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Immunology and Infection

प्रतिरक्षा Synapse गठन के दौरान बी कोशिकाओं में Organelle गतिशीलता का अध्ययन

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59621
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 1
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián
* These authors contributed equally

Summary

इसमें हम आईएस के गठन के दौरान बी लिम्फोसाइटों में कोशिका ध्रुवण की घटनाओं की विशेषता के लिए दो तरीकों का वर्णन करते हैं। पहला, ऑर्गेनेल भर्ती और साइटोस्केलेटन की मात्रा निर्धारण शामिल है, जो synaptic झिल्ली पर है। दूसरा एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण है, सेंट्रोसोम की संरचना में परिवर्तन की विशेषता है, जो प्रतिरक्षा synapse के लिए ध्रुवीकरण से होकर गुजरती है.

Abstract

बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) द्वारा सतह-टेदरएंटीड एंटीजन की मान्यता एक प्रतिरक्षा synapse (आईएस) के गठन से चलाता है, जहां दोनों संकेतन और प्रतिजन तेज समन्वित कर रहे हैं। IS के गठन में गतिशील actin remodeling शामिल है, जिसमें सेंट्रोसोम और संबद्ध इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स जैसे लाइसोसोम और गोलगी उपकरण की synaptic झिल्ली के लिए polarized भर्ती के साथ। actin remodeling के प्रारंभिक चरणों बी कोशिकाओं को अपने सेल सतह को बढ़ाने के लिए और synapse पर इकट्ठा प्रतिजन-BCR परिसरों की मात्रा को अधिकतम करने के लिए अनुमति देते हैं। कुछ शर्तों के तहत, जब बी कोशिकाओं कठोर सतहों से जुड़े प्रतिजनों को पहचान, इस प्रक्रिया को स्थानीय भर्ती और lysosomes के स्राव के लिए युग्मित है, जो प्रतिजन निष्कर्षण की सुविधा कर सकते हैं. अपटेक्ड एंटीजन को पेप्टाइड्स में प्रसंस्करण के लिए विशेष एंडो-लाइसोमिक डिब्बों में आंतरिकीकृत किया जाता है, जो टी सहायक कोशिकाओं को आगे प्रस्तुति के लिए प्रमुख हिस्टोसंगतता जटिल द्वितीय (एमएचसी-II) अणुओं पर लोड किया जाता है। इसलिए, एक IS के गठन के साथ जुड़े organelle गतिशीलता का अध्ययन कैसे बी कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान लेख में हम इमेजिंग और एक जैव रासायनिक तकनीक दोनों पर चर्चा करेंगे जो इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनिक पोजीशनिंग और साइटोस्केलेटन पुनर्व्यवस्थापन में परिवर्तन ों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है जो बी कोशिकाओं में आईएस के गठन से जुड़े हैं।

Introduction

बी लिम्फोसाइटों विभिन्न खतरों और हमलावर रोगजनकों के खिलाफ एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जिम्मेदार अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अनिवार्य हिस्सा हैं। एंटीबॉडी उत्पादन की दक्षता बी कोशिकाओं को प्राप्त करने, प्रक्रिया करने की क्षमता द्वारा निर्धारित की जाती है और वर्तमान प्रतिजनों का सामना किसी घुलनशील या सतह से बने रूप1,2में होता है। बीसीआर द्वारा एक प्रस्तुत कोशिका की सतह से जुड़े एंटीजनों की पहचान, एक करीबी अंतरकोशिकीय संपर्क के गठन की ओर ले जाती है जिसे आईएस3,4कहा जाता है। इस गतिशील मंच के भीतर बीसीआर-निर्भर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग और एंडो-लाइसोम डिब्बों में एंटीजन का आंतरिककरण दोनों जगह लेता है। अपटेककिए एंटीजन संसाधित किए जाते हैं और एमएचसी-II अणुओं पर इकट्ठे होते हैं और बाद में टी लिम्फोसाइटों को प्रस्तुत किए जाते हैं। उत्पादक बी-टी बातचीत, बी-टी सेल सहयोग कहा जाता है, बी लिम्फोसाइटों उचित संकेत प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं, जो एंटीबॉडी उत्पादक प्लाज्मा कोशिकाओं या स्मृति कोशिकाओं8में उनके भेदभाव को बढ़ावा देने के।

बी कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन निष्कर्षण में दो तंत्र शामिल किया गया है. पहला व्यक्ति लाइसोसोम से उत्पन्न प्रोटीज के स्राव पर निर्भर करता है जो सिनैप्टिक फांक5,6में भर्ती और संलयन से गुजरता है . दूसरा, मायोसिन आईआईए-मध्यस्थ पुलिंग बलों पर निर्भर करता है जो एंटीजन के आक्रमण को ट्रिगर करता हैजिसमें झिल्ली युक्त होती है जो क्लैथरिन लेपित गड्ढों में आंतरिक होती है। प्रतिजन निष्कर्षण का तरीका झिल्ली के भौतिक गुणों पर निर्भर करता है जिसमें एंटीजन पाए जाते हैं। फिर भी, दोनों ही मामलों में, बी कोशिकाओं दो प्रमुख remodeling घटनाओं से गुजरना: actin cytoskeleton पुनर्गठन और IS के लिए organelles के ध्रुवीकरण. Actin cytoskeleton remodeling एक प्रारंभिक प्रसार चरण है, जहां synaptic झिल्ली पर actin-निर्भर protrusions प्रतिजन के साथ संपर्क में सतह में वृद्धि शामिल है. यह एक संकुचन चरण के बाद है, जहां बीआरसी एंटीजन के साथ मिलकर आणविक मोटर्स और actin cytoskeleton remodeling8,9,10के ठोस कार्रवाई द्वारा IS के केंद्र में केंद्रित कर रहे हैं, 11organelles के ध्रुवीकरण भी actin cytoskeleton के remodeling पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, सेंट्रोसोम नाभिक से अयुग्मित हो जाता है, संबद्ध एक्टिन के स्थानीय विबहुलकन द्वारा, जो इस ऑर्गेनेल को आईएस5,12में पुन: स्थापन करने की अनुमति देता है। बी कोशिकाओं में, एक सेल पोल (आईएस) के लिए सेन्ट्रोसोम की स्थिति synaptic झिल्ली के लिए lysosome भर्ती गाइड, जोस्राव पर निष्कर्षण और / आईएस में भर्ती लाइसोसोम एमएचसी-II से समृद्ध हैं, जो एंडोसोमल डिब्बों में पेप्टाइड-एमएचसी-II परिसरों के गठन के पक्ष में है जिसे टी सेल13में प्रस्तुत किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, गोलगी उपकरण को भी आईएस14में निकट से भर्ती किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि गुप्त मार्ग से गोलगी व्युत्पन्न vesicles एंटीजन निष्कर्षण और/या प्रसंस्करण में शामिल किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, synapse गठन के दौरान बी कोशिकाओं में intracellular organelle और cytoskeleton पुनर्व्यवस्थामहत्वपूर्णता महत्वपूर्ण कदम है कि कुशल प्रतिजन अधिग्रहण और प्रसंस्करण उनके आगे सक्रियण के लिए आवश्यक अनुमति देते हैं. इस काम में हम एक IS के गठन के साथ जुड़े organelles के intracellular remodeling का अध्ययन करने के लिए बी कोशिकाओं में इमेजिंग और जैव रासायनिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कैसे पर विस्तृत प्रोटोकॉल परिचय। इन तकनीकों में शामिल हैं: (i) प्रतिजन लेपित मोतियों के साथ और एंटीजन लेपित कवरलिप्स के साथ सक्रिय बी कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस ेशन और छवि विश्लेषण, जो आईएस को जुटाने वाले इंट्रासेल्यूलर घटकों के दृश्य और परिमाणीकरण की अनुमति देता है और (ii ) सुक्रोज ग्रेडिएंट पर ultracentrifugation द्वारा बी कोशिकाओं में सेंट्रोसोम समृद्ध भिन्नों के अलगाव, जो सेंट्रोसोम के साथ जुड़े प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है, संभवतः सेल ध्रुवता को विनियमित करने में शामिल.

