Summary
Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.
Abstract
Die Erkennung von oberflächengebundenen Antigenen durch den B-Zell-Rezeptor (BCR) löst die Bildung einer Immunsynapse (IS) aus, bei der sowohl signalierte als auch Antigenaufnahme koordiniert werden. Die IS-Bildung beinhaltet eine dynamische Aktin-Umgestaltung, begleitet von der polarisierten Rekrutierung zur synaptischen Membran des Zentromes und der damit verbundenen intrazellulären Organellen wie Lysosomen und des Golgi-Apparats. Erste Stadien der Aktin-Umgestaltung ermöglichen es B-Zellen, ihre Zelloberfläche zu erhöhen und die Menge an Antigen-BCR-Komplexen zu maximieren, die an der Synapse gesammelt werden. Unter bestimmten Bedingungen, wenn B-Zellen Antigene erkennen, die mit starren Oberflächen verbunden sind, ist dieser Prozess mit der lokalen Rekrutierung und Sekretion von Lysosomen gekoppelt, die die Antigenextraktion erleichtern können. Aufgenommene Antigene werden in spezialisierte Endolysosome-Fächer zur Verarbeitung in Peptide verinnerlicht, die zur weiteren Darstellung von T-Helferzellen auf den Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC-II) geladen werden. Daher ist das Studium der Organellendynamik im Zusammenhang mit der Bildung eines IS entscheidend, um zu verstehen, wie B-Zellen aktiviert werden. In diesem Artikel werden wir sowohl bildgebende als auch eine biochemische Technik zur Untersuchung von Veränderungen in der intrazellulären Organellenpositionierung und Zytoskelett-Umlagerungen diskutieren, die mit der Bildung eines IS in B-Zellen verbunden sind.
Introduction
B-Lymphozyten sind ein wesentlicher Bestandteil des adaptiven Immunsystems, das für die Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Bedrohungen und eindringende Krankheitserreger verantwortlich ist. Die Effizienz der Antikörperproduktion wird durch die Fähigkeit von B-Zellen bestimmt, Antigene zu erfassen, zu verarbeiten und zu präsentieren, die entweder in einer löslichen oder oberflächengebundenen Form1,2angetroffen werden. Die Erkennung von Antigenen, die an der Oberfläche einer präsentierenden Zelle befestigt sind, durch die BCR führt zur Bildung eines engen interzellulären Kontakts, der ALS IS3,4bezeichnet wird. Innerhalb dieser dynamischen Plattform findet sowohl die BCR-abhängige downstream Signalisierung als auch die Internalisierung von Antigenen in Endolysosome-Fächer statt. Aufgenommene Antigene werden auf MHC-II-Molekülen verarbeitet und zusammengesetzt und anschließend T-Lymphozyten präsentiert. Produktive B-T-Wechselwirkungen, die als B-T-Zellkooperation bezeichnet werden, ermöglichen es B-Lymphozyten, die entsprechendenSignale zu empfangen, die ihre Differenzierung in Antikörper produzierende Plasmazellen oder Gedächtniszellen 8 fördern.
Zwei Mechanismen wurden an der Antigenextraktion durch B-Zellen beteiligt. Die erste stützt sich auf die Sekretion von Proteasen, die von Lysosomen stammen, die an der synaptischen Spalte5,6rekrutiert und fusioniert werden. Die zweite hängt von Myosin IIA-vermittelten Zugkräften ab, die die Invagination von Antigen-haltigen Membranen auslösen, die in Clathrin-beschichteten Gruben verinnerlicht sind7. Die Art der Antigenextraktion beruht auf den physikalischen Eigenschaften der Membran, in der Antigene gefunden werden. Dennoch durchlaufen B-Zellen in beiden Fällen zwei große Umgestaltungsereignisse: die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und die Polarisierung von Organellen zum IS. Actin-Zytoskelett-Remodellierung beinhaltet eine erste Ausbreitungsphase, in der aktinabhängige Vorsprünge an der synaptischen Membran die Oberfläche in Kontakt mit dem Antigen erhöhen. Es folgt eine Kontraktionsphase, in der BCRs, gekoppelt mit Antigenen, im Zentrum des IS durch die konzertierte Aktion von Molekularmotoren und Aktin-Zytoskelett-Remodeling8,9,10 konzentriert werden. 11. Die Polarisation von Organellen beruht auch auf der Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts. Zum Beispiel wird das Zentromat vom Kern entkoppelt, durch lokale Depolymerisation des assoziierten Aktins, die die Neupositionierung dieser Organelle zum IS5,12ermöglicht. In B-Zellen führt die Neupositionierung des Zentromes zu einem Zellpol (IS) die Lysosomenrekrutierung zur synaptischen Membran, die bei Derortion die Extraktion und/oder Verarbeitung von oberflächengebundenen Antigenen erleichtern kann6. Lysosomen, die beim IS rekrutiert werden, werden mit MHC-II angereichert, das die Bildung von Peptid-MHC-II-Komplexen in endosomalen Kompartimenten begünstigt, die den T-Zellen13präsentiert werden sollen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der Golgi-Apparat eng an den IS14rekrutiert wurde, was darauf hindeutet, dass Von Golgi abgeleitete Vesikel aus dem sekretoreichen Pfad an der Antigenextraktion und/oder -verarbeitung beteiligt sein könnten.
Insgesamt sind intrazelluläre Organelle und Zytoskelett-Umlagerungen in B-Zellen während der Synapsenbildung die wichtigsten Schritte, die eine effiziente Antigenerfassung und -verarbeitung ermöglichen, die für ihre weitere Aktivierung erforderlich sind. In dieser Arbeit führen wir detaillierte Protokolle zur Durchführung von Bildgebung und biochemischer Analyse in B-Zellen ein, um die intrazelluläre Remodellierung von Organellen im Zusammenhang mit der Bildung eines IS zu untersuchen. Diese Techniken umfassen: (i) Immunfluoreszenz und Bildanalyse von B-Zellen, die mit antigenbeschichteten Perlen aktiviert sind, und auf antigenbeschichteten Abdeckungen, die die Visualisierung und Quantifizierung intrazellulärer Komponenten ermöglichen, die zum IS mobilisiert werden und (ii ) Isolierung von zentromangereicherten Fraktionen in B-Zellen durch Ultrazentrifugation auf Saccharosegradienten, die die Identifizierung von Proteinen ermöglicht, die mit dem Zentromom assoziiert sind und potenziell an der Regulierung der Zellpolarität beteiligt sind.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit IIA1.6 B-Zellen durchgeführt.
1. B-Zell-Aktivierung mit antigenbeschichteten Perlen
- Herstellung von antigenbeschichteten Perlen
- Um B-Zellen zuaktivieren, verwenden Sie NH 2-Perlen, die kovalent mit Antigen (Ag-beschichtete Perlen) beschichtet sind, die mit 50 l (ca. 20 x 106 Perlen) von 3 'm NH 2-Perlen mit aktivierenden (BCR-Ligand+) oder nicht aktivierenden (BCR-Ligand-) Antigenen hergestellt werden.
- Für IIA1.6 B-Zellen verwenden Anti-IgG-F(ab')2 Fragment als BCR-ligand+ und anti-IgM-F(ab')2 oder Rinderserumalbumin (BSA) als BCR-Ligand-. Um primäre B-Zellen oder IgM+ B-Zelllinie zu aktivieren, verwenden Sie Anti-IgM-F(ab')2 als BCR-Ligand+ und BSA als BCR-Ligand-.
HINWEIS: Um die Bindung von Liganden an den Fc-Rezeptor zu vermeiden, verwenden Sie F(ab') oder F(ab')2 Antikörperfragmente anstelle von Antikörpern in voller Länge. - Um mit der Herstellung von Ag-beschichteten Perlen fortzufahren, legen Sie die Perlen in eiweißarme, bindende Mikrozentrifugenröhren, um die Erholung der Perlen während der Probenmanipulation zu maximieren. 1 ml 1x phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen, um Perlen und Zentrifugen bei 16.000 x g für 5 min zu waschen.
- Setzen Sie die Perlen mit 500 l 8% Glutaraldehyd aus, um die NH 2-Gruppen zu aktivieren und drehen Sie 4 h bei Raumtemperatur (RT).
VORSICHT: Die Glutaraldehyd-Stammlösung sollte nur in einer chemischen Rauchhaube verwendet werden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Materialsicherheitsdatenblatt (MSDS). - Zentrifugenperlen bei 16.000 x g für 5 min, entfernen Sie das Glutaraldehyd und waschen Sie die Perlen drei weitere Male mit 1 ml 1x 1x PBS.
VORSICHT: Die Glutaraldehydlösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden. - Setzen Sie die aktivierten Perlen in 100 l mit 1x PBS wieder auf. Die Probe kann in zwei eiweißarme Mikrozentrifugen-Röhren unterteilt werden: 50 l für den BCR-Ligand+ und 50 l für BCR-Ligand-.
- Zur Herstellung der Antigenlösung verwenden Sie zwei 2 ml eiweißarme, bindende Mikrozentrifugen-Röhrchen, die 100 g/ml Antigenlösung in 150 l PBS enthalten: Ein Rohr mit BCR-Ligand+ und ein anderes mit BCR-Ligand-.
- Fügen Sie jeder Tube, die 150 l Antigenlösung enthält, einen Wirbel mit 50 l aktivierten Perlenzusolutionen hinzuzufügen und sich über Nacht bei 4 °C zu drehen.
- Fügen Sie 500 l von 10 mg/ml BSA hinzu, um die verbleibenden reaktiven NH 2-Gruppen auf den Perlen zu blockieren und 1 h bei 4 °C zu drehen.
- Zentrifugieren Sie die Perlen bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen mit kalten 1x PBS drei weitere Male.
- Setzen Sie die aktivierten Perlen in 70 l mit 1x PBS wieder auf.
- Um die endgültige Konzentration von Ag-beschichteten Perlen zu bestimmen, verdünnen Sie ein kleines Volumen von Perlen in PBS (1:200) und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Dann bei 4 °C lagern, bis es verwendet wird.
HINWEIS: Ag-beschichtete Perlen sollten nicht mehr als 1 Monat gelagert werden.
- Herstellung von Poly-L-Lysin-Abdeckungen
- Vor dem B-Zell-Aktivierungstest mit Ag-beschichteten Perlen poly-L-Lysin-beschichtete Abdeckungen (PLL-Coverlips) zubereiten. Verwenden Sie ein 50 ml-Rohr mit 40 ml 0,01 % w/v PLL-Lösung und tauchen Sie die Abdeckungen mit 12 mm Durchmesser in die Lösung ein. Drehen Sie über Nacht bei RT.
- Die Abdeckungen mit 1x PBS waschen und auf einem 24-Well-Plattendeckel mit Paraffinfolie trocknen lassen. Fahren Sie mit der B-Zellenaktivierung fort.
- B-Zellaktivierung
- Um die B-Zellaktivierung mit Perlen zu starten, verdünnen Sie zunächst die IIA1.6 B-Zelllinie auf 1,5 x 106 Zellen/ml in CLICK-Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Alanin-L-Glutamin + 55 'M Beta-Mercaptoethanol + 1 mM Pyruvat + 100 U/mL Penicillin + 100 g/ml Streptomycin) + 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum [FBS]).
- Kombinieren Sie 100 l (150.000 Zellen) von IIA1.6 B-Zellen mit Ag-beschichteten Perlen im Verhältnis 1:1 in 0,6 ml-Röhren. Mit einem Wirbel und Samen vorsichtig auf PLL-Coverlips mischen. Inkubieren Sie für verschiedene Zeitpunkte in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C / 5% CO2). Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30, 60 und 120 min. Legen Sie die PLL-Abdeckungen für Zeit 0 in den 24-Well-Plattendeckel auf Eis. Fügen Sie die Zellen-Ag-beschichtete Perlenmischung und brüten für 5 min auf Eis.
HINWEIS: Es ist wichtig, durch Wirbel zu mischen, anstatt nach oben und unten zu pfeifen, da dies die Anzahl der Perlen in der Probe reduzieren könnte, aufgrund ihrer Ansammlung in der Kunststoffspitze der Pipette. Verwenden Sie Perlen, die mit BCR-Ligand- als Negativkontrolle für jeden Test beschichtet sind. Wir empfehlen, zuerst die längste Inkubationszeit und dann die folgenden Zeitpunkte zu aktivieren. Berechnen Sie Aktivierungsintervalle für Proben, sodass sie gleichzeitig fixiert werden können. - Fügen Sie jedem Deckelblatt 100 l kalte 1x PBS hinzu, um die Aktivierung zu stoppen und mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fortzufahren. Siehe Protokoll Abschnitt 3.
2. B-Zell-Aktivierung auf antigenbeschichteten Abdeckungen
-
Herstellung von antigenbeschichteten Abdeckungen
- Bereiten Sie vor der Aktivierung die Antigenlösung vor (1x PBS mit 10 g/ml BCR-Ligand+ und 0,5 g/ml Rattenanti-Maus-CD45R/B220).
HINWEIS: Erwägen Sie, die Abdeckungen am Tag vor dem Test vorzubereiten. B220 verbessert die B-Zellhaftung, jedoch reicht der BCR-Ligand+ aus, um die Streureaktion zu erzeugen. - Den 12-mm-Deckel auf einen mit Paraffinfolie überzogenen 24-Well-Plattendeckel auflegen, 40 L Antigenlösung auf jeden Deckelschlupf geben und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Versiegeln Sie die Platte, um eine Verdunstung der Antigenlösung zu vermeiden.
- Die Deckelmitlipse mit 1x PBS waschen und lufttrocken.
- Bereiten Sie vor der Aktivierung die Antigenlösung vor (1x PBS mit 10 g/ml BCR-Ligand+ und 0,5 g/ml Rattenanti-Maus-CD45R/B220).
-
B-Zellaktivierung
- Um die Aktivierung zu starten, verdünnen Sie IIA1.6 B-Zellen auf 1,5 x 106 Zellen/ml in CLICK medium + 5% FBS.
- Fügen Sie 100 l Zellen auf einen antigenbeschichteten Deckelschlupf (Ag-Coverslip) und aktivieren Sie für verschiedene Zeitpunkte in einem Zellinkubator bei 37 °C / 5% CO2. Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30 und 60 min.
HINWEIS: Wie in Abschnitt 1 empfehlen wir, mit dem längsten Aktivierungszeitpunkt zu beginnen, um alle Proben gleichzeitig zu fixieren. - Legen Sie für Zeit 0 den 24-Well-Plattendeckel mit dem Ag-Coverslip auf Eis und fügen Sie die Zellen hinzu. 5 min auf Eis inkubieren.
- Saugen Sie die Medien auf jedem Ag-Coverslip vorsichtig an und fügen Sie dann 100 l kalte 1x PBS hinzu, um die Aktivierung zu stoppen. Fahren Sie mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fort. Siehe Abschnitt 3.
3. Immunfluoreszenz
HINWEIS: Um eine Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit dem BCR von IIA 1.6 B-Zellen zu vermeiden, verwenden Sie keine von der Maus abgeleiteten primärantikörper.
- Entfernen Sie die 1x PBS und fahren Sie mit der Fixierung jedes Coverslips fort.
HINWEIS: Um zu entscheiden, welches Fixierungsmedium verwendet werden soll, überprüfen Sie das Datenblatt Antikörper/Farbstoff. Zum Beispiel für die Actin-Etikettierung durch Phalloidin verwenden Paraformaldehyd (PFA) Fixierungsmedium, und für die Zentromit-Etikettierung durch Pericentrin verwenden Methanol-Fixierung.- Fügen Sie 50 l 1x PBS hinzu, ergänzt mit 4% PFA, und brüten sie für 10 min bei RT.
VORSICHT: Formaldehyd ist giftig. Bitte lesen Sie die MsDS, bevor Sie mit dieser Chemikalie arbeiten. PFA-Lösungen sollten nur unter einer chemischen Dunstabzugshaube mit Handschuhen und Einer Schutzbrille hergestellt werden. PFA-Lösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden. - Alternativ können Sie 50 l kaltes Methanol hinzufügen und 20 min brüten.
- Fügen Sie 50 l 1x PBS hinzu, ergänzt mit 4% PFA, und brüten sie für 10 min bei RT.
- Dreimal mit 1x PBS waschen.
HINWEIS: Coverlips können an dieser Stelle maximal drei Tage lang bei 4 °C in 1x PBS gelagert werden. - Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie jedem Abdeckschein 50 l Blockierpuffer (2% BSA + 0,3 M Glycin in 1x PBS) hinzu. Bei RT für 10 min inkubieren.
- Saugen Sie vorsichtig und fügen Sie 50 l Permeabilisationspuffer (PB) (0,2% BSA + 0,05% Saponin in 1x PBS). Inkubieren bei RT für 20 min.
- Bereiten Sie die Antikörper oder Farbstoffe in PB vor (verwenden Sie 30 l pro Deckblatt) und inkubieren Sie bei RT 1 h oder über Nacht bei 4 °C. Weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien.
- Um das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) oder Dasomom zu kennzeichnen, verwenden Sie die folgenden Antikörper: Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Pericentrin (1:1000).
HINWEIS: Für die Zentromsomenbeschriftung können B-Zellen mit einem Centrin-GFP-Expressionsplasmid transfiziert werden. - Für die Kennzeichnung Golgi Geräte verwenden Anti-Rab6a (1:500).
HINWEIS: Es können auch andere Antikörper oder Farbstoffe verwendet werden. - Verwenden Sie für die Etikettierung von Lysosomen Anti-Lamp1 (1:200).
HINWEIS: Anti-H2-DM und Anti-MHC-II können auch verwendet werden, um Antigen-Verarbeitungsfächer15,16zu kennzeichnen. - Zur Kennzeichnung von endoplasmatischem Retikulum verwenden Sie Anti-Sec61a (1:500).
- Für Actin-Zytoskelett beachten Sie Folgendes: Polymerisiertes Actin kann durch Phalloidin konjugiert zu fluoreszierenden Farbstoffen visualisiert werden.
HINWEIS: B-Zellen, die mit einem LifeAct-GFP/RFP-Expressionsplasmid transfiziert werden, können auch verwendet werden, um Actin zu kennzeichnen.
- Um das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) oder Dasomom zu kennzeichnen, verwenden Sie die folgenden Antikörper: Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Pericentrin (1:1000).
- Waschen Sie die Abdeckungen dreimal mit PBS.
- Den sekundären Antikörper oder die Farbstoffe in PBS verdünnen (30 l pro Deckslip verwenden) und 1 h bei RT inkubieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Proben direkt dem Licht auszusetzen, um die Qualität des Fluoreszenzsignals zu erhalten. - Waschen Sie die Abdeckungen dreimal mit PBS.
- Entfernen Sie die PBS-Lösung aus den Abdeckungen.
- Fügen Sie dem Mikroskopschlitten 4 L Desageagenzien hinzu. Montieren Sie den Deckelrutsch auf die Rutsche mit der Zellseite nach unten. Lassen Sie die Dias 30 min bei 37 °C oder bei RT über Nacht trocknen.
HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung eines "Anti-Fade"-Montagereagenzes (siehe Materialtabelle). - Erfassen Sie Fluoreszenzbilder auf einem Konfokal- oder Epifluoreszenzmikroskop mit einem 60-fachen oder 100-fachen Öl-Tauchobjektiv. Berücksichtigen Sie für jede Erfassung das durchlichte Licht oder das helle Feld, um B-Zellen, die mit Perlen interagieren, leicht zu identifizieren.
HINWEIS: Nehmen Sie dreidimensionale (3D) Bilder auf, die die gesamte Zelle mit Z-Stacks abdecken. Wir empfehlen die Einnahme von 0,5 m dicken Stapeln, dies hängt jedoch vom Mikroskop ab.
4. Bildanalyse
HINWEIS: Die folgenden Algorithmen werden für ImageJ-Software beschrieben. Dies kann jedoch mit einer entsprechenden Software durchgeführt werden. Beachten Sie auch, dass wir bei allen Fluoreszenzintensitätsmessungen die integrierte Fluoreszenzdichte ("RawIntDen" in ImageJ) verwenden, da dieser Parameter die Gesamtmenge der Fluoreszenz in jedem Pixel des Bildes berücksichtigt und dabei die Fläche berücksichtigt.
- Analyse der Verteilung von Organellen in B-Zellen, die mit Ag-beschichteten Perlen aktiviert werden
HINWEIS: Um die Polarisation von Zellkomponenten zum IS zu quantifizieren, definieren wir einen beliebigen Wert als Maß für die Nähe zum IS. Der Index liegt zwischen -1 (antipolarisiert) und 1 (Vollständig polarisiert, Objekt auf der Perle), wie zuvor von Reversat et al. vorgestellt.12.- Schätzen Sie den Polaritätsindex für das Zentromat und das Golgi-Gerät (Abbildung 1B).
HINWEIS: Dieser Algorithmus kann für Organellen verwendet werden, die auf einen Punkt beschränkt sind.- Definieren Sie zunächst die zu analysierenden Perlen- und Zellbereiche mithilfe der Kreiswerkzeugauswahl, um die Grenzen beider zu begrenzen, und speichern Sie sie dann als Interessenbereiche (ROI). Siehe Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4.
- Bestimmen Sie das Zellenzentrum (CC) und das Perlenzentrum (BC) durch Ausführen von Analyze | Messen Sie an Zell- bzw. Perlenbereichen. X- und Y-Werte, die aus dem Ergebnisfenster abgerufen werden, bestimmen die Mittelkoordinaten.
- Bestimmen Sie manuell das Zentrum des Zentromats oder Golgi-Geräts (Organelle) mit der Punktwerkzeugauswahl in ImageJ und führen Sie Analyze | Maßnahme. X- und Y-Werte, die aus dem Ergebnisfenster abgerufen werden, bestimmen die Koordinaten.
- Zeichnen Sie dann einen Winkel von CC zu Organelle (a) und CC zu BC (b) mit der Winkelwerkzeugauswahl und führen Sie Analyze | Maßnahme. Der Winkelwert im Ergebnisfenster zeigt den Winkel ()zwischen beiden Vektoren (a und b).
- Berechnen Sie den Polaritätsindex mit der folgenden Formel:
- Schätzung des Polaritätsindex für Lysosomen (Abbildung 1F).
HINWEIS: Wir verwenden diesen Algorithmus, um die Polarität von Organellen zu analysieren, die eine dispersere Verteilung anzeigen, z. B. Lysosomen.- Definieren Sie die zu analysierenden Perlen- und Zellbereiche mithilfe der Kreiswerkzeugauswahl, um die Grenzen beider zu begrenzen und als ROI zu speichern. Sobald die Perlen- und Zellbereiche abgeschreckt wurden, stellen Sie den Fluoreszenzkanal ein und projizieren Sie das Bild in einen Z-Stack (Bild| Stapel | Z-Project [Sum Slices]), führen Sie dann Analysieren | Messen und extrahieren Sie die Massenmittelpunktkoordinaten (MC) (MX und MY) aus den Ergebnisfenstern.
- Wenden Sie den gleichen Algorithmus an, der erwähnt wurde, bevor Sie Organelle für MC ändern. Somit wird der Winkel (b) durch CC-MC (a) und CC-BC (b) definiert.
- Berechnen Sie die Polarität mit der folgenden Formel:
- Schätzung der Lysosomenrekrutierung in den synaptischen Bereich (Abbildung 2B).
HINWEIS: Dieser Algorithmus wird verwendet, um eine Organelle neben dem IS zu quantifizieren.- Sobald die Perlen- und Zellbereiche bestimmt wurden, bestimmen Sie den Winkel des Vektors zwischen CC und BC und drehen Sie das Bild dann, um einen 0°-Winkel zu erreichen.
- Stellen Sie den Fluoreszenzkanal ein und projizieren Sie das Bild in einen Z-Stack (Bild | Stapel | Z-Project [Sum slices]), eliminieren Sie alle Fluoreszenz, die außerhalb der Zelle und des Perlenbereichs zusammen fällt (bearbeiten | außen in ImageJ löschen).
- Zeichnen Sie mit der Auswahl des Rechteckwerkzeugs ein Rechteck neben der Perle und messen Sie die synaptische Flächenfluoreszenz (SAF). Dieses Rechteck ist ein Viertel der Zellenbreite.
- Wählen Sie das gesamte Bild aus, und führen Sie Analyze | Maßnahme zur Erzielung der gesamten Zellfluoreszenz (WCF).
- Berechnen Sie den Organellenfluoreszenzprozentsatz neben dem IS mit der folgenden Formel:
- Quantifizieren Sie die Rekrutierung von zellulären Komponenten zum Zentromom.
HINWEIS: Dieser Algorithmus, angepasst von Obino et al.5, wird verwendet, um die Anreicherung von Organellen im Zentromatbereich zu quantifizieren. Kurz gesagt betrachten wir den Zentromsomenbereich als den Bereich, in dem die zentromassoziierte Organellefluoreszenz konstant bleibt oder über 70% im Fluoreszenz-/Radiusdiagramm. Es ist wichtig, diesen Parameter unter Ruhebedingungen festzulegen, da sich dieser Radius bei der Aktivierung ändern kann.- Sobald Perlen- und Zellbereiche bestimmt wurden, definieren Sie die Lokalisierung des Zentromes mit der Punktwerkzeugauswahl (Abbildung 3B).
- Bestimmen Sie zunächst die maximale Fläche um das Zentrom, die quantifizierbar ist, indem Sie einen Kreis mit einem Radius von 3 m um das Zentromähnlich zeichnen.
- Verwenden Sie das ImageJ-Plugin Radial Profile, das die Fluoreszenz in konzentrischen Kreisen misst und ein Fluoreszenz-/Radiusdiagramm anzeigt.
- Identifizieren Sie den maximalen Radius, innerhalb deses mindestens 70 % der Fluoreszenzintensität beibehalten wird.
- Berechnen Sie das Fluoreszenzdichteverhältnis nach folgender Formel:
=
ANMERKUNG: Das Fluoreszenzdichteverhältnis gibt die Konzentration einer Organelle am Zentromims im Vergleich zu ihrer Verteilung in der gesamten Zelle an.
- Schätzen Sie den Polaritätsindex für das Zentromat und das Golgi-Gerät (Abbildung 1B).
- Analyse der Zellausbreitung und -verteilung von Organellen in B-Zellen, die auf Ag-Coverlips aktiviert sind
- Schätzung der Organellenverteilung am IS (Abbildung 4B).
HINWEIS: Dieser Algorithmus ermöglicht die Quantifizierung der XY-Verteilung von Organellen und deren Konzentration im Zentrum des IS. Wir definieren ein Verhältnis der Fluoreszenzdichte zwischen dem zentralen und dem gesamten synaptischen Bereich. Die erhaltenen Werte können von negativ bis positiv variieren, was auf eine periphere bzw. zentrale Verteilung der Organelle hindeutet.- Bestimmen Sie das Segment, in dem die Zelle mit der Abdeckung in Kontakt steht.
HINWEIS: Um die Zellgrenzen abzugrenzen, kann man die Plasmamembran oder den Aktin kennzeichnen, der in der Peripherie des IS angereichert ist. - Ändern Sie den Typ des Slices in 8-Bit, dann binarisieren (Prozess | Binär | Make Binary) und verbinden Sie die nächsten Außenseiterpunkte Prozess | Binär | umriß. Begrenzen Sie die Grenzen des Zellenbereichs (CA) mithilfe der Polygonwerkzeugauswahl.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nützlich, um den Kontrast der Zellgrenzen zu erhöhen und die Identifizierung zu erleichtern. An dieser Stelle ist es auch möglich, das Analyse-Partikel-Plugin von ImageJ anzuwenden, um die Zertifizierungsstelle automatisch zu bestimmen. Andere Zellen im gleichen Feld können jedoch die Ergebnisse stören. - Nehmen Sie CA-Parameter (Höhe und Breite) und begrenzen Sie einen zentralen abgerundeten Bereich, der durch ein Viertel der Höhen- und Breitenwerte von den Grenzen getrennt ist, diesen Bereich als Zellenmittelpunktbereich (Cell Center Area, CCA) an.
- Berechnen Sie die Fluoreszenzdichteverteilung in der Mitte des IS mit der folgenden Formel:
- Bestimmen Sie das Segment, in dem die Zelle mit der Abdeckung in Kontakt steht.
- Messen der Organellenverteilung in Z-Ebenen (Abbildung 4C).
HINWEIS: Diese Analyse bestimmt die allgemeine Verteilung der Organelle-Fluoreszenz über Z-Ebenen von B-Zellen, die auf Ag-Coverlips aktiviert sind, und zeigt den Prozentsatz der Fluoreszenz pro Z-Fraktion.- Um die Fluoreszenzverteilung in Z zu quantifizieren, bestimmen Sie zunächst die Ebene des IS, in der die Zelle mit dem Ag-Coverslip in Kontakt steht, und dann die Ebene, die der oberen Grenze der Zelle entspricht.
- Zeichnen Sie eine Linie über die Zellenmitte.
- Schneiden Sie das Bild in Z (Bild| Stapel | Reslice), um ein XZ-Bild zu erhalten.
- Messen Sie die Höhe und teilen Sie das XZ-Bild in 10 aufeinander folgende Rechtecke der gleichen Höhe (Z-Fraktion) von unten (IS-Schnittstelle) nach oben (obere Seite der Zelle) und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal in jedem.
- Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität jeder Z-Fraktion um die Summe der Gesamtfluoreszenz der 10 Fraktionen.
- Zeichnen Sie den Prozentsatz der Fluoreszenzintensität pro Z-Anteil der Zelle.
- Schätzung der Organellenverteilung am IS (Abbildung 4B).
=
5. Isolierung der zentromangereicherten Fraktion von ruhenden und aktivierten B-Zellen
HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen während des Experiments bei 4 °C, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Dieses Protokoll wurde von früheren Arbeiten17,18angepasst.
- Aktivieren Sie 2 x 107 B Zellen mit Ag-beschichteten Perlen in 2 ml KLICKmedium + 2% hitzeinaktivierte FBS (Verhältnis 1:1). Betrachten Sie nicht aktivierte B-Zellen als ruhende B-Zellen.
- Cytochalasin D (2 m) und Nocodazol (0,2 m) hinzufügen und 1 h bei 37 °C brüten.
HINWEIS: Diese Medikamente werden verwendet, um das Zentromos sanft vom Kern zu lösen, indem Actin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli depolymerisiert werden, um eine nukleare Kontamination zu vermeiden. - Waschen Sie jede Probe mit 5 ml kaltem 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) und dann mit 1 ml 0,1x TBS, ergänzt mit 8% Saccharose.
- Resuspend the cells with 150 'L of centrosome lysis buffer (1 mM HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2, 0.1% beta-Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) oder Proteasehemmer-Cocktail) und Pipette bis zur Viskosität abnimmt, was darauf hinweist, dass die Zelllyse in der Probe identifiziert wird. Legen Sie die Probe in ein 1,5 ml Rohr.
- Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Organellen vom Zellkern zu trennen.
- Den Überstand vorsichtig wiederherstellen und auf ein 1,5 ml-Rohr mit 300 l Gradientenpuffer (GB) (10 mM PIPES pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-Mercaptoethanol) mit 60% Saccharose legen.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um die Zentromys in der 60%igen Saccharosefraktion zu konzentrieren.
- In der Zwischenzeit bereiten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten in 2 ml Ultrazentrifugenrohren vor, indem Sie 450 l GB + 70 % Saccharose mit 270 l GB + 50 % Saccharose und dann 270 l GB + 40 % Saccharose überlagern.
- Nach der ersten Zentrifugation (zentromkonzentrierte Fraktion) den oberen Bruch (weniger dichter Teil) entsorgen, bis die Schnittstelle erreicht ist, und wirbeln Sie die verbleibende Probe im Rohr. Dann überlagern Sie auf dem diskontinuierlichen Gradienten, der zuvor mit der zentromigen angereicherten Probe vorbereitet wurde.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören, alle Pipettiervorgänge müssen sorgfältig durchgeführt werden. - Zentrifuge bei 40.000 x g für 1 h bei 4 °C bei minimaler Beschleunigung und mit absetzender Zentrifugebremse, um eine Störung des Gefälles zu vermeiden.
- Sammeln Sie 12 Fraktionen von 100 l in separate Röhren, beginnend von oben.
- Identifizieren Sie die zentromisch angereicherten Fraktionen durch Immunoblot unter Verwendung von S-Tubulin als Zentromit-Marker.
HINWEIS: Wir finden in der Regel zentromangereicherte Extrakte zwischen den Fraktionen 6 und 8.
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Representative Results
Der vorliegende Artikel zeigt, wie B-Zellen mit immobilisiertem Antigen auf Perlen oder Coverlips aktiviert werden können, um die Bildung eines IS zu induzieren. Wir liefern Informationen darüber, wie die Polarisation verschiedener Organellen durch Immunfluoreszenz identifiziert und quantifiziert werden kann und wie Proteine charakterisiert werden können, die dynamische Veränderungen in ihrer Assoziation zum Zentromat erfahren, das mit hilfe eines biochemischen Ansatz.
Die Bildgebung von B-Zellen durch Immunfluoreszenz ermöglicht es uns, die Dynamik von Organellen wie dem Zentromat, Demgonom und Densosomen zu verfolgen, die bei der Aktivierung der B-Zelle zum IS rekrutiert werden. Man kann quantitative Parameter erhalten, um die Polarisation dieser Organellen mit dem IS zu messen und sie unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen. Wie wir in Abbildung 1Azeigen, werden der Centrosome und der Golgi-Apparat nach B-Zellaktivierung an den IS rekrutiert. Die Rekrutierung wurde nicht in B-Zellen beobachtet, die mit BCR-Ligand stimuliert wurden- was darauf hindeutet, dass BCR-Engagement erforderlich ist, um das Zentromat und den Golgi-Apparat zum IS zu mobilisieren (Abbildung 1A). Um einen Polaritätsindex für jede Organelle zu erhalten, als Messung ihrer Nähe zum IS, haben wir drei Merkmale berücksichtigt: den Abstand zwischen der Organelle und dem Zentrum der Zelle, den Abstand zwischen dem Perlenzentrum und dem Zellzentrum und den Winkel zwischen diesen zwei Vektoren (Abbildung 1B). Dieser Index liegt zwischen -1 (antipolarisiert) und 1 (vollständig polarisiert, Objekt auf der Perle). Abbildung 1C und 1D zeigen Diagramme, in denen Polaritätsindizes jeder Organelle im Vergleich zur Aktivierungszeit dargestellt werden. In Übereinstimmung mit der Immunfluoreszenzfärbung zeigen sowohl das Zentromat als auch der Golgi-Apparat positivere Polaritätsindizes bei längeren Aktivierungszeitpunkten an, was widerspiegelt, wie sie nach und nach zum IS rekrutiert werden. Dieser Algorithmus ist für Organellen anwendbar, die auf einen Punkt beschränkt sind.
Zusätzlich quantifizierten wir die Polarisation von Organellen, die eine dispergierte Verteilung anzeigen, wie Z. Lysosomen (Abbildung 1E), indem wir denselben zuvor erwähnten Algorithmus anwenden, aber die Punktkoordinate durch die Massenmittelpunktkoordinaten von Lysosomen (Abbildung 1F). Wir können beobachten, dass die Polaritätsindizes von Lysosome-Pools bei Aktivierung positivere Werte erreichen, was darauf hindeutet, dass die Lysosomen bei Der B-Zellaktivierung zur Synapse mobilisiert werden (Abbildung 1G).
Wir haben auch zwei Algorithmen definiert, um Organellen zu bestimmen, die in Kontakt mit der synaptischen Schnittstelle (Perle) und der Menge der Organellen in der Nähe der Synapse stehen, aber nicht unbedingt in Kontakt. Wie wir in Abbildung 2zeigen, quantifizierten wir Lysosomen, die mit der synaptischen Schnittstelle in Kontakt treten (Abbildung 2A), indem wir das LAMP-1-Signal am Perlenbereich durch die Gesamtfluoreszenz in der Zelle plus die Perle dividierten (Abbildung 2B). Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass der Durchmesser der Perlenfläche die Bereiche der erhaltenen Prozentsätze bestimmt. In der dargestellten Quantifizierung (Abbildung 2B) zeichnen wir z. B. einen Kreis mit einem Durchmesser von 3 m, um die Fluoreszenz an der Perle zu messen, was ein restriktiver Parameter unter Berücksichtigung der Perlengröße (3 m) ist. Mit diesem Parameter zeigen die Ergebnisse, dass Lysosomen nach und nach an die synaptische Schnittstelle bei der Aktivierung der B-Zelle rekrutiert werden und 10-15% der Gesamtmasse erreichen (Abbildung 2C). Ein weiterer gezeigter Ansatz ist die Quantifizierung von Lysosomen in den synaptischen Bereich. Abbildung 2D zeigt, dass Lysosomen sich schrittweise bis zu 25 % ihrer Lysosomen beim IS ansammeln. Insgesamt kann man durch die Durchführung beider Analysearten die Polarisation und das Andocken von Organellen am IS bewerten.
Während der Aktivierung der B-Zellen wurden Veränderungen im Pool der zentromomassoziierten Proteine dokumentiert5. Zum Beispiel ist eines dieser Proteine, das ihre Assoziation am Centrosome während der B-Zellaktivierung ändert, Actin. In diesem Fall wird Actin innerhalb dieser Region erschöpft, was es dem Zentromom ermöglicht, sich vom Kern zu lösen und seine Polarisation zum IS5zu fördern. Hier stellen wir die Quantifizierung von Actin am Centrosome vor und wie es bei der Aktivierung der B-Zelle erschöpft ist (Abbildung 3). Um den Zentromitbereich zu definieren, der zur Quantifizierung des assoziierten Aktins verwendet wird, haben wir die Fluoreszenzintensität dieses Etiketts in konzentrischen Kreisen gemessen, die das Zentromum umgeben. Der Radius wurde auf der Grundlage des Punktes definiert, an dem mindestens 70 % der Fluoreszenzintensität des Etiketts beibehalten werden (Abbildung 3B). Mit diesem Ansatz kann man die Abnahme der Aktindichte am Zentromat bei der Aktivierung der B-Zelle quantifizieren, wie in Abbildung 3Cdargestellt.
Um eine größere Auflösung bei der Verteilung von Organellen an der IS-Schnittstelle zu erreichen, aktivierten wir B-Zellen auf antigenbeschichteten Coverlips, Etikettierungsaktivin, Golgi-Apparat und endoplasmatischem Retikulum (Abbildung 4A). Die Verteilung der Organellen am IS kann durch Tauchen des synaptischen Bereichs in einem zentralen und peripheren Bereich unter Anwendung eines in Abbildung 4Bdargestellten Kriteriums durchgeführt werden. Dies basierte auf früheren Arbeiten, die zeigten, dass sich BBCR in diesem zentralen Bereich sammeln, was höchstwahrscheinlich dem zentralen supramolekularen Aktivierungskomplex (cSMAC)10,19entspricht. Abbildung 4A zeigt, dass organelles, die zum IS rekrutiert wurden, wie der Golgi-Apparat und das endoplasmatische Retikulum entgegengesetzte Verteilungen aufweisen. Tatsächlich korrelieren ihre Verteilungsindizes mit ihrer Immunfluoreszenzfärbung, die in Abbildung 4Cdargestellt ist. Der Golgi-Apparat zeigt einen positiven Wert, was bedeutet, dass er im Zentrum des IS konzentriert ist, während das endoplasmatische Retikulum negative Werte zeigt, was bedeutet, dass es hauptsächlich in der peripheren Region des IS lokalisiert ist. Zusätzlich ist es möglich, die Werte des zuvor ermittelten synaptischen Bereichs zu nehmen, um die Streufläche während der B-Zellaktivierung zu messen, wie in den Abbildungen 4D und 4Edargestellt ist. Diese Ergebnisse zeigen eine Zunahme des Streubereichs bei der Aktivierung der B-Zelle, wie zuvor beschrieben10,20.
Wie im Perlentest können wir die Verteilung der Organellen in Richtung der Immunsynapse bestimmen, indem wir die XZ-Bilder von B-Zellen, die auf antigenbeschichteten Abdeckungen aktiviert sind, und die Organellefluoreszenz über die Z-Dimension messen (Abbildung 4F). Die Fluoreszenzintensität von Aktin in der Z-Ebene wurde gemessen, wie sie in der XZ-Ebene in Abbildung 4Fdargestellt ist, wo eine fortschreitende Anreicherung von Aktin an der synaptischen Schnittstelle (Fraktionen 1 und 2) beobachtet werden kann (Abbildung 4G).
Zusätzlich zur B-Zell-Bildgebungsanalyse führten wir die Isolierung von zentromsoso-angereicherten Fraktionen durch, um zentromomassoziierte Proteine zu quantifizieren (Abbildung 5A). Dieser Ansatz kann wichtig sein, um die Untersuchung der IS-Bildung in B-Zellen zu ergänzen, da das Zentromus zur synaptischen Membran polarisiert und nachweislich den Lysosomenhandel koordiniert, der an der Antigenextraktion und -darstellung beteiligt ist21. Diese Methode wurde zuvor mit großen Mengen von Zellen (1 x 109 Zellen)17,18 beschrieben, aber wir haben eine vereinfachte Version standardisiert, die eine reduzierte Menge von Zellen verwendet und mit weniger Volumen durchgeführt werden kann Ultrazentrifugenrohre (2-3 ml). Wie wir in Abbildung 5Bzeigen, analysierten wir verschiedene Zellfraktionen durch Immunoblotting und ermittelten, welche den zentromreichen Fraktionen entsprechen, durch Gamma-Tubulinfärbung. Hier zeigen wir ein Beispiel für Proteine, die Veränderungen in ihrer Akkumulation am Zentromom erfahren, wie Actin und Arp2, die zuvor 5 berichtet wurden.
Abbildung 1 : Polarisierung der Organellen gegenüber dem IS. (A) Immunfluoreszenzfärbung des Golgi-Apparates (Rab6a) und der Mikrotubuli (-Tubulin) in IIA1.6 B-Zellen, die mit BCR-Ligand+ (0, 30, 60 und 120 min) oder BCR-Ligand-Perlen (120 min) inkubiert werden. Pfeilspitzen zeigen das Zentroma. BF = Helles Feld. Skala bar = 3 m. (B) Schema, das darstellt, wie der Polaritätsindex von Organellen (Zentromoder Golgi-Apparat) gegenüber dem IS berechnet wird. a = Abstand zwischen der Mitte der Zelle (CC) zur Organelle. b = Abstand vom CC und zum Perlenzentrum (BC). (C, D) Repräsentative Punktdiagramme, die Polaritätsindizes von Organellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Aktivierung anzeigen. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar. (E) Immunfluoreszenzfärbung von Lysosomen (Lamp1) in B-Zellen, die mit BCR-Ligand+ (0, 30, 60 und 120 min) oder BCR-Ligand-Perlen (120 min) inkubiert werden. BF = Helles Feld. Skalenbalken = 3 m (F)Schema, das darstellt, wie der Polaritätsindex von Lysosomen berechnet wird. a = Abstand zwischen CC und dem Massenzentrum (MC). b = Abstand von CC zu BC. (G) Repräsentative Punktdiagramme, die Polaritätsindizes von Lysosomen zu verschiedenen Zeitpunkten der Aktivierung anzeigen. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar. 2-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-Test wurde durchgeführt. Mittel mit SEM werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Akkumulation von Lysosomen beim IS. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Lysosomen (Lamp1) in B-Zellen, die mit BCR-Ligand+ (0, 30, 60 und 120 min) oder BCR-Ligand-Perlen (120 min) inkubiert werden. BF = helles Feld. Skala bar = 3 m. (B) Schema, das darstellt, wie die Ansammlung von Organellen wie Lysosomen an der Perle und dem synaptischen Bereich berechnet wird. Fluoreszenz der gesamten Zelle (WCF), Der Perlenfluoreszenz (BF) und der synaptischen Bereichsfluoreszenz (SAF) sind indiziert. (C, D) Repräsentative Balkendiagramme für die Anhäufung von Lysosomen an der Perle und im synaptischen Bereich. N = 1. 20 > Zellen. 2-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-Test wurde durchgeführt. Mittel mit SEM werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Quantifizierung von Aktin am Zentrom während der IS-Bildung. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Actin (Phalloidin) und Mikrotubuli (-Tubulin) in B-Zellen, die mit BCR-Ligand+ (0 und 60 min) oder BCR-Ligand-Perlen (0 und 60 min) inkubiert werden. Pfeilspitzen zeigen das Zentroman. Maßstabsbalken = 3 m (B) Schema, das darstellt, wie die Rekrutierung oder Erschöpfung der Centrosome-assoziierten Komponenten berechnet wird. Die Zentromsomenfläche wird anhand eines Radius (X m) berechnet, der mindestens 70 % der maximalen Fluoreszenz beibehält. (C) Repräsentative Punktdiagramme, die Aktin am Zentrom unter aktivierenden (BCR-Ligand+) und nicht aktivierenden (BCR-Ligand-) Bedingungen zeigen. N = 1. 15 > Zellen. 2-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-Test wurde durchgeführt. Mittel mit SEM werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Verteilung der zellulären Komponenten an der synaptischen Schnittstelle. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Actin (Phalloidin), Endoplasmatisches Retikulum (Sec61a), Golgi-Apparat (transfiziert mit einem KDELR-DN-GFP eine negative Dominante des KDEL-Rezeptors, die im Golgi lokalisiert). B-Zellen wurden auf Abdeckungen gesät, die mit einem BCR-Ligand+ für 60 min beschichtet waren. BF = helles Feld. Scale bar = 5 m. (B) Schema, das darstellt, wie der Verbreitungsbereich der Zelle und die Rekrutierung von Organellen im Zentrum des IS bestimmt werden. Im Schema gibt CA den zellbegrenzten Zellbereich an, der durch kortikales Aktin begrenzt ist, und CCA gibt den mittleren Zellbereich an. (C) Golgi-Apparat und endoplasmatische Retikulumverteilung am IS, dargestellt durch ein Balkendiagramm, in dem ein Wert >0 eine Anreