Summary
Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.
Abstract
B hücresi reseptörü (BCR) tarafından yüzeye bağlı antijenlerin tanınması, hem sinyalizasyon hem de antijen alımı koordine edilen bir bağışıklık sinapse (IS) oluşumunu tetikler. Is oluşumu, centrosome ve lisosomlar ve Golgi aparatları gibi hücre içi organellerin sinaptik membranına polarize işe alımı ile birlikte dinamik aksinlerin yeniden biçimlendirilmesi içerir. Aktin remodeling ilk aşamaları B hücreleri kendi hücre yüzeyini artırmak ve antijen-BCR kompleksler sinaps toplanan miktarını maksimize izin verir. Belirli koşullar altında, B hücreleri sert yüzeylerle ilişkili antijenleri tanırken, bu süreç antijen ekstraksiyonu kolaylaştırabilen liksosomların yerel işe alma ve salgılanmasını birleştirilmiştir. Alınan antijenler, büyük histouyumluluk kompleksi II (MHC-II) molekülleri T helper hücrelerine daha fazla sunum için yüklü peptitler içine işleme için özel Endo-lysosome bölmeleri içine emdirilmiş vardır. Bu nedenle, bir IS oluşumu ile ilişkili organel dinamikleri eğitim B hücrelerinin nasıl aktif olduğunu anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda hem görüntüleme hem de hücre içi organel konumlandırma ve B hücrelerinde bir IS oluşumu ile ilişkili siterografi yeniden düzenlemeleri değişiklikleri incelemek için kullanılan bir biyokimyasal tekniği tartışacağız.
Introduction
B lenfositler farklı tehditler ve istila patojenlere karşı antikorlar üreten sorumlu adaptif bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır. Antikor üretiminin verimliliği, B hücrelerinin elde edilmesi, işleyişlerine ve mevcut antijenlere, çözünür veya yüzeye bağlı bir formda1,2' de karşılaşılan yeteneğine göre belirlenir. Sunma hücresinin yüzeyine bağlı antijenlerin tanınması, BCR tarafından, yakın bir hücresel temas oluşumuna yol açar3,4. Bu dinamik platformda BCR 'ye bağımlı akım sinyalizasyon ve antijenlerin Endo-lysosome bölmeler içine inilemasyonu gerçekleşir. Alınan antijenler MHC-II molekülleri üzerine işlenmiş ve monte edilir ve daha sonra T lenfositlerine sunulmuştur. Üretken B-T etkileşimleri, B-T hücre işbirliği olarak adlandırılan, B lenfositlerin antikor üreten plazma hücreleri veya bellek hücreleri içine farklılaşma teşvik uygun sinyalleri almak için izin8.
İki mekanizma B hücreleri tarafından antijen ekstraksiyon dahil edilmiştir. Birincisi Sinaptik yarık5,6' da işe alma ve füzyon geçmesi lisosomlar kaynaklanan proteazların salgılanmasını dayanır. İkincisi, Myosin ııA-mediated Çekme güçleri bu Clathrin kaplı çukurları içine oyulmuş olan antijen içeren membranların invaginasyon tetikler bağlıdır7. Antijenlerin bulunduğu membranın fiziksel özelliklerine antijen ekstraksiyon modu dayanır. Yine de, her iki durumda da, B hücreleri iki büyük remodeling olaylar geçmesi: aktin siterit yeniden yapılanma ve Is için organizler kutuplaşma. Actin sitroiskelet remodeling, sinaptik membranda akin bağımlı çıkıntılar antijen ile temas yüzeyini artıran bir ilk yayılan aşama içerir. Bu bir kasılma aşaması tarafından izlenir, nerede BCrs antijenler ile birleştiğinde, molekül motorları ve aktin sitofülit remodeling tarafından uyumlu eylem tarafından merkezi yoğunlaşmıştır8,9,10, 11. organizasyonun polarizasyon da aktin sitajin remodeling dayanır. Örneğin, centrosome çekirdeğinden, ilişkili actin yerel depolimerizasyon tarafından, bu organel yeniden konumlandırılması için5,12sağlar tarafından unoupled olur. B hücrelerinde, bir hücre Kutbu centrosome yeniden konumlandırılması (IS) sinaptik membran için liksosome işe kılavuzları, hangi salgılanma üzerine çıkarma ve/veya yüzey-gergin antijenlerin işlenmesi kolaylaştırabilir6. Is 'de istihdam edilen lysosomes, T hücrelerinin13' e sunulması için endosomal bölmeler içinde Peptide-MHC-II kompleksleri oluşumunu sağlayan MHC-II ile zenginleştirilmiştir. Ayrıca, Golgi aparatının da yakın Is14için işe olduğu gözlenmiştir, Golgi-sır yolu gelen veziküller antijen ekstraksiyon ve/veya işleme dahil olabileceğini düşündürmektedir.
Sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde hücre içi organel ve siteron yeniden düzenlemeleri, daha fazla aktivasyonu için gerekli olan verimli antijen alımı ve işlenmesine izin veren önemli adımlara sahiptir. Bu çalışmada, B hücrelerinde görüntüleme ve biyokimyasal analizlerin nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı protokoller tanıtmak, bir IS oluşumu ile ilişkili organellerin hücre içi remodeling çalışma. Bu teknikler şunlardır: (i) antijen kaplı boncuklar ile aktif B hücrelerinin Immünofluorescence ve görüntü analizi ve IS ve (ii) için seferber edilmiş hücre içi bileşenlerin görüntüleme ve ölçümleme sağlayan antijen kaplı kapak ) B hücrelerinde centrosome-zenginleştirilmiş fraksiyonları izolasyonlu, sukroz degradeler üzerinde ultracent, protein ile ilişkili proteinlerin tanımlanması, potansiyel Hücre polaritesi düzenleyen dahil sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: aşağıdaki adımları ııA 1,6 B hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi.
1. antijen kaplı boncuk ile B hücresi aktivasyonu
- Antijen kaplı boncuklar hazırlanması
- B hücrelerini etkinleştirmek için, 3 μm NH2' nin 50 μL (~ 20 x 106 boncuk) kullanılarak hazırlanan (BCR-ligand +) veya aktifleştirmeden (BCR-ligand-) antijenlere sahip olan, kovalent antijen (AG kaplı boncuk) ile kaplı NH2-boncuk kullanın.
- IIA 1,6 B hücreleri için anti-IgG-f (AB ')2 parça BCR-ligand + ve anti-IgM-F (AB ')2 veya sığır serum albümin (BSA) olarak BCR-ligand-kullanın. Birincil B hücrelerini veya IgM+ B hücre hattını etkinleştirmek için anti-IgM-F (AB ')2 ' i BCR-LIGAND + ve BSA olarak BCR-ligand-olarak kullanın.
Not: FC reseptörlerine liglerin bağlanması önlemek Için, F (AB ') veya F (AB ')2 antikor parçaları yerine tam uzunluklu antikorlar kullanın. - AG kaplı boncuklar hazırlanması ile devam etmek için, numune manipülasyon sırasında boncuk kurtarma maksimize etmek için düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpler boncuklar yerleştirin. 1 mL 1x fosfat-tampon tuz ekleyin (PBS) boncuk yıkamak için ve Santrifüjü 16.000 x g için 5 dk. supernatant aspirate.
- 500 μL% 8 glutaraldehit ile boncuk resuspend NH2 grupları etkinleştirmek ve oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 4 saat için döndürmek için.
DIKKAT: glutaraldehit stok çözeltisi sadece kimyasal duman kaputunda kullanılmalıdır. Malzeme Güvenliği Veri sayfası (MSDS) üzerindeki yönergeleri izleyin. - Santrifüjler 16.000 x g 'de 5 dakika, glutaraldehit çıkarın ve 1 ml 1x PBS ile boncukları üç kez daha yıkayın.
DIKKAT: glutaraldehit çözeltisi tehlikeli bir kimyasal atık olarak atılmalıdır. - 100 μL 1x PBS 'de aktif boncukları yeniden resuspend. Örnek iki düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler ayrılabilir: 50 μL BCR-ligand + ve 50 μL için BCR-ligand-.
- Antigen çözeltisi hazırlamak için iki 2 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüjü tüpler içeren 100 μg/mL Antigen çözeltisi 150 μL PBS: BCR-ligand + ve diğer BCR-ligand ile bir tüp-.
- 150 μL antijen solüsyonu içeren her tüp için 50 μL aktif boncuk solüsyonu ekleyin, Vortex ve gece 4 °C ' de döndürün.
- Diğer reaktif NH2 gruplarının boncuklar üzerinde engellenmesine ve 4 °c ' de 1 h 'ye döndürülmesi için 10 mg/ml bsa 500 μL ekleyin.
- 4 °C ' de 5 dakika için 16.000 x g 'de boncuklar santrifüjün ve süpernatant çıkarın. Boncukları soğuk 1x PBS ile üç kez daha yıkayın.
- 70 μL 1x PBS 'de aktif boncukları yeniden resuspend.
- AG kaplı boncuk son konsantrasyonu belirlemek için, PBS (1:200) boncuk küçük bir hacim seyreltilmiş ve bir hemocytometer kullanarak saymak. Sonra 4 °C ' de kullanıma kadar saklayın.
Not: AG kaplı boncuklar 1 aydan fazla saklanmamalıdır.
- Poly-L-Lysine coverfları hazırlanması
- AG kaplı boncuk ile B hücresi aktivasyon assay önce, Poly-L-lizin-kaplı Cover, hazırlamak (PLL-Cover,). PLL çözeltisi 40 mL 0,01% w/v içeren bir 50 mL tüp kullanın ve çözüm içine 12 mm çaplı Cover, daldırın. Gece RT 'de döndürün.
- Kapak kuponları 1x PBS ile yıkayın ve parafin filmi ile kaplı 24 kuyu plaka kapağında kurumaya bırakın. B hücresi aktivasyonuna devam edin.
- B hücresi aktivasyonu
- Boncuk ile b hücresi aktivasyonu başlatmak için, ilk 1,5 x 106 hücreler/ml tıklama Orta (rpmi-1640 2 mm L-alanin-L-glutamin + 55 μM Beta-mercaptoethanol + 1 mm piruvat + 100 U/ml penisilin + 100 μg/ml ile IIA 1,6 B hücre hattı seyreltmek streptomisin) + 5% ısı-inaktive fetal sığır serumu [FBS]).
- 100 μL (150.000 hücreleri) ile ııA 1,6 B hücrelerini, 0,6 mL tüplerde 1:1 oranındaki AG kaplı boncuklarla birleştirin. Bir Vortex ve tohumları PLL-coverkuplara hafifçe karıştırın. Bir hücre kültürü kuluçko (37 °C/5% CO2) farklı zaman noktaları için inkübe. Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30, 60 ve 120 dk. 0 zaman için, PLL-coverfları buz üzerindeki 24 kuyu plakası kapağına yerleştirin. Hücreler-AG-kaplamalı boncuk karışımı ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika boyunca inküye.
Not: Bu örnekteki boncuk sayısını azaltabilir, çünkü pipet plastik ucunda birikimi nedeniyle, yukarı ve aşağı pipetleme yerine Vortex ile karıştırmak önemlidir. Kullanım boncuk BCR-ligand ile kaplı-her tahlil için olumsuz bir kontrol olarak. İlk olarak en uzun inkübasyon süresini ve ardından aşağıdaki zaman noktalarını etkinleştirmenizi öneririz. Aynı anda sabitleme için hazır oldukları gibi örnekleri için etkinleştirme aralıkları hesaplayın. - Aktivasyon işlemini durdurmak ve immünofluorescence protokolüyle devam etmek için her lamel magazini için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin. Bkz. protokol Bölüm 3.
2. B hücre aktivasyonu antijen kaplı Cover,
-
Antijen kaplı kapakın hazırlanması
- Aktivasyonu öncesinde, antijen çözümünü hazırlayın (10 μg/mL BCR-ligand + ve 0,5 μg/mL sıçan Anti-Mouse CD45R/b220 içeren 1x PBS).
Not: tahlil bir gün önce Cover, hazırlamak düşünün. B220 B hücre yapışma geliştirir, ancak, BCR-ligand + yayılan yanıt oluşturmak için yeterlidir. - 12 mm 'lik lamel magazini, parafin filmi ile kaplı 24 kuyu plaka kapağına yerleştirin, 40 μL antijen solüsyonu her lamel magazini üzerine ekleyin ve gece 4 °c ' de inküye yapın. Antijen çözeltisi buharlaşma önlemek için plaka mühür.
- Kapak kuponları 1x PBS ve kuru hava ile yıkayın.
- Aktivasyonu öncesinde, antijen çözümünü hazırlayın (10 μg/mL BCR-ligand + ve 0,5 μg/mL sıçan Anti-Mouse CD45R/b220 içeren 1x PBS).
-
B hücresi aktivasyonu
- Aktivasyon başlatmak için, 1,5 x 106 hücreler/ml tıklama orta + 5% FBS için seyreltik IIA 1,6 B hücreleri.
- 100 μL hücre üzerinde bir antijen kaplı lamel magazini (AG-lamel magazini) ekleyin ve 37 °c/5% CO2 'de bir hücre kuluçte farklı zaman noktaları için etkinleştirin. Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30 ve 60 dk 'dir.
Not: Bölüm 1 ' de olduğu gibi, tüm örnekleri aynı anda düzeltmek için en uzun etkinleştirme zaman noktasıyla başlamalar önerilir. - Saat 0 için, 24-kuyu plaka kapağı buz üzerinde AG-coverslip içeren yerleştirin ve hücreleri ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inküye.
- Her bir AG-coverslip üzerindeki medyayı dikkatle aspirleştirin ve ardından aktivasyon işlemini durdurmak için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin. İmmünofluorescence protokolüne devam edin. Bkz. Bölüm 3.
3. immunofluorescence
Not: ikincil antikor ııA 1,6 B hücrelerinin BCR ile çapraz reaktivite önlemek Için fare türetilmiş birincil antikorlar kullanmayın.
- 1x PBS çıkarın ve her coverslip sabitleme ile devam edin.
Not: hangi düzeltme ortamını kullanmak için karar vermek Için Antibody/boya veri sayfasını kontrol edin. Örneğin, phalloidin tarafından etiketleme aktin için civarında formaldehite kullanın (PFA) sabitleme orta, ve centrosome tarafından perikentrin kullanımı metanol fikfasyonu ile etiketleme.- 4% PFA ile desteklenen 1x PBS 50 μL ekleyin ve RT 'de 10 dakika boyunca inküye yapın.
DIKKAT: formaldehit zehirlidir. Bu kimyasallarla çalışmadan önce lütfen MSDS 'YI okuyun. PFA çözümleri sadece eldiven ve güvenlik gözlükleri takan bir kimyasal duman kaputu altında yapılmalıdır. PFA çözeltisi tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalıdır. - Alternatif olarak, 50 μL soğuk metanol ekleyin ve 20 dakika boyunca inküye yapın.
- 4% PFA ile desteklenen 1x PBS 50 μL ekleyin ve RT 'de 10 dakika boyunca inküye yapın.
- 1x PBS ile üç kez yıkayın.
Not: kapak fişi 4 °C ' de bu noktada 1x PBS 'de maksimum üç gün boyunca depolanabilir. - 1x PBS 'ı çıkarın ve 50 μL engelleme tamponunu ekleyin (1x PBS 'de% 2 BSA + 0,3 M gcine) her bir coverslip üzerine takın. 10 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.
- Yavaşça aspirate ve 50 μL geçirgen tampon (PB) (0,2% BSA + 0,05% saponin 1x PBS) ekleyin. RT 'de 20 dakika boyunca inküye yapın.
- PB 'de antikorlar veya boyalar hazırlayın (coverslip başına 30 μL kullanın) ve RT 'de 1 saat veya 4 °C ' de bir gecede inküye yapın. Ek ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.
- Mikrotubul düzenleme Merkezi (mtoc) veya centrosome etiket için aşağıdaki antikorları kullanın: Anti-γ-tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-α-tubulin (1:500), Anti-pericentrin (1:1000).
Not: centrosome etiketleme B hücreleri Için centrin-GFP ifadesi plazmid ile transfitleştirilebilir. - Golgi cihazları etiketleme için anti-Rab6a (1:500) kullanın.
Not: diğer antikorlar veya boyalar da kullanılabilir. - Lysosomes etiketleme için, Anti-Lamp1 (1:200) kullanın.
Not: Anti-H2-DM ve anti-MHC-II de Antigen işleme bölmeleri15,16etiket için kullanılabilir. - Endoplazmik retikulum kullanımı Anti-Sec61a (1:500) etiketleme için.
- Aktin sitortik için aşağıdaki düşünün: polimerize aksini floresan boyalar için konjute phalloidin tarafından görüntülenebilir.
Not: bir LifeAct-GFP/RFP ifadesi Plasmid ile nakledilmiş B hücreleri de actin etiketi için kullanılabilir.
- Mikrotubul düzenleme Merkezi (mtoc) veya centrosome etiket için aşağıdaki antikorları kullanın: Anti-γ-tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-α-tubulin (1:500), Anti-pericentrin (1:1000).
- PBS ile coverlar üç kez yıkayın.
- PBS 'de ikincil antikor veya boyaların seyreltilmeli (coverslip başına 30 μL kullanın) ve RT 'de 1 saat inkübe.
Not: flüoresan sinyalinin kalitesini korumak için örnekleri doğrudan ışığa maruz bırakmaktan kaçının. - PBS ile coverlar üç kez yıkayın.
- PBS çözümünü kapak kağıtından çıkarın.
- Mikroskop kaydırağı için 4 μL montaj reakajına ekleyin. Lamel magazini, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde slayta takın. Slaytların 37 °C ' de 30 dakika veya RT 'de bir gecede kurumasına izin verin.
Not: "Anti-Fade" montaj reakajının ( malzeme tablosunabakın) kullanmayı düşünün. - 60x veya 100x yağ daldırma amacı ile Konfokal veya epifluorescence mikroskop üzerinde floresan görüntüleri elde. Her satın alma için kolayca boncuk ile etkileşim B hücreleri belirlemek için iletilen ışık veya parlak alan düşünün.
Not: z-yığınları kullanarak tüm hücreyi kapsayan üç boyutlu (3B) görüntüler alın. 0,5 μm kalınlığında yığınları almanızı öneririz, ancak bu mikroskop bağlıdır.
4. görüntü analizi
Not: Aşağıdaki algoritmalar ımagej yazılımı için açıklanmıştır. Ancak, bu eşdeğer bir yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tüm floresan yoğunluğu ölçümleri için, ımagej 'de entegre floresan yoğunluğu ("RawIntDen") kullanıyoruz, çünkü bu parametre görüntünün her pikselinde toplam floresan miktarını dikkate alarak bölgeyi dikkate alır.
- AG kaplı boncuklar ile aktive edilen B hücrelerinde organelleri dağılımı Analizi
Not: hücre bileşenlerinin IS 'e kutuplaşma miktarını ölçmek Için, IS 'e yakınlık ölçüsü olarak rasgele bir değer tanımlarsınız. Endeks aralıkları-1 (Anti-polarize) ve 1 (tam polarize, boncuk nesne), daha önce reversat ve Al tarafından sunulan gibi.12.- Centrosome ve Golgi aparatları için polarite dizinini tahmin edin (Şekil 1B).
Not: Bu algoritma, bir nokta ile sınırlı organelleri için kullanılabilir.- Önce her ikisi de sınırlarını sınırlamak için daire aracı seçimi kullanarak çözümlemek için boncuk ve hücre alanlarını tanımlayın ve sonra bunları ilgi BÖLGELERI (YG) olarak kaydedin. Bkz. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4.
- Analiz | çalıştırarak hücre merkezini (CC) ve boncuk merkezini (BC) belirleyin | Hücre ve boncuk alanlarında sırasıyla ölçmek. Sonuçlar penceresinden elde edilen X ve Y değerleri, Merkez koordinatlarını belirler.
- Imagej 'deki nokta aracı seçimini kullanarak centrosome veya Golgi aparatının (organelle) merkezini el ile belirleyin ve Analyze 'i çalıştırın | Ölçmekiçin. Sonuçlar penceresinden elde edilen X ve Y değerleri koordinatları belirler.
- Daha sonra, açı aracı seçimini kullanarak CC 'den organelle 'ye (a) ve CC 'ye (b) bir açı çizin ve Analyze 'i çalıştırın | Ölçmekiçin. Sonuçlar penceresindeki açı değeri, her iki vektörler arasındaki açı (α) gösterir (a ve b).
- Aşağıdaki formülü kullanarak polarite dizinini hesaplayın:
- Lisosomlar için polarite indeksini tahmin edin (Şekil 1F).
Not: Bu algoritmayı, lysosomes gibi daha dağınık bir dağıtım gösteren organörlerin polaritini analiz etmek için kullanırız.- Her ikisi de sınırlarını sınırlamak için daire aracı seçimini kullanarak analiz etmek için parça ve hücre alanlarını TANıMLAYıN ve YG olarak kaydedin. Boncuk ve hücre alanları determind olduktan sonra, floresan kanalını ayarlayın ve görüntüyü tek bir z yığınına (resim | Yığınlar | Z-proje [Sum Slice]), sonra çalıştırın Analyze | Sonuç pencerelerini Kütle Merkezi (MC) koordinatlarını (MX ve My) ölçün ve ayıklayın.
- MC için organelle değiştirmeden önce bahsedilen aynı algoritmayı uygulayın. Böylece, açı (α) CC-MC (a) ve CC-BC (b) tarafından tanımlanır.
- Aşağıdaki formülü kullanarak polaritesi hesaplayın:
- Sinaptik alana Lizozom işe alım tahmin (Şekil 2B).
Not: Bu algoritma, IS 'e bitişik bir organel ölçmek için kullanılır.- Boncuk ve hücre alanları belirlendikten sonra, CC ile BC arasındaki vektör açısını belirleyin ve ardından 0 ° açı elde etmek için görüntüyü döndürün.
- Floresan kanalını ayarlayın ve görüntüyü tek bir z-yığını içine proje (resim | Yığınlar | Z-Project [Sum Slice]), hücre ve boncuk alanının dışında kalan tüm floresans ortadan kaldırır (Edit | ımagej dışında Clear çalıştırın).
- Dikdörtgen aracı seçimi kullanarak, boncuk bitişik bir dikdörtgen çizin ve sinaptik alan floresans (saf) ölçmek. Bu Dikdörtgen Hücre genişliğinin dörtte biridir.
- Tüm görüntüyü seçin ve Çalıştır Analyze | Tüm hücre floresans (WCF) elde etmek için ölçü.
- Aşağıdaki formülü kullanarak IS 'in bitişiğindeki organel floresan yüzdesini hesaplayın:
- Hücresel bileşenlerin centrosome 'e alınmasını ölçmek.
Not: Obino ve al.5' ten uyarlanan bu algoritma, centrosome bölgesinde organerin zenginleşmesi için kullanılır. Kısaca, biz centrosome ilişkili organel floresan floresan/yarıçaplı arsa içinde% 70 üzerinde sabit veya yukarıda kalır alan olarak centrosome alan düşünün. Bu RADIUS etkinleştirme sırasında değişebilir çünkü dinlenme koşullarında bu parametreyi ayarlamak için esastır.- Boncuk ve hücre alanları belirlendikten sonra, nokta aracı seçimini kullanarak centrosome lokalizasyonunu tanımlayın (Şekil 3B).
- İlk olarak, centrosome etrafında 3 μm yarıçapı daire çizerek, ölçmek mümkün olan centrosome çevresindeki maksimum alanı belirlemek.
- Eşmerkezli çevrelerde floresans ölçer ve bir floresan/yarıçaplı Plot görüntüler ımagej eklentisi radyal profilkullanın.
- Floresans yoğunluğunun en az% 70 ' inin korunduğu maksimum yarıçapı belirleyin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak floresan yoğunluğu oranını hesaplayın:
=
Not: floresans yoğunluğu oranı, tüm hücredeki dağılımına kıyasla centrosome 'de bir organel konsantrasyonunu gösterir.
- Centrosome ve Golgi aparatları için polarite dizinini tahmin edin (Şekil 1B).
- AG-coverfiş üzerinde aktif B hücrelerinde hücre yayma ve organörler dağılımı Analizi
- Is 'de organel dağıtımını tahmin edin (Şekil 4b).
Not: Bu algoritma, org 'un XY dağılımının ve IS 'in merkezinde konsantrasyonunun ölçülmesini sağlar. Biz merkezi ve toplam sinaptik alanı arasında floresan yoğunluğu oranı tanımlayın. Elde edilen değerler, sırasıyla organelle bir periferik veya merkezi bir dağılım gösteren negatife göre farklılık gösterebilir.- Hücrenin Kapla temas ettiği dilimi belirleyin.
Not: hücre sınırlarını sınırlamak Için, IS 'in çevresinde zenginleştirilmiş plazma membranı veya aksini etiketleyebilirsiniz. - Dilimin türünü 8-bit olarak değiştirin, ardından binarize (Process | İkili | Ikili olun) ve en yakın yabancı noktalarını bağlayın işlem | İkili | Anahat. Çokgen aracı seçimi kullanarak hücre alanının (CA) sınırlarını sınırlandırın.
Not: Bu adım, hücre sınırlarını kontrast artırmak ve daha kolay tanımlamak için yararlıdır. Ayrıca, bu noktada, CA otomatik olarak belirlemek için ımagej analiz parçacık eklentisi uygulamak mümkündür. Ancak, aynı alandaki diğer hücreler sonuçlara engel olabilir. - CA parametrelerini (yükseklik ve genişlik) alın ve sınırlardan yükseklik ve genişlik değerlerinin dörtte birini ayıran merkezi bir yuvarlatılmış alanı sınırlandırın, bu alanı hücre merkezi alanı (CCA) olarak düşünün.
- Aşağıdaki formülü kullanarak IS 'in merkezindeki floresan yoğunluğu dağılımını hesaplayın:
- Hücrenin Kapla temas ettiği dilimi belirleyin.
- Z düzlemlerinde organel dağıtımını ölçün (Şekil 4c).
Not: Bu analiz, B hücrelerinin z düzlemleri üzerinde, z fraksiyonu başına floresan yüzdesini gösteren, AG-coverflarına aktif hale gelen organel floresans genel dağıtımını belirler.- Z 'de floresan dağılımı ölçmek için, ilk olarak hücrenin AG-coverslip ile temas halinde olduğu IS 'in düzlemini ve ardından hücrenin üst sınırına karşılık gelen uçağı belirleyin.
- Hücre merkezi boyunca bir çizgi çizin.
- Z 'de görüntüyü reslice (resim | Yığınlar | Reslice), BIR XZ görüntü elde etmek için.
- Yüksekliği ölçün ve XZ görüntüsünü Alta (IS arabirimi) üst kısmına (hücrenin üst tarafında) aynı yükseklikte (Z Kesir) 10 ardışık dikdörtgenine bölün ve her birinde floresan sinyalini ölçün.
- Her Z kesinin floresan yoğunluğunu 10 fraksiyonunun toplam floresan toplamı ile normalleştirin.
- Hücrenin Z kesir başına floresan yoğunluğu yüzdesini çizin.
- Is 'de organel dağıtımını tahmin edin (Şekil 4b).
=
5. dinlenme ve aktif B hücrelerinden centrosome zenginleştirilmiş fraksiyonunun yalıtımı
Not: protein bozulması önlemek için deney sırasında 4 °C tüm çözümleri tutun. Bu protokol önceki çalışma17,18uyarlanmıştır.
- 2 x 107 B hücreleri, 2 ml tıklama Orta + 2% ısı-INAKTIVE FBS (oran 1:1) ile AG kaplı boncuklar ile etkinleştirin. Aktif olmayan B hücrelerini dinlenme B hücreleri olarak düşünün.
- D (2 μM) ve nocodazole (0,2 μM) sitoboz ekleyin ve 37 °C ' de 1 h için inküye yapın.
Not: Bu ilaçlar, nükleer kontaminasyonu önlemek için sırasıyla, aktin sitroiskelet ve microtubules depolymerizing tarafından, çekirdeğin sentini yavaşça ayırmak için kullanılır. - Her numuneyi 5 mL soğuk 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) ile yıkayın ve sonra 1 mL 0.1 x TBS ile% 8 sakaroz ile tamamlayıcı.
- 150 μL centrosome lizis tampon ile hücreleri resuspend (1 mm HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mm MgCl2, 0,1% Beta-mercaptoetanol, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) veya proteaz inhibitör kokteyl) ve pipet kadar viskozite kadar hücre liziz örnekteki saptanmıştır gösterir azalır. Örnek bir 1,5 mL tüp koyun.
- 10.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü, organelleri çekirdekten ayırmak için.
- Dikkatle süpernatant kurtarmak ve 300 μL gradyan tampon (GB) (10 mm borular pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-mercaptoethanol) ile 1,5 ml tüp üstüne yerleştirin 60% sucrose.
- 10.000 x g 'de 4 °c ' de 30 dakika santrifüjler% 60 sakaroz fraksiyonunda centrosomes konsantre.
- Bu arada, 450 μL GB + 70% sakaroz ile 270 μL GB + 50% sakaroz ve daha sonra 270 μL GB + 40% sakaroz tarafından taşarak 2 ml 'lik ultracent, tüp içinde kesintisiz degrade hazırlayın.
- İlk Santrifüjden sonra (centrosome-konsantre fraksiyonu), arayüze ulaşıncaya kadar üst kesir (daha az yoğun kısmı) atın ve tüp kalan numune Vortex. Daha sonra, daha önce centrosome zenginleştirilmiş örnek ile hazırlanan kesintisiz gradyan üstüne bindirme.
Not: degradeyi bozmamaya dikkat edin, tüm pipetleme prosedürlerinin dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir. - 4 °C ' de 1 h için 40.000 x g 'de santrifüjün minimumunda ve santrifüjli frenden kapalı olarak ayarlanması, degradeyi bozmamak için.
- 100 μL 12 fraksiyonları üst başından başlayarak ayrı tüplere toplayın.
- Centrosome Marker olarak γ-tubulin kullanarak immünoblot tarafından Sental zenginleştirilmiş fraksiyonları belirleyin.
Not: Biz genellikle kesirler 6 ve 8 arasında centrosome zenginleştirilmiş özler bulabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, B hücrelerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için boncuk veya Cover, immobilize antijen kullanılarak nasıl aktive edilebilir gösterir. Biz nasıl tanımlanacağı ve immünofluorescence tarafından farklı organizlerin polarizasyon ölçmek ve nasıl, Is için polarize centrosome, kendi birlikteliği dinamik değişiklikler geçmesi proteinleri karakterize hakkında bilgi sağlamak bir kullanarak biyokimyasal yaklaşım.
İmmünofluorescence ile B hücrelerinin görüntülenmesi, B hücresi aktivasyonu üzerine IS 'e görevlendirilen centrosome, Golgi aparatı ve lysosomes gibi organizlerin dinamiklerini takip etmemizi sağlar. Biri bu organelin IS 'e kutuplaşma ölçmek ve farklı koşullar altında karşılaştırmak için nicel parametreler elde edebilirsiniz. Şekil 1a'da gösteriyoruz, Centrosome ve Golgi aparatı B hücresi aktivasyonu üzerine Is için işe alınmıştır. BCR-ligand ile uyarılan B hücrelerinde işe alım izlenmemiştir-BCR nişan IS (Şekil 1a) centrosome ve Golgi aparatı seferber için gerekli olduğunu gösteren. Her organel için bir polarite indeksi elde etmek için, IS yakınlığı bir ölçüm olarak, üç özellikleri kabul: organel ve hücrenin merkezi arasındaki mesafe, boncuk merkezi ve hücre merkezi arasındaki mesafe, ve bu arasındaki açı iki vektörler (Şekil 1B). Bu dizin-1 (Anti-polarize) ve 1 (tam polarize, boncuk nesne) arasında değişmektedir. Şekil 1C ve 1D Show grafikleri, her organel polarite indekslerinin aktivasyonu zamana karşı çizilmiş olduğu. İmmünofluorescence boyama ile anlaşmada, hem centrosome ve Golgi aparatı, daha uzun süre aktivasyonu üzerine daha olumlu polarite indeksleri göstermek, onlar aşamalı olarak Is için işe nasıl yansıtır. Bu algoritma bir nokta ile sınırlı organelleri için geçerlidir.
Ayrıca, daha önce bahsedilen aynı algoritmayı uygulayarak, lisosomlar (Şekil 1e) gibi bir dağınık dağıtım görüntüleyen organörlerin polarizasyon quantified, ancak kitle merkezi koordinatları tarafından nokta koordinatını değiştirerek lisosomlar (Şekil 1F). Lizozom havuzlarının polarite indekslerinin aktivasyonu üzerine daha olumlu değerlere ulaşmasını gözlemleyebiliriz, bu da lysosomların B hücresi aktivasyonu üzerine sinaps 'e doğru seferber edildiğini gösterir (Şekil 1G).
Biz de sinaps yakınlığı, ancak mutlaka temas içinde sinir (boncuk) ve organtanlı miktarı ile temas eden organelleri belirlemek için iki algoritmalar tanımlanır. Şekil 2' de gösterildiği gibi, sinaptik arayüze temas eden lisosomlar 'i (Şekil 2a), lamba-1 sinyalini hücre içinde toplam floresans ve boncuk (Şekil 2B) ile boncuk alanına bölerek belirliyoruz. Boncuk alanının çapı elde edilen yüzdeleri aralıklarını belirler dikkate almak önemlidir. Örneğin, görüntülenen ölçüte (Şekil 2B), boncuk büyüklüğü (3 μm) göz önüne alındığında kısıtlayıcı bir parametre olan boncuktaki floresan ölçmek için 3 μm çapında bir daire çizeriz. Bu parametreyi kullanarak, sonuçlar lisosomlar aşamalı olarak B hücresi aktivasyonu üzerine sinaptik arayüze işe olduğunu gösterir,% 10-15 ulaşan toplam kütle (Şekil 2C). Gösterilen başka bir yaklaşım sinaptik bölgeye lisosomlar kantifikasyon olduğunu. Şekil 2D , lisosomlar 'in IS 'de liksosomlarının% 25 ' ine kadar ilerlemelerini gösterir. Genel olarak, her iki tür analiz gerçekleştirerek biri kutuplaşma ve organelleri yerleştirme değerlendirebilirsiniz IS.
B hücresi aktivasyonu sırasında centrosome ile ilişkili proteinlerin havuzunda yapılan değişiklikler belgelenmiştir5. Örneğin, B hücresi aktivasyonu sırasında Centrosome 'daki ilişkisini değiştiren bu proteinlerden biri actin 'dir. Bu durumda aktin bu bölgede tükenmiş hale gelir ve bu da centrosome 'in çekirdeğden ayrılmış hale gelmesine, polarizasyonu Is5' e yükseltmesine olanak verir. Burada Centrosome 'deki akin miktarını ve B hücresi aktivasyonu üzerine nasıl tükenmesini sunuyoruz (Şekil 3). İlişkili aksini ölçmek için kullanılan centrosome alanı tanımlamak için, bu etiketin floresans yoğunluğunu centrosome çevreleyen eşmerkezli çevrelerde ölçtük. Yarıçaplı, etiketin floresan yoğunluğunun en az% 70 ' inin korunduğu noktaya göre tanımlanmıştır (Şekil 3B). Bu yaklaşımı kullanarak, Şekil 3c'de gösterildiği gibi, B hücresi aktivasyonu üzerine centrosome 'de akin yoğunluğunda azalma ölçülebilir.
Is arayüzünde organörler dağılımında daha fazla çözünürlük elde etmek için, B hücrelerini antijen kaplı kapaklara, etiketleme aksini, Golgi aparatı ve endoplazmik retikulum (Şekil 4A) üzerinde aktifleştirdik. Is 'de organörlerin dağılımı, Şekil 4b'de gösterilen bir ölçüt uygulayarak, merkezi ve periferik alanda sinaptik alan dalış yaparak gerçekleştirilebilir. Bu, BCrs 'nin büyük olasılıkla merkezi Supramoleküler aktivasyon kompleksine (csmac)10,19' a karşılık gelen bu merkezi alan içinde toplanacağı gösteren önceki çalışmaya dayanmaktadır. Şekil 4A , Golgi aparatları ve endoplazmik retikulum ekran gibi, IS 'e görevlendirilen organenların zıt dağılımları gösterir. Gerçekten de, dağıtım endeksleri Şekil 4c'de gösterilen immünofluoresesans boyama ile ilişkilendirir. Golgi aparatı pozitif bir değer gösterir, yani endoplazmik retikulum negatif değerler gösterirken IS 'in merkezinde yoğunlaşmıştır, bu da özellikle IS 'in periferik bölgesinde lokalize olduğu anlamına gelir. Ayrıca, daha önce belirlenen sinaptik bölgenin değerlerini almak mümkündür, B hücresi aktivasyonu sırasında yayılan alanı ölçmek için, rakamlar 4d ve 4Egösterildiği gibi. Bu sonuçlar, daha önce10,20olarak açıklandığı gibi, B hücresi aktivasyonu üzerine yayılan alanda bir artış gösterir.
Boncuk tahlil olarak, biz antijen kaplı Cover, B hücrelerinin XZ görüntüleri alarak ve Z boyutu (Şekil 4F) arasında organel floresans ölçümü tarafından bağışıklık sinaps doğru organel dağılımı belirleyebilirsiniz. Z düzlemindeki akin floresan yoğunluğu, Şekil 4F'de XZ düzleminde temsil edildiği için, sinaptik arayüzde (fraksiyonlar 1 ve 2) akinin ilerici bir zenginleştirme Izlenebilen (Şekil 4g) olarak ölçülmüştür.
B hücresi görüntüleme analizine ek olarak, centrosome ile ilişkili proteinleri ölçmek için centrosome zenginleştirilmiş fraksiyonları yalıtımını gerçekleştirdik (Şekil 5A). Bu yaklaşım, B hücrelerinde IS oluşumu çalışmalarını tamamlamak için önemli olabilir, centrosome sinaptik membran polarize ve antijen ekstraksiyon ve sunum21dahil Lizozom ticareti koordine gösterilmiştir verilen. Bu yöntem daha önce büyük miktarlarda hücre kullanılarak tanımlanmıştır (1 x 109 hücre)17,18 ama biz daha az miktarda hücre kullanan ve daha düşük hacimli kullanılarak gerçekleştirilebilir basitleştirilmiş bir sürümü, standardize var ultracent-tüpler (2-3 mL). Şekil 5B'de gösterildiği gibi, İmmünoblotting ile farklı hücre fraksiyonları analiz ettik ve hangisi sentrosome-zengin fraksiyonları, gama tübülin boyama tarafından karşılık belirlenen. Burada, daha önce5bildirilen actin ve Arp2 gibi centrosome 'de birikimlerinde değişiklik yapan proteinlerin bir örneğini gösteriyoruz.
Şekil 1 : Organizasyonun IS 'e doğru polarizasyon. (A) IIA 1,6 B hücrelerinde Golgi aparatının (Rab6a) ve mikrotübüller (α-tubulin) immünofluorescence boya BCR-ligand + (0, 30, 60 ve 120 dk) veya BCR-ligand-boncuk (120 dk) ile inkülentir. Ok uçları centrosome gösterir. BF = parlak alan. Ölçek çubuğu = 3 μm. (B) organizerinin polarite indeksi (centrosome veya Golgi APARATı) Is 'e doğru nasıl hesaplanacağını tasvir eden düzen. a = hücrenin Merkezi (CC) arasındaki mesafe organelle. b = CC 'den ve boncuk merkezine (BC) uzaklık. (C, D) Temsilcinin farklı zaman noktalarında organizlerin polarite indekslerini gösteren nokta çizimleri. Her nokta bir hücreyi temsil eder. (E) BCR-ligand + (0, 30, 60 ve 120 dk) veya BCR-ligand-boncuklar (120 dak) ile Inkük edilen B hücrelerinde Lysosomes (Lamp1) immünofluorescence boyama. BF = parlak alan. Ölçek çubuğu = 3 μm. (F) Lysosomes polarite indeksi nasıl hesaplanacağını temsil eden şeması. a = kütle merkezine (MC) CC arasında uzaklık. b = CC 'den BC 'ye uzaklık. G Temsillerin farklı zaman noktalarında lisosomlar polarite indeksleri gösteren nokta çizimleri. Her nokta bir hücreyi temsil eder. Sidak 'ın test sonrası 2 yönlü ANOVA yapıldı. SEM ile araçlar gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Lizozomların birikmesi. (A) BCR-ligand + (0, 30, 60 ve 120 dk) veya BCR-ligand-boncuk (120 dk) ile inküslenmeli B hücrelerinde lisosomlar (Lamp1) immünofluorescence boyama. BF = parlak alan. Ölçek çubuğu = 3 μm. (B) düzeni, boncuk ve sinaptik alanda lisosomlar gibi organel birikimi hesaplamak için nasıl tasvir. Tüm hücrenin Floresan (WCF), boncuk floresans (BF) ve sinaptik alan floresans (SAF) belirtilir. (C, D) Boncuk ve sinaptik alanda lisosomlar birikimi için temsili çubuk grafikler. N = 1. 20 > hücreler. Sidak 'ın test sonrası 2 yönlü ANOVA yapıldı. SEM ile araçlar gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Is oluşumu sırasında centrosome içinde aktın ölçülmesini. (A) BCR-ligand + (0 ve 60 dk) veya BCR-ligand-boncuklar (0 ve 60 min) ile inkük eden B hücrelerinde aktin (phalloidin) ve mikrotübüller (α-tubulin) immünofluorescence boyama. Ok kafaları centrosome gösterir. Ölçek çubuğu = 3 μm. (B) Düzen Centrosome ilişkili bileşenlerin işe alma veya tükenme hesaplamak nasıl tasvir. Centrosome alanı maksimum floresan% 70 en az korumak bir yarıçaplı (X μm) kullanılarak hesaplanır. (C) aktif (BCR-ligand +) ve aktif olmayan (BCR-ligand-) koşulları altında centrosome içinde aktin gösteren temsili nokta çizimleri. N = 1. 15 > hücreler. Sidak 'ın test sonrası 2 yönlü ANOVA yapıldı. SEM ile araçlar gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Sinaptik arayüzde hücresel bileşenlerin dağılımı. (A) aksin immünofluorescence boyama (Phalloidin), endoplazmik reticulum (Sec61a), Golgi aparatı (bır KDELR-DN ile transfif-Gfp a negatif dominant Kdel reseptör, hangi Golgi lokalleştiren). B hücreleri, BCR-ligand + ile kaplı coverkuplara 60 dk. BF = parlak alan üzerine dikilmiştir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) hücre yayılma alanını nasıl belirleyeceğini ve IS 'in merkezinde organelleri işe alma şeklini tasvir eden düzen. Şemaya göre CA, kortikal aksini ile sınırlandırılmış hücre alanının ve CCA 'nın Orta hücre alanını gösterir. (C) Golgi aparatı ve endoplazmik retikulum dağıtım IS, bir çubuk grafik tarafından temsil edilen bir değer > 0 IS ve < 0 ' ın merkezinde bir zenginleştirme gösterir periferik dağılımı gösterir. N = 1. 20 > hücreler. SEM ile araçlar gösterilir. (D) aktin (phalloidin) için etiketli B hücrelerinin temsili görüntüleri, XZ ve XY düzlemini gösteren farklı zaman noktalarında (0, 30 ve 60 dk.) AG kaplı kapaklara devreye girer. (E) e. (F) şemasında B hücrelerinin yayılan alanını gösteren grafik, z düzleminde ilgi sinyalinin dağılımının nasıl belirleneceğini ve z kesir başına Arsa gösterir. Dikdörtgen IS arabirimini gösterir. (G) her z kesir karşı floresans dağılımı yüzdesi bir çizgi grafiği Ile temsil Z düzleminde aktın dağılımı. Dikdörtgen IS arabirimini temsil eder. N = 1. 25 > hücreler. SEM ile araçlar gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Centrosome B hücrelerinde zengin kesirler. (A) sakaroz gradyan ultracentbir tarafından centrosome zenginleştirilmiş fraksiyonları elde etmek için nasıl iş akışı. (B) dinlenme ve aktif B hücrelerinden elde edilen fraksiyonlar immünoblot (60 dk). Centrosome zengin fraksiyonları γ-tubulin ile etiketleme ile tespit edilir ve kesikli dikdörtgen içinde belirtilir (fraksiyonu 6 için 8). Centrosome ilişkili proteinler (actin ve Arp2) aktif ve dinlenme koşullarında centrosome zengin fraksiyonları gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
B lenfositlerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için hücre içi mimarisini nasıl yeniden organize ettiğini incelemek için kapsamlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışmada, B hücresi aktivasyonu sırasında centrosome, Golgi aparatı ve lisosomlar gibi organellerin hücre içi dağılımını ölçmek için görüntüleme tekniklerini ve IS 'e nasıl polarize edildiğini içerir. Ayrıca, B hücresi aktivasyonu üzerine centrosome bileşiminde değişiklikleri incelemek için bir biyokimyasal yaklaşım açıklanmaktadır.
B hücrelerinde bir IS oluşumu tanıtmak için, biz immobilize antijenler kullanılan (antijen kaplı boncuklar) yerine çözünebilir immün-kompleksleri çünkü eski bir ayrık temas sitenin kurulması tetikler nerede siterolojik yeniden düzenlenmesi ve organel kutuplaşma kolayca incelenebilir. Görüntüleme B hücresi aktivasyonunun kritik bir yönü, numunelerin hazırlanması. Tüm görüntü alımları ideal bir 1:1 hücre elde etmelidir: boncuk oranı, antijen temas benzersiz bir siteye organizasyonun polarizasyon ölçmek için. Ancak, bazı durumlarda B hücreleri iki veya daha fazla boncuk yakalayabilir, böylece zor antijen karşılaşma tek bir site seçmek için yapma. Boncuk agregaları oluşumunu önlemek için, hücrelere eklemeden önce iyice antijeni konjugasyonlu boncuklar girdap önemlidir. Ayrıca, immünofluorescence deneyler için, görüntü analizi sırasında yanlış yorumlamalar önlemek amacıyla, birden fazla boncuk yakalayan miktar hücreleri hariç öneririz. Numunelerin hazırlanması için başka bir kritik adım, sabitleme/geçirgen durumdur. Örneğin, Mikrotubul boyama ve phalloidin boyama için% 4 PFA optimize etmek için metanol ile hücreleri sabitleme öneririz. Aynı anda aksinin siterat ve mikrotübülleri etiketlerken, bir alternatif, bir LifeAct-GFP/RFP ifadesi plazmid mikrotubüs boyama ile kombinasyon halinde hücreleri nakli tarafından aksinin havuzunu etiketlemek için olabilir. Centrosome ve diğer hücre içi organelin kutuplaşımını ölçmek için kullanılan görüntü alımı, bir epifluorescence mikroskop ile gerçekleştirilebilir. Ancak, farklı z düzlemlerinde doğru bir ölçüm elde etmek için, örneğin yayılan tahlil, Konfokal mikroskopi gereklidir.
Burada anlatılan centrosome yalıtım protokolü için, kritik bir adım, proteinlerin immünoblot tarafından ölçülmesine yarayan uygun miktarda numune elde etmektir. B hücrelerinin büyük bir çekirdeğine sahip olduğu ve Sitoplazmanın toplam hücre hacminin% 30 ' undan az olduğu göz önüne alındığında, sitoplazmik proteinlerin yüksek verimleri elde etmek zor olabilir. Bu nedenle, centrosome yalıtım için her etkinleştirme zaman noktası için yaklaşık 20 x 106 B hücre kullanmanızı öneririz.
Bu yöntemlerin önemli bir sınırlama, antijen konjugasyonlu boncuklar ile aktivasyon hangi yüzey-gergin antijenler B hücreleri in vivo sunulan çevrenin karmaşıklığı içermez olmasıdır. Bu sınırlama, kültür veya boncuk diğer ortak stimatuvar faktörleri ile tamamlayıcı tarafından ele alınabilir, sitokinler ve ekstrelüler matris bileşenleri gibi. Ancak, sonuçları doğru şekilde yorumlamak için bu durumlarda uygun denetimleri kullanmak çok önemlidir.
Bu çalışmada sunulan yöntemlerin önemi B hücresi bağışıklık sinaps çalışma için kullanılan entegre yaklaşım dayanır: (1) organizlerin polarizasyon ve onların dağılımı ve (2) centrosome protein bileşimi değişiklikleri. Bu süreçte oluşturulan bir anlamlı analiz ve veri büyük miktarda gerçekleştirmek için gerekli hücrelerin çok sayıda nedeniyle, bu çalışma sunulan farklı kantifikasyon algoritmalar hücre görüntüleme analizi kolaylaştırır. Dahası, hücre polarizasyon için kullanılan algoritmalar ımagej, tekrarlayan görevleri azaltmak ve zaman kazanmak için yararlı bir araçtır makrolar fonksiyonları tarafından otomatize kolaydır.
Bu deneysel prosedürler belirli bir hücresel fonksiyon gerçekleştirmek için polarize fenotipleri kurmak hücrelerin diğer türleri için ekstrapole olabilir. Buna ek olarak, bu protokoller, örneğin, Centrosome zenginleştirilmiş kesirler içinde kinazlar veya proteinler gibi ilişkili proteinlerin aktivitesi, diğer kuralları dahil olmak üzere optimize edilebilir. Genel olarak, bu çalışmalar hücre sinyalizasyon ve Hücre polaritesi kurulması düzenleyen moleküler yollar içine mekanik anlayış sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
M.-I.Y. FONDECYT #1180900 bir araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. J.I., D.F. ve si., Comisión Nacional de ciencia y Tecnología 'dan Burslar tarafından destekleniyor. Biz video kayıt ve düzenleme için Pontificia Universidad Católica de Chile David Osorio teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
