个激活时间点使用大约 20 x 106 B 细胞进行中心隔离。
这些方法的一个重要限制是,抗原结合珠的活化不包括表面束状抗原呈现给体内B细胞的环境的复杂性。这种限制可以通过补充培养物或珠子与其他共同刺激因子,如细胞因子和细胞外基质的组成部分来解决。但是,在这些情况下使用适当的控件以正确解释结果至关重要。
这项工作中介绍的方法的意义取决于用于研究B细胞免疫突触的综合方法:(1)细胞器的极化及其分布,以及(2)中源体蛋白质成分的变化。由于执行有意义分析所需的大量细胞以及在此过程中生成的大量数据,因此本工作中提出的不同定量算法有助于分析细胞成像。此外,用于细胞极化的算法在ImageJ中易于由宏S函数自动化,是减少重复任务、节省时间的有用工具。
这些实验过程可以外推到其他类型的细胞,建立极化表型,以完成一定的细胞功能。此外,这些协议可以通过包括其他测定进行优化,例如,在中分子富集分数中包括相关蛋白质(如激酶或蛋白酶)的活性。总体而言,这些研究可以提供对细胞信号和分子通路的机械洞察,这些途径调节细胞极性的建立。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
M.-I.Y.由FONDECYT#1180900的研究资助。J.I.、D.F.和J.L.得到国家委员会研究金的支持。我们感谢智利天主教大学的大卫·奥索里奥进行录像和编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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