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Protocol

नोट: निम्न चरणों IIA1.6 B कक्षों का उपयोग कर किया गया।

1. प्रतिजन लेपित मोती के साथ बी सेल सक्रियण

  1. प्रतिजन लेपित मोती की तैयारी
    1. बी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, एन एच2-बीड्स को एंटीजन (एजी-कोट्ड मोती) के साथ सहसंयोजक रूप से लेपित करें, जो 3 डिग्री एनएच2-मोड्स के साथ सक्रिय (बीसीआर-लिगंड+) या गैर-सक्रिय (बीसीआर-लिगन्ड-) एंटीजन का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं।
    2. IIA1.6 बी कोशिकाओं के लिए विरोधी आईजीजी-एफ (ab')2 टुकड़ा BCR-ligand + और विरोधी IgM-F (ab')2 या गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के रूप में BCR-ligand के रूप में उपयोग करें। प्राथमिक बी कोशिकाओं या IgM+ बी सेल लाइन का उपयोग सक्रिय करने के लिए विरोधी-IgM-F (ab')2 के रूप में BCR-ligand + और बीएसए BCR-ligand-के रूप में.
      नोट: Fc रिसेप्टर के लिए ligands की बाइंडिंग से बचने के लिए, उपयोग एफ (एबी) या एफ (ab')2 एंटीबॉडी टुकड़े के बजाय पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी.
    3. एजी लेपित मोती की तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए, नमूना हेरफेर के दौरान मोती वसूली को अधिकतम करने के लिए कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों में मोती जगह है। 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर मोती और अपकेंद्रित्र धोने के लिए 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) का 1 एमएल जोड़ें।
    4. एनएच2 समूहों को सक्रिय करने के लिए 8% glutaraldehyde के 500 $L के साथ मोती को पुन: निलंबित करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 एच के लिए बारी बारी से।
      चेतावनी: glutaraldehyde शेयर समाधान केवल एक रासायनिक धूआं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) पर दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    5. 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज मोती, glutaraldehyde को हटाने और 1x PBS के 1 एमएल के साथ तीन बार मोती धो लो।
      चेतावनी: glutaraldehyde समाधान एक खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में खारिज कर दिया जाना चाहिए.
    6. 1x PBS के 100 $L में सक्रिय मोती को पुन: निलंबित करें। नमूने को दो कम प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित किया जा सकता है: बीसीआर-लिगन्ड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस+ और बीसीआर-लिगंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस।
    7. प्रतिजन विलयन को तैयार करने के लिए दो 2 एमएल कम प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करें, जिनमें पीबीएस के 150 डिग्री एल में प्रतिजन विलयन का 100 ग्राम/एमएल है: बीसीआर-लिगन्ड के साथ एक ट्यूब- लिगन्ड+ और अन्य बीसीआर-लिगन्ड के साथ।
    8. प्रत्येक ट्यूब पर सक्रिय मोती विलयन का 50 डिग्री सेल्सियस घोल जोड़ें जिसमें प्रतिजन विलयन का 150 डिग्री सेल्सियस, भ्रमिल है तथा रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाइए।
    9. मोतियों पर शेष प्रतिक्रियाशील एनएच2 समूहों को अवरोधित करने के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल बीएसए का 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए घुमाएं।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर मोती को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को हटा दें। ठंड 1x पीबीएस के साथ मोती तीन बार धो लें.
    11. 1x PBS के 70 $L में सक्रिय मोती को पुन: निलंबित करें।
    12. एजी लेपित मोती के अंतिम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, पीबीएस (1:200) में मोती की एक छोटी मात्रा पतला और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग गिनती. फिर उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एजी लेपित मोती से अधिक 1 महीने के लिए संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए।
  2. पॉली-एल-लाइसिन कवरलिप्स की तैयारी
    1. एजी लेपित मोती के साथ बी सेल सक्रियण परख से पहले, पॉली-एल-लीसाइन लेपित कवरलिप्स (PLL-coverslips) तैयार करें। PLL समाधान के 0.01% w/v के 40 एमएल युक्त एक 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करें और समाधान में 12 मिमी-व्यास coverslips विसर्जित कर दिया। आरटी पर रात भर घुमाएँ.
    2. 1x पीबीएस के साथ कवरलिप्स को धोएं और पैराफिन फिल्म के साथ कवर किए गए 24-वेल प्लेट ढक्कन पर सूखने के लिए छोड़ दें। B सेल सक्रियण के साथ आगे बढ़ें.
  3. B सेल सक्रियण
    1. मोती के साथ बी सेल सक्रियण शुरू करने के लिए, पहले क्लिक करें माध्यम में 1.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल करने के लिए आईआईए1.6 बी सेल लाइन को पतला (आरपीएमआई-1640 2 एमएम एल-एलैनीन-एल-ग्लूटामाइन + 55 $M बीटा-मेरप्टो + 1 एम एम पाइरुवट + 100 यू/एमएल पेनिसिलिन + 100 ग्राम के साथ पूरक स्ट्रेप्टोमाइसिन) + 5% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS]).
    2. आईआईए1.6 बी कोशिकाओं के 100 $L (150,000 कोशिकाओं) को 0.6 एमएल ट्यूबों में 1:1 अनुपात पर एजी लेपित मोती के साथ संयोजित करें। PLL-coverslips पर एक भंवर और बीज का उपयोग कर धीरे मिक्स. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में विभिन्न समय बिंदुओं के लिए इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस / ठेठ सक्रिय समय अंक 0, 30, 60 और 120 मिनट हैं. 0 समय के लिए, PLL-coverslips बर्फ पर 24 अच्छी तरह से थाली ढक्कन में जगह है. कोशिकाओं को जोड़ें-Ag लेपित मनका मिश्रण और बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
      नोट: यह ऊपर और नीचे pipeting के बजाय भंवर द्वारा मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नमूना में मोती की संख्या को कम कर सकता है, pippette की प्लास्टिक टिप में उनके संचय के कारण. बीसीआर-लिगंड के साथ लेपित मोती का उपयोग करें- प्रत्येक परख के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। हम सबसे लंबे समय तक ऊष्मायन समय पहले और फिर निम्न समय अंक को सक्रिय करने की सलाह देते हैं। नमूनों के लिए सक्रियण के अंतराल की गणना करें ताकि वे एक ही समय में निर्धारण के लिए तैयार हों.
    3. सक्रियण को रोकने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने के लिए प्रत्येक कवरस्लिप में ठंड 1x पीबीएस के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। प्रोटोकॉल अनुभाग 3 देखें.

2. प्रतिजन लेपित कवरलिप्स पर बी सेल सक्रियण

  1. प्रतिजन लेपित कवरलिप्स की तैयारी
    1. सक्रियण से पहले, प्रतिजन समाधान तैयार करें (1x PBS जिसमें 10 g/mL BCR-ligand+ और 0.5 g/mL चूहे एंटी-माउस CD45R/B220) होते हैं।
      नोट: परख से पहले दिन coverss तैयार करने पर विचार करें. B220 B सेल आसंजन में सुधार करता है, तथापि, BCR-Ligand + प्रसार प्रतिसाद जनरेट करने के लिए पर्याप्त है।
    2. पैराफिन फिल्म के साथ कवर किए गए 24-वेल प्लेट ढक्कन पर 12 मिमी कवरस्लिप रखें, प्रत्येक कवरस्लिप पर प्रतिजन समाधान के 40 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रतिजन समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लेट को सील करें।
    3. 1x पीबीएस और हवा सूखी के साथ कवरलिप्स धो लें।
  2. B सेल सक्रियण
    1. सक्रियण प्रारंभ करने के लिए, CLICK माध्यम + 5% FBS में 1.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल को IIA1.6 B कोशिकाओं को पतला करें।
    2. एक एंटीजन लेपित कवरस्लिप (एजी-कवरस्लिप) पर कोशिकाओं के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में विभिन्न समय बिंदुओं के लिए सक्रिय करें । ठेठ सक्रिय समय अंक 0, 30 और 60 मिनट हैं.
      नोट: अनुभाग 1 में के रूप में, हम एक ही समय में सभी नमूनों को ठीक करने के क्रम में सबसे लंबे समय तक सक्रिय समय बिंदु के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं।
    3. 0 समय के लिए, बर्फ पर एजी-कवरस्लिप युक्त 24-अच्छी प्लेट ढक्कन रखें और कोशिकाओं को जोड़ें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    4. ध्यान से प्रत्येक एजी-कवरस्लिप पर मीडिया aspirate और फिर सक्रियण को रोकने के लिए ठंड 1x PBS के 100 $L जोड़ें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें। अनुभाग 3 देखें.

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: IIA 1.6 बी कोशिकाओं के बीसीआर के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के पार प्रतिक्रिया से बचने के लिए, माउस व्युत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग न करें।

  1. 1x पीबीएस निकालें और प्रत्येक कवरस्लिप के निर्धारण के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: जो निर्धारण माध्यम का उपयोग करने के लिए तय करने के लिए, एंटीबॉडी / डाई डेटा शीट की जाँच करें। उदाहरण के लिए, एलोबिडिन द्वारा actin लेबलिंग के लिए paraformaldehyde (पीएफए) निर्धारण माध्यम का उपयोग करें, और pericentrin उपयोग मेथनॉल निर्धारण द्वारा केंद्रक लेबलिंग के लिए।
    1. 1x पीबीएस के 50 $L जोड़ें 4% पीएफए और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ पूरक।
      चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त है. इस रसायन के साथ काम करने से पहले कृपया MSDS पढ़ें. पीएफए समाधान केवल दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहने हुए एक रासायनिक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए। पीएफए समाधान एक खतरनाक रासायनिक कचरे के रूप में खारिज कर दिया जाना चाहिए।
    2. वैकल्पिक रूप से, 20 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल और इनक्यूबेट के 50 डिग्री एल जोड़ें।
  2. 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें.
    नोट: Coverslips 1x पीबीएस में अधिकतम तीन दिनों के लिए इस बिंदु पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. 1x पीबीएस निकालें और प्रत्येक कवरस्लिप पर बफर (2% बीएसए + 0.3 एम ग्लिसिन इन 1x पीबीएस) को अवरुद्ध करने के 50 $L जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
  4. धीरे से प्रेरित और permeabilization बफर (पीबी) (0.2% बीएसए + 1x PBS में 0.05% saponin) के 50 $L जोड़ें। 20 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
  5. पंजाब में एंटीबॉडी या रंगों को तैयार करें (30 डिग्री सेल्सियस प्रति कवरस्लिप का उपयोग करें) और आरटी पर 1 एच या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें। अतिरिक्त विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें।
    1. माइक्रोट्युबुल आयोजन केंद्र (MTOC) या सेन्ट्रोसोम को लेबल करने के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें: एंटी-टूबुलिन (1:500), एंटी-सेप55 (1:500), एंटी-जेड-ट्युबुलिन (1:500), एंटी-पेरिसेंटरिन (1:1000)।
      नोट: सेंट्रोसोम लेबलिंग बी कोशिकाओं के लिए एक सेंट्रीन-GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ transfected किया जा सकता है।
    2. लेबलिंग के लिए Golgi उपकरण विरोधी Rab6a (1:500) का उपयोग करें.
      नोट: अन्य एंटीबॉडी या रंगों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. lysosomes लेबलिंग के लिए, विरोधी Lamp1 (1:200) का उपयोग करें.
      नोट: विरोधी H2-डीएम और विरोधी MHC-II भी प्रतिजन प्रसंस्करण डिब्बों लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता15,16.
    4. लेबलिंग के लिए एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम एंटी-सेक61ए (1:500) का उपयोग करें।
    5. actin cytoskeleton के लिए निम्नलिखित पर विचार करें: बहुलक actin फ्लोरोसेंट रंगों के लिए संयुग्मी Phaloidin द्वारा कल्पना की जा सकती है.
      नोट: बी कोशिकाओं एक LifeAct-GFP/RFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ transfected भी actin लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. कवरलिप्स को पीबीएस से तीन बार धोएं।
  7. पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी या रंगों को पतला करें (प्रति कवरस्लिप 30 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें) और आरटी में 1 एच इनक्यूबेट करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट संकेत की गुणवत्ता को बनाए रखने के लिए प्रकाश को निर्देशित करने के लिए नमूनों को उजागर करने से बचें।
  8. कवरलिप्स को पीबीएस से तीन बार धोएं।
  9. कवरलिप्स से PBS समाधान निकालें.
  10. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए बढ़ते अभिकर्मक के 4 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। नीचे का सामना करना पड़ सेल पक्ष के साथ स्लाइड पर कवरस्लिप माउंट करें। स्लाइड 37 डिग्री सेल्सियस पर या रात आरटी पर 30 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति दें।
    नोट: एक "विरोधी फीका" बढ़ते अभिकर्मक का उपयोग करने पर विचार करें (सामग्री की तालिकादेखें).
  11. एक 60x या 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक confocal या epifluorscence माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण. प्रत्येक अधिग्रहण के लिए प्रेषित प्रकाश या उज्ज्वल क्षेत्र पर विचार करने के लिए आसानी से बी कोशिकाओं मोती के साथ बातचीत की पहचान.
    नोट: तीन आयामी (3 डी) छवियों ले लो, पूरे सेल को कवर z-स्टैक का उपयोग कर. हम 0.5 मीटर मोटी ढेर लेने की सलाह देते हैं, हालांकि यह माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है।

4. छवि विश्लेषण

नोट: निम्न एल्गोरिथ्म ImageJ सॉफ़्टवेयर के लिए वर्णन किया गया है। हालांकि, यह एक समकक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया जा सकता है। इसके अलावा, विचार है कि सभी फ्लोरोसेंट तीव्रता माप के लिए हम एकीकृत फ्लोरोसेंट घनत्व का उपयोग करें ("RawIntDen" ImageJ में), क्योंकि इस पैरामीटर छवि के प्रत्येक पिक्सेल में फ्लोरोसेंट की कुल राशि पर विचार करता है, खाते में क्षेत्र ले रही है.

  1. एजी लेपित मोती के साथ सक्रिय बी कोशिकाओं में organelles के वितरण का विश्लेषण
    नोट: IS के लिए सेल घटकों के ध्रुवीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हम IS के निकटता के एक उपाय के रूप में एक मनमाना मूल्य को परिभाषित. सूचकांक -1 (विरोधी polarized) और 1 के बीच पर्वतमाला (पूर्ण polarized, मनका पर वस्तु), के रूप में पहले Reversat एट अल द्वारा प्रस्तुत किया गया था.12.
    1. सेंट्रोसोम तथा गोल्गी उपकरण के लिए ध्रुवता सूचकांक का अनुमान लगाइये (चित्र 1ब)
      नोट: यह एल्गोरिथ्म organelles कि एक बिंदु तक ही सीमित हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
      1. पहले दोनों की सीमाओं को सीमाओं को सीमित करने के लिए वृत्त उपकरण चयन का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए मनका और कक्ष क्षेत्रों को परिभाषित करें, और फिर उन्हें रुचि के क्षेत्रों (ROI) के रूप में सहेजें. चित्र 1, चित्र 2, चित्र 3 और चित्र 4देखें .
      2. विश्लेषण चलाकर सेल सेंटर (सीसी) और मनका केंद्र (ईसा पूर्व) का निर्धारण करें . सेल और मनका क्षेत्रों पर क्रमशः उपाय. परिणाम विंडो से प्राप्त X और Y मान केंद्र निर्देशांक निर्धारित करते हैं.
      3. मैन्युअल रूप से ImageJ में बिंदु उपकरण चयन का उपयोग कर centrosome या Golgi उपकरण (Organelle) के केंद्र का निर्धारण और विश्लेषण चलाते हैं | उपाय| परिणाम विंडो से प्राप्त X और Y मान निर्देशांक निर्धारित करते हैं.
      4. फिर, सीसी से Organelle (एक) और सीसी से बीसी के लिए एक कोण आकर्षित (ख) कोण उपकरण चयन का उपयोग कर और विश्लेषण चलाते हैं | उपाय| परिणाम विंडो में कोण मान दोनों सदिशों (ए और ब ) के बीच कोण (एऔर ख) को दर्शाता है।
      5. निम्न सूत्र का उपयोग करके ध्रुवता अनुक्रमणिका परिकलित करें:
        Equation 1
    2. लाइसोसोम के लिए ध्रुवता सूचकांक का अनुमान लगाएँ (चित्र 1 एफ)।
      नोट: हम इस एल्गोरिथ्म का उपयोग organelles की ध्रुवता का विश्लेषण करने के लिए करते हैं जो अधिक परिक्षिप्त वितरण प्रदर्शित करते हैं, जैसे लाइसोसोम।
      1. दोनों की सीमाओं को सीमाओं को सीमित करने के लिए वृत्त उपकरण चयन का उपयोग करके, विश्लेषण करने के लिए मनका और कक्ष क्षेत्रों को परिभाषित करें, और उन्हें ROI के रूप में सहेजें. एक बार मनका और सेल क्षेत्रों determind किया गया है, फ्लोरोसेंट चैनल सेट और एक z-स्टैक में छवि परियोजना (छवि ] ढेर ] [परियोजना [सम स्लाइस]), तो विश्लेषण चलाएँ ] उपाय और बड़े पैमाने पर केंद्र निकालने (एमसी) निर्देशांक (MX और MY) परिणाम खिड़कियों से.
      2. एम सी के लिए Organelle बदलने से पहले उल्लेख किया एक ही एल्गोरिथ्म लागू करें. इस प्रकार, कोण (र्) को सीसी-एमसी (क) तथा सीसी-बीसी (ख) द्वारा परिभाषित किया जाता है।
      3. निम्न सूत्र का उपयोग करके ध्रुवता की गणना करें:
        Equation 2
    3. संग्रथित क्षेत्र में लाइसोसोम भर्ती का अनुमान लगाना (चित्र 2ख) ।
      नोट: इस एल्गोरिथ्म IS के बगल में एक organelle मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
      1. एक बार मनका और सेल क्षेत्रों निर्धारित किया गया है, सीसी और ईसा पूर्व के बीच वेक्टर के कोण का निर्धारण और फिर एक 0 डिग्री कोण को प्राप्त करने के लिए छवि बारी बारी से.
      2. फ्लोरोसेंट चैनल सेट करें और छवि को एक z-स्टैक में प्रोजेक्ट करें (छवि | ढेर ] [परियोजना [सम स्लाइस]),सभी फ्लोरोसेंट कि सेल और मनका क्षेत्र के बाहर एक साथ गिर जाता है को खत्म (संपादन चलाने [ ImageJ में बाहर स्पष्ट).
      3. आयत उपकरण चयन का उपयोग करना, मनका के निकट एक आयत आकर्षित और synaptic क्षेत्र फ्लोरोसेंट (एसएएफ) को मापने. यह आयत कक्ष चौड़ाई का एक चौथाई है.
      4. पूरी छवि का चयन करें और विश्लेषण चलाएँ ] पूरे सेल फ्लोरोसेंट प्राप्त करने के लिए उपाय (WCF) .
      5. निम्नसूत्र का उपयोग करके IS के निकट organelle फ्लोरोसेंट प्रतिशत की गणना करें:
        Equation 4
    4. सेंट्रोसोम के लिए सेलुलर घटकों की भर्ती की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: यह एल्गोरिथ्म, Obino एट अल.5से अनुकूलित, सेंट्रोसोम क्षेत्र में organelles के संवर्धन की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। संक्षेप में, हम सेन्ट्रोसोम क्षेत्र को उस डोमेन के रूप में मानते हैं जिसमें सेन्ट्रोसोम-संबद्ध ऑर्गेनेल फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट में 70% से अधिक या 70% से अधिक रहता है। यह इस त्रिज्या सक्रियण पर बदल सकता है क्योंकि आराम की स्थिति में इस पैरामीटर सेट करने के लिए आवश्यक है.
      1. एक बार मनका और कक्ष क्षेत्रों का निर्धारण हो जाने के बाद, बिंदु उपकरण चयन (चित्र3ख)का उपयोग करके सेन्ट्रोसोम के स्थानीयकरण को परिभाषित करें।
      2. सबसे पहले, सेंट्रोसोम के आस-पास के 3 डिग्री मीटर के दायरे के वृत्त को खींचकर, सेंट्रोसोम के आस-पास के अधिकतम क्षेत्र का निर्धारण करें जो परिमाणित करना संभव है।
      3. ImageJ प्लगइन रेडियल प्रोफाइलका उपयोग करें, जो गाढ़ा हलकों में फ्लोरोसेंट के उपाय और एक फ्लोरोसेंट /
      4. अधिकतम त्रिज्या की पहचान करें जिसके भीतर फ्लोरोसेंट तीव्रता का कम से कम 70% बनाए रखा जाता है।
      5. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर के फ्लोरोसेंट घनत्व अनुपात की गणना:
        Equation 5=Equation 6
        नोट: फ्लोरोसेंट घनत्व अनुपात पूरे सेल में इसके वितरण की तुलना में सेंट्रोसोम पर एक organelle की एकाग्रता को इंगित करता है।
  2. एजी-कवरलिप्स पर सक्रिय बी कोशिकाओं में अंग के प्रसार और वितरण का विश्लेषण
    1. आईएस में आर्गेनेल वितरण का अनुमान लगाते हैं (चित्र 4ख)।
      नोट: यह एल्गोरिथ्म IS के केंद्र में organelles के XY वितरण और उनकी एकाग्रता के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। हम केंद्रीय और कुल synaptic क्षेत्र के बीच फ्लोरोसेंट घनत्व के अनुपात को परिभाषित. प्राप्त मान ऋणात्मक से सकारात्मक में भिन्न हो सकते हैं, जो क्रमशः ऑर्गेनेल के परिधीय या केंद्रीय वितरण का संकेत देते हैं।
      1. वह स्लाइस निर्धारित करें जिसमें कक्ष आवरण के संपर्क में है.
        नोट: सेल सीमाओं को सीमांकित करने के लिए एक प्लाज्मा झिल्ली या actin जो IS की परिधि में समृद्ध है लेबल कर सकते हैं.
      2. 8-बिट करने के लिए स्लाइस का प्रकार बदलें, फिर binarize (प्रक्रिया | बाइनरी जेड बाइनरी) बनाएं और निकटतम बाहरी अंक प्रक्रिया को कनेक्ट करें | बाइनरी जेड बाह्यरेखा. बहुभुज उपकरण चयन काउपयोग करके कक्ष क्षेत्र (CA ) की सीमाओं को सीमाओं को सीमांकित करें.
        नोट: यह चरण कक्ष सीमाओं के कंट्रास्ट को बढ़ाने और पहचानना आसान बनाने के लिए उपयोगी है. इसके अलावा, इस बिंदु पर, यह स्वचालित रूप से सीए निर्धारित करने के लिए ImageJ के विश्लेषण कण प्लगइन लागू करने के लिए संभव है. हालाँकि, एक ही फ़ील्ड में अन्य कक्ष परिणामों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
      3. CA पैरामीटर (ऊँचाई और चौड़ाई) लें और एक केंद्रीय गोल क्षेत्र को सीमांकित करें, जो सीमाओं से ऊँचाई और चौड़ाई मानों के एक चौथाई से अलग होता है, इस क्षेत्र को कक्ष केंद्र क्षेत्र (सीसीए) के रूप में मानते हैं.
      4. निम्न सूत्र का उपयोग करके IS के केंद्र में फ्लोरोसेंट घनत्व वितरण की गणना करें:
        Equation 7
    2. $ विमानों में आर्गेनेल वितरण को मापें (चित्र 4C)
      नोट: यह विश्लेषण Ag-coverslips पर सक्रिय बी कोशिकाओं के विमानों भर में organelle फ्लोरोसेंट के सामान्य वितरण को निर्धारित करता है, प्रति $ अंश फ्लोरोसेंट का प्रतिशत दिखा.
      1. $ में फ्लोरोसेंट वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले आईएस के विमान का निर्धारण जहां सेल एजी-कवरस्लिप के साथ संपर्क में है और फिर सेल की ऊपरी सीमा के अनुरूप विमान।
      2. कक्ष केंद्र में एक रेखा आरेखित करें.
      3. छवि को ]( Image ] में पुन: slice करें ढेर ] Reslice),एक X$ छवि प्राप्त करने के लिए.
      4. ऊंचाई को मापने और एक ही ऊंचाई के 10 लगातार आयतों में X] छवि विभाजित (आईएस इंटरफ़ेस) नीचे से ऊपर (सेल के ऊपरी पक्ष) और हर एक में फ्लोरोसेंट संकेत मात्रा निर्धारित.
      5. 10 अंशों के कुल फ्लोरोसेंट के योग से प्रत्येक अंश की फ्लोरोसेंट तीव्रता को सामान्य करें।
      6. सेल के प्रति फ्लोरोसेंट तीव्रता के प्रतिशत को प्लॉट करें।

5. आराम और सक्रिय बी कोशिकाओं से सेंट्रोसोम समृद्ध अंश का अलगाव

नोट: प्रोटीन गिरावट से बचने के लिए प्रयोग के दौरान सभी समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस प्रोटोकॉल को पिछले कार्य17,18से अनुकूलित किया गया था .

  1. क्लिक माध्यम के 2 एमएल में एजी लेपित मोती के साथ 2 x 107 बी कोशिकाओं को सक्रिय करें + 2% गर्मी-सक्रिय FBS (अनुपात 1:1). बी कोशिकाओं को आराम के रूप में गैर सक्रिय बी कोशिकाओं पर विचार करें.
  2. साइटोचलसिन डी (2 डिग्री सेल्सियस) और नोकोडाज़ोल (0.2 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इन दवाओं को धीरे नाभिक से सेंट्रोसोम अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है, depolymerizing actin cytoskeleton और microtubules, क्रमशः, परमाणु संदूषण से बचने के लिए.
  3. ठंड 1x टीबीएस (50 एमएम Tris-HCl, पीएच 7.6, 150 एमएम NaCl) के 5 एमएल के साथ प्रत्येक नमूना धो लें और फिर 0.1x टीबीएस के 1 एमएल के साथ 8% सुक्रोज के साथ पूरक।
  4. 150 $L सेन्ट्रोसोम lysis बफर (1 mM HEPES, पीएच 7.2, 0.5% एनपी-40, 0.5 एमएम MgCl2, 0.1% बीटा-Mercaptoethanol, 1 एमएम फ़ेनिलमेथिलसल्फॉनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) या प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल और पिपेट अप और नीचे तक कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें कम हो जाती है, जो इंगित करता है सेल lysis नमूना में पहचान की है. एक 1.5 एमएल ट्यूब में नमूना रखो.
  5. नाभिक से organelles अलग करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सावधानी से supernatant ठीक हो और ढाल बफर (GB) के 300 $L के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर जगह (10 एमएम पाइप ्सएच 7.2, 0.1% Triton एक्स-100, 0.1% बीटा-mercaptoethanol) 60% सुक्रोज युक्त।
  7. 60% सुक्रोज अंश में सेंट्रोसोम ध्यान केंद्रित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. इस बीच, जीबी के 450 डिग्री सेल्सियस को ओवरले करके 2 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक discontinuous ग्रेडिएंट तैयार करें + 70% जीबी के 270 $L के साथ सुक्रोज + 50% सुक्रोज और फिर 270 डिग्री एल जीबी + 40% सुक्रोज।
  9. पहले centrifugation (centrosome-संकेंद्रित अंश) के बाद, ऊपरी अंश (कम घने भाग) छोड़ ें जब तक इंटरफ़ेस तक पहुँचने और ट्यूब में शेष नमूना भंवर. फिर, पहले से केंट्रोसोम समृद्ध नमूने के साथ तैयार किए गए विरुध ग्रेडिएंट के शीर्ष पर ओवरले।
    नोट: ग्रेडिएंट को बाधित न करने के लिए सावधान रहें, सभी पाइपिंग प्रक्रियाओं को सावधानी से किया जाना चाहिए।
  10. न्यूनतम त्वरण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 40,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और सेंट्रीफ्यूज ब्रेक के साथ बंद करने के लिए सेट किया गया, ढाल को बाधित करने से बचने के लिए।
  11. ऊपर से शुरू होने वाली अलग-अलग ट्यूबों में 100 डिग्री सेल्सियस के 12 अंश एकत्र कीजिए।
  12. इम्यूनोब्लॉट द्वारा सेन्ट्रोसोम समृद्ध भिन्नों को सेन्ट्रोसोम मार्कर के रूप में जेड-ट्यूबुलिन का उपयोग करके पहचानें।
    नोट: हम आम तौर पर भिन्न 6 और 8 के बीच centrosome समृद्ध अर्क पाते हैं।

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Representative Results

वर्तमान लेख से पता चलता है कि कैसे बी कोशिकाओं मोती या coverslips पर स्थिर प्रतिजन का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है एक IS के गठन के लिए प्रेरित. हम कैसे की पहचान करने के लिए और इम्यूनोफ्लोरेसींस द्वारा विभिन्न organelles के ध्रुवीकरण की मात्रा और कैसे प्रोटीन है कि सेंट्रोसोम के लिए उनके सहयोग में गतिशील परिवर्तन से गुजरना की विशेषता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, जो IS के लिए polarizes, एक का उपयोग कर जैव रासायनिक दृष्टिकोण.

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा बी कोशिकाओं की इमेजिंग हमें सेंट्रोसोम, गोलगी उपकरण और lysosomes, जो बी सेल सक्रियण पर IS के लिए भर्ती कर रहे हैं जैसे organelles की गतिशीलता का पालन करने के लिए अनुमति देता है। इन organelles के ध्रुवीकरण को मापने के लिए एक मात्रात्मक पैरामीटर प्राप्त कर सकते हैं और विभिन्न परिस्थितियों में उनकी तुलना कर सकते हैं। जैसा कि हम चित्र 1कमें दिखाते हैं, सेंट्रोसोम और गोलगी परिधानों को आईएस में बी सेल सक्रियण के लिए भर्ती किया जाता है। बी सी आर-लिगंड के साथ प्रेरित बी सेल में भर्ती नहीं देखी गई थी- यह दर्शाता है कि बीसीआर सगाई को आईएस के लिए सेंट्रोसोम और गोलगी तंत्र को जुटाने की आवश्यकता है (चित्र 1क) . प्रत्येक organelle के लिए एक polarity सूचकांक प्राप्त करने के लिए, IS के लिए अपनी निकटता की एक माप के रूप में, हम तीन सुविधाओं पर विचार किया: organelle और सेल के केंद्र के बीच की दूरी, मनका केंद्र और सेल केंद्र के बीच की दूरी, और इन दोनों के बीच कोण दो सदिश (चित्र 1ख) यह अनुक्रमणिका -1 (विरोधी polarized) और 1 (पूरी तरह से polarized, मनका पर वस्तु) के बीच पर्वतमाला. चित्र 1C और 1D ग्राफ़ दिखाते हैं, जहाँ प्रत्येक ऑर्गेनेल की ध्रुवता सूचकांकों को सक्रियण के समय के मुकाबले प्लॉट किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के साथ समझौते में, दोनों सेंट्रोसोम और Golgi उपकरण, सक्रियण के लंबे समय अंक पर अधिक सकारात्मक ध्रुवता अनुक्रमित प्रदर्शित करते हैं, दर्शाती है कि कैसे वे उत्तरोत्तर IS के लिए भर्ती कर रहे हैं. यह एल्गोरिथ्म एक बिंदु तक ही सीमित organelles के लिए लागू है.

इसके अतिरिक्त, हमने पहले उल्लेख किए गए समान एल्गोरिथ्म को लागू करके, लेकिन द्रव्यमान केंद्र निर्देशांकद्वारा बिंदु निर्देशांक को परिवर्तित करके, एक परिक्षिप्त वितरण, जैसे लाइसोसोम (चित्र 1E)प्रदर्शित करने वाले organelles के ध्रुवण की मात्रा निर्धारित की है लाइसोसोम्स (चित्र 1 एफ)। हम देख सकते हैं कि लाइसोसम पूलों के ध्रुवता सूचकांक सक्रियण पर अधिक सकारात्मक मानों तक पहुँचते हैं, जो यह इंगित करता है कि लाइसोसोम बी सेल सक्रियण पर synapse की ओर जुटाया जा रहा है (चित्र 1G)।

हम भी organelles कि synaptic इंटरफ़ेस (बीड) और synapse की निकटता में organelles की राशि के साथ संपर्क में हैं निर्धारित करने के लिए दो एल्गोरिदम को परिभाषित किया है, लेकिन जरूरी नहीं कि संपर्क में. जैसा कि हम चित्र 2में दिखाते हैं , हम कोशिका में कुल प्रतिदीप्ति तथा मनका (चित्र 2ठ) द्वारा मनका क्षेत्र में लैंप-1 संकेत को विभाजित करके synaptic इंटरफ़ेस (चित्र 2A) से संपर्क करते हुए लाइसोसोम की मात्रा निर्धारित करते हैं . यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि मनका क्षेत्र का व्यास प्राप्त प्रतिशत की श्रेणियों को निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, प्रदर्शित परिमाणीकरण में (चित्र 2ख) हम मनका पर फ्लोरोसेंट को मापने के लिए 3 डिग्री मीटर व्यास वाला वृत्त बनाते हैं, जो मनका के आकार (3 डिग्री उ) पर विचार करते हुए एक प्रतिबंधात्मक पैरामीटर है। इस पैरामीटर का उपयोग करके, परिणाम दर्शाते हैं कि लाइसोसोम को उत्तरोत्तर बी सेल सक्रियण पर synaptic इंटरफ़ेस में भर्ती किया जाता है, जो कुल द्रव्यमान का 10-15% तक पहुंच जाता है (चित्र 2C)। एक अन्य दृष्टिकोण दिखाया synaptic क्षेत्र के लिए lysosomes के परिमाणीकरण है. चित्रा 2 डी से पता चलता है कि lysosomes उत्तरोत्तर आईएस में उनके lysosomes के 25% तक जमा. कुल मिलाकर, विश्लेषण के दोनों प्रकार के प्रदर्शन से एक ध्रुवीकरण और IS में organelles की डॉकिंग का मूल्यांकन कर सकते हैं.

बी सेल सक्रियण के दौरान, सेंट्रोसोम संबद्ध प्रोटीन के पूल में परिवर्तन5प्रलेखित किया गया है. उदाहरण के लिए, इन प्रोटीनों में से एक जो बी सेल सक्रियण के दौरान सेंट्रोसोम में अपने संबंध को बदलता है, actin है। इस मामले में actin इस क्षेत्र के भीतर समाप्त हो जाता है, जो सेंट्रोसोम नाभिक से अलग हो जाते हैं, आईएस5के लिए अपने ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने की अनुमति देता है. यहाँ हम सेंट्रोसोम में एक्टिन का परिमाणीकरण प्रस्तुत करते हैं और यह बी सेल सक्रियण पर कैसे समाप्त हो जाता है (चित्र 3)। संबद्ध एक्टिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयुक्त सेन्ट्रोसोम क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए, हमने सेन्ट्रोसोम के आस-पास के संकेंद्री वृत्तों में इस लेबल की फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापा। त्रिज्या को उस बिंदु के आधार पर परिभाषित किया गया था जहां लेबल की फ्लोरोसेंट तीव्रता का कम से कम 70% रखरखाव किया जाता है (चित्र 3ख). इस प्रणोदक का प्रयोग बी सेल सक्रियण पर सेन्ट्रोसोम पर actin घनत्व में कमी का परिमाण कर सकता है, जैसा कि चित्र 3Cमें दर्शाया गया है।

आईएस इंटरफेस पर organelles के वितरण में अधिक से अधिक संकल्प प्राप्त करने के लिए, हम प्रतिजन लेपित coverslips पर बी कोशिकाओं को सक्रिय, लेबलिंग actin, Golgi उपकरण और endoplasmic reticulum (चित्र 4A). आईएस में organelles के वितरण एक केंद्रीय और परिधीय क्षेत्र में synaptic क्षेत्र डाइविंग द्वारा किया जा सकता है, चित्र 4Bमें दिखाया गया एक मानदंड लागू . यह पिछले काम पर आधारित था जो दर्शाता है कि बीआरसी इस केंद्रीय क्षेत्र के भीतर इकट्ठा होते हैं , जो सबसे अधिक संभावना केंद्रीय अधिअणुक सक्रियण परिसर (सीएसमैक)10,19से मेल खाती है . चित्र 4क से पता चलता है कि आईएस में भर्ती किए गए ऑर्गेनाइन, जैसे गोल्गी उपकरण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम वितरण के विपरीत प्रदर्शित करते हैं। वास्तव में, उनके वितरण इंडेक्स चित्र 4ब्में दिखाए गए अपने इम्यूनोफ्लोरेसी दाग के साथ सहसंबंधित होते हैं। Golgi उपकरण एक सकारात्मक मूल्य से पता चलता है, जिसका अर्थ है कि यह IS के केंद्र में केंद्रित है, जबकि endoplasmic reticulum नकारात्मक मूल्यों से पता चलता है, जिसका अर्थ है कि यह मुख्य रूप से IS के परिधीय क्षेत्र में स्थानीयकृत है. इसके अतिरिक्त, यह पहले से निर्धारित synaptic क्षेत्र के मूल्यों को लेने के लिए संभव है, बी सेल सक्रियण के दौरान फैल क्षेत्र को मापने के लिए, के रूप में यह आंकड़े 4D और 4Eमें दिखाया गया है. इन परिणामों से बी सेल सक्रियण पर प्रसार क्षेत्र में वृद्धि दिखाई जाती है, जैसा कि पहले10,20वर्णित किया गया था।

मनका परख के रूप में, हम प्रतिजन लेपित coverslips पर सक्रिय बी कोशिकाओं के X$ छवियों को लेने और ] आयाम भर में organelle फ्लोरोसेंट को मापने के द्वारा प्रतिरक्षा synapse की ओर organelles के वितरण का निर्धारण कर सकते हैं (चित्र 4F)। विमान में एक्टिन की फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापा गया था, क्योंकि इसे चित्र 4 एफमें एक्सजेड विमान में प्रस्तुत किया गया था, जहां सिनैप्टिक इंटरफ़ेस (अंश 1 और 2) पर एक्टिन का प्रगतिशील संवर्धन देखा जा सकता है ( चित्र4जी)।

बी सेल इमेजिंग विश्लेषण के अलावा, हमने सेन्ट्रोसोम-समृद्ध भिन्नों के पृथक्योग का प्रदर्शन किया ताकि सेन्ट्रोसोम-संबद्ध प्रोटीनों की मात्रा निर्धारित की जा सके (चित्र 5क)। यह दृष्टिकोण बी कोशिकाओं में IS के गठन के अध्ययन के पूरक के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, यह देखते हुए कि सेन्ट्रोसोम synaptic झिल्ली के लिए polarizes और एंटीजन निष्कर्षण और प्रस्तुति21में शामिल lysosome तस्करी समन्वय दिखाया गया है. इस विधि को पहले कोशिकाओं की बड़ी मात्रा का उपयोग करके वर्णित किया गया था (1 x 109 कक्ष)17,18 लेकिन हमने एक सरलीकृत संस्करण मानकीकृत किया है, जो कम मात्रा का उपयोग करता है और कम मात्रा का उपयोग करके किया जा सकता है अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज-ट्यूब (2-3 एमएल)। जैसा कि हम चित्र 5Bमें दिखाते हैं , हमने इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा विभिन्न कोशिका भिन्नों का विश्लेषण किया और निर्धारित किया कि कौन से लोग गामा ट्यूबुलिन धुंधला करके सेन्ट्रोसोम समृद्ध भिन्नों के अनुरूप हैं। यहाँ हम प्रोटीन का एक उदाहरण है कि centrosome पर उनके संचय में परिवर्तन से गुजरना दिखाने के लिए, जैसे Actin और Arp2, जो पहले से सूचित किया गया है5.

Figure 1
चित्र 1 : IS के प्रति बवालों का ध्रुवीकरण| (ए) आईआईए1.6 बी कोशिकाओं में गोलगी उपकरण (राब6ए) और माइक्रोट्युबुल्स (जेड-टुबुलिन) का प्रतिरक्षण दाग बीसीआर-लिगंड+ (0, 30, 60 और 120 मिनट) या बीसीआर-लिगंड-मोद (120 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। ऐरोहेड्स सेंक्रोसोम का संकेत मिलता है। बीएफ - उज्ज्वल क्षेत्र. स्केल बार - 3 डिग्री मी(ख) योजना में यह दर्शाया गया है कि आईएस की ओर आर्गेनेल्स (सेन्ट्रोसोम या गोल्गी उपकरण) की ध्रुवता सूचकांक की गणना कैसे की जाए। एक ] कोशिका के केंद्र के बीच की दूरी (सीसी) organelle करने के लिए. ख ] सीसी से और मनका केंद्र (बीसी) से दूरी। (सी, डी) सक्रियण के विभिन्न समय बिंदुओं पर organelles के polarity अनुक्रमित दिखा प्रतिनिधि डॉट भूखंडों. प्रत्येक बिंदु एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है. (ई) बी कोशिकाओं में लाइसोसोम (लैम्प1) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला बीसीआर-लिगंड+ (0, 30, 60 और 120 मिनट) या बीसीआर-लिगंड-मोतियों (120 मि)। बीएफ - उज्ज्वल क्षेत्र. स्केल बार - 3 m. (F) योजना का प्रतिनिधित्व कैसे Lysosomes की ध्रुवता सूचकांक की गणना करने के लिए. एक $ सीसी के बीच की दूरी जन केंद्र (एमसी) के लिए. ख ] सीसी से ईसा पूर्व तक की दूरी। (जी) सक्रियण के विभिन्न समय बिंदुओं पर lysosomes के polarity अनुक्रमित दिखा प्रतिनिधि डॉट भूखंडों. प्रत्येक बिंदु एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है. सिडक के बाद परीक्षण के साथ 2 तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया था. SEM के साथ मतलब दिखाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : आईएस में लाइसोसोम का संचय| (क) बी कोशिकाओं में लाइसोसोम (लैम्प1) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग बीसीआर-लिगंड+ (0, 30, 60 और 120 मिनट) या बीसीआर-लिगंड-मोड्स (120 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। BF - उज्ज्वल क्षेत्र. स्केल बार - 3 डिग्री मी. (बी) योजना में दर्शाया गया है कि मनका और सिनैप्टिक क्षेत्र में लाइसोसोम जैसे ऑर्गेनेल्स के संचय की गणना कैसे की जाए। पूरे सेल (WCF), मनका फ्लोरोसेंट (बीएफ) और synaptic क्षेत्र फ्लोरोसेंट (एसएएफ) के फ्लोरोसेंट संकेत दिए हैं। (सी, डी) मनका और synaptic क्षेत्र में lysosomes के संचय के लिए प्रतिनिधि बार रेखांकन. N ] 1. 20 और सेल. सिडक के बाद परीक्षण के साथ 2 तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया था. SEM के साथ मतलब दिखाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : IS के गठन के दौरान सेंट्रोसोम पर एक्टिन का परिमाणीकरण। (क) बी कोशिकाओं में एक्टिन (फाल्लॉयडिन) और माइक्रोट्युब्यूल्स (जेड-टुबुलिन) का इम्यूनोफ्लोरेसन धुंधला बीसीआर-लिगंड+ (0 और 60 मिनट) या बीसीआर-लिगंड- मोती (0 और 60 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। तीर सिर सेंक्रोसोम का संकेत देते हैं। स्केल बार ] 3 डिग्री मी . (ख) योजना में यह दर्शाया गया है कि सेंट्रोसोम संबद्ध घटकों की भर्ती या कमी की गणना कैसे की जाए। सेन्ट्रोसोम क्षेत्र की गणना किसी त्रिज्या (X $उ) का उपयोग करके की जाती है जो अधिकतम फ्लोरोसेंट का कम से कम 70% बनाए रखता है। (सी) प्रतिनिधि डॉट प्लॉट्स सक्रिय (बीसीआर-लिगांड+) और गैर-सक्रिय (बीसीआर-लिगंड-) शर्तों के तहत सेन्ट्रोसोम में एक्टिन दिखा रहा है। N ] 1. 15 और कोशिकाओं. सिडक के बाद परीक्षण के साथ 2 तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया था. SEM के साथ मतलब दिखाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : synaptic इंटरफ़ेस पर सेलुलर घटकों का वितरण. (ए) एक्टिन (फालोजिन), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (सेक61ए), गोलगी उपकरण (केडीईएल-डीएन-जीएफपी के साथ एक नकारात्मक प्रमुख केडीएल रिसेप्टर, जो गोलगी में स्थानीयता) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। बी कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए बीसीआर-लिगन्ड + के साथ लेपित कवरलिपपर बीजित किया गया था। बीएफ - उज्ज्वल क्षेत्र। स्केल बार - 5 डिग्री मी (बी) योजना जिसमें सेल के प्रसार क्षेत्र और आईएस के केंद्र में ऑर्गेनाइन की भर्ती का निर्धारण कैसे किया जाता है। योजना में, CA cortical actin द्वारा सीमांकित सेल क्षेत्र इंगित करता है और सीसीए केंद्र सेल क्षेत्र इंगित करता है. (ग) गोलगी उपकरण और आईएस में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम वितरण, एक बार ग्राफ द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जहां एक मूल्य और 0 आईएस के केंद्र में एक संवर्धन को इंगित करता है और 0 परिधीय वितरण को इंगित करता है। N ] 1. 20 और सेल. SEM के साथ मतलब दिखाया जाता है. (घ) Actin (Phaloidin) के लिए लेबल बी कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों को अलग अलग समय बिंदुओं पर एजी लेपित coverslips पर सक्रिय (0, 30 और 60 मिनट), एक्सजेड और XY विमान दिखा. (म) ग्राफ में ई. (एफ) योजना में बी कोशिकाओं के प्रसार क्षेत्र को दर्शाने वाला ग्राफ जिसमें यह दर्शाया गया है कि विमान में रुचि के संकेत के वितरण का निर्धारण कैसे किया जाए तथा प्रति र्भुति अंश का आलेख क्या है। आयत IS इंटरफ़ेस इंगित करता है। (छ) फ्लोरोसेंट वितरण के प्रतिशत की एक रेखा आलेख द्वारा प्रदर्शित विमान के उस पार एक्टिन का वितरण बनाम प्रत्येक अंश। आयत IS इंटरफ़ेस का प्रतिनिधित्व करता है। N ] 1. 25 और सेल. SEM के साथ मतलब दिखाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : बी कोशिकाओं के सेंट्रोसोम समृद्ध अंश। ((२) सुक्रोज प्रवणता अतिकेन्द्रीकरण द्वारा सेन्ट्रोसोम-समृद्ध भिन्नों को प्राप्त करने के बारे में कार्यप्रवाह। (ख) आराम और सक्रिय बी कोशिकाओं (60 मिनट) से प्राप्त भिन्नों का इम्यूनोब्लॉट। सेन्ट्रोसोम समृद्ध अंशों का पता जेड-ट्यूबुलिन के साथ लेबलिंग द्वारा किया जाता है और डैश्ड आयत (अंश 6 से 8) के भीतर दर्शाया जाता है। सेन्ट्रोसोम संबद्ध प्रोटीन (Actin और Arp2) को सक्रिय करने और आराम की स्थिति में centrosome समृद्ध भागों में दिखाए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम अध्ययन करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन कैसे बी लिम्फोसाइटों एक IS के गठन को बढ़ावा देने के लिए उनके intracellular वास्तुकला को फिर से व्यवस्थित. इस अध्ययन में बी सेल सक्रियण के दौरान आर्गेनेल्स के इंट्रासेल्यूलर वितरण, जैसे सेन्ट्रोसोम, गोलगी उपकरण और लाइसोसोम ्स,और बी सेल सक्रियण के दौरान कैसे वे ध्रुवीकरण के लिए इमेजिंग तकनीकों का उपयोग शामिल है। इसके अतिरिक्त, हम बी सेल सक्रियण पर सेन्ट्रोसोम संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण का वर्णन.

बी कोशिकाओं में एक IS के गठन को बढ़ावा देने के लिए, हम स्थिर प्रतिजनों का इस्तेमाल किया (एंटीजन लेपित मोती) घुलनशील प्रतिरक्षा परिसरों के बजाय क्योंकि पूर्व एक असतत संपर्क साइट की स्थापना चलाता है जहां cytoskeleton पुनर्व्यवस्थापन और organelle ध्रुवीकरण का आसानी से अध्ययन किया जा सकता है। इमेजिंग बी सेल सक्रियण में एक महत्वपूर्ण पहलू नमूनों की तैयारी है. सभी छवि अधिग्रहण आदर्श एक 1:1 सेल प्राप्त करना चाहिए: मनका अनुपात, प्रतिजन संपर्क की एक अद्वितीय साइट के लिए organelles के ध्रुवीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए. हालांकि, कुछ मामलों में बी कोशिकाओं दो या दो से अधिक मोती पर कब्जा कर सकते हैं, जिससे यह मुश्किल प्रतिजन मुठभेड़ के एक एकल साइट का चयन करने के लिए कर रही है. मनका समुच्चय के गठन से बचने के लिए, उन्हें कोशिकाओं में जोड़ने से पहले अच्छी तरह से भंवर एंटीजन-संयोजित मोती के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसी प्रयोगों के लिए, हम परिमाणीकरण कोशिकाओं से को छोड़कर अनुशंसा करते हैं जो छवि विश्लेषण के दौरान गलत व्याख्याओं से बचने के लिए एक से अधिक मनका कैप्चर करते हैं। नमूनों की तैयारी में एक अन्य महत्वपूर्ण कदम निर्धारण/परमेबिलाइजेशन स्थिति है। उदाहरण के लिए, हम मेथनॉल के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग microtubule धुंधला और 4% phaloidin धुंधला के लिए पीएफए का अनुकूलन करने की सलाह देते हैं. जब एक साथ लेबलिंग actin cytoskeleton और microtubules, एक विकल्प के लिए एक LifeAct-GFP /RFP अभिव्यक्ति plasmid microtubule धुंधला के साथ संयोजन में कोशिकाओं transfecting द्वारा actin पूल लेबल हो सकता है. सेंट्रोसोम और अन्य इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स के ध्रुवीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला छवि अधिग्रहण एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है। हालांकि, विभिन्न z-प्लेन में एक सटीक परिमाणीकरण प्राप्त करने के लिए, उदाहरण के लिए प्रसार परख में, confocal माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है.

यहाँ वर्णित सेंट्रोसोम अलगाव प्रोटोकॉल के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम के लिए नमूने की एक उचित राशि प्राप्त करने के लिए इम्यूनोब्लॉट द्वारा प्रोटीन की मात्रा में सक्षम हो रहा है. यह देखते हुए कि बी कोशिकाओं में एक बड़ा नाभिक है और उनके कोशिकाद्रव्य उनके कुल कोशिका मात्रा का 30% से कम है, कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन की उच्च पैदावार प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस कारण से, हम सेंट्रोसोम अलगाव के लिए प्रत्येक सक्रियण समय बिंदु के लिए लगभग 20 x 106 B कक्षों का उपयोग करने की अनुशंसा करते हैं.

इन विधियों का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि प्रतिजन-संयोजित मनकों के साथ सक्रियण पर्यावरण की जटिलता जिसमें सतह tethered प्रतिजन ों विवो में बी कोशिकाओं के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं शामिल नहीं है. इस सीमा को अन्य सह-उत्तेजक कारकों के साथ संस्कृति या मोती के पूरक द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जैसे साइटोकिन्स और extracellular मैट्रिक्स के घटकों. हालांकि, यह सही रूप से परिणामों की व्याख्या करने के लिए इन मामलों में उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस काम में प्रस्तुत तरीकों का महत्व बी सेल प्रतिरक्षा synapse का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एकीकृत दृष्टिकोण पर निर्भर करता है: (1) organelles और उनके वितरण के ध्रुवीकरण और (2) centrosome पर प्रोटीन संरचना में परिवर्तन. एक significative विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की बड़ी संख्या और इस प्रक्रिया में उत्पन्न डेटा की बड़ी राशि के कारण, इस काम में प्रस्तुत विभिन्न परिमाणीकरण एल्गोरिदम सेल इमेजिंग के विश्लेषण की सुविधा. इसके अलावा, सेल ध्रुवीकरण के लिए इस्तेमाल एल्गोरिदम ImageJ में MACROS कार्यों द्वारा automatize करने के लिए आसान कर रहे हैं, जो दोहराए कार्यों को कम करने और समय बचाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है.

इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं कोशिकाओं के अन्य प्रकार है कि polarized phenotypes स्थापित करने के लिए एक निश्चित सेलुलर समारोह को पूरा करने के लिए extrapolated किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इन प्रोटोकॉल अन्य परख सहित द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, इस तरह के kinases या सेंट्रोसोम समृद्ध अंशों में proteases के रूप में जुड़े प्रोटीन की गतिविधि. कुल मिलाकर, इन अध्ययनों सेल संकेतन और आणविक रास्ते है कि सेल polarity की स्थापना को विनियमित में मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

M.-I.Y. FONDECYT #1180900 से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है. J.I., D.F. और J.L. Comisi-n Nacional de Ciencia y Tecnologa से फैलोशिप द्वारा समर्थित थे. हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के लिए Pontificia Universidad कैटेलिका डे चिली से डेविड Osorio को धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 148 सेल पोलरिटी लाइसोसोम साइटोस्केलेटन सेन्ट्रोसोम प्रतिरक्षा synapse बी लिम्फोसाइटों छवि विश्लेषण
प्रतिरक्षा Synapse गठन के दौरान बी कोशिकाओं में Organelle गतिशीलता का अध्ययन
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Ibañez-Vega, J., Fuentes, D., Lagos, J., Cancino, J., Yuseff, M. I. Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp. (148), e59621, doi:10.3791/59621 (2019).

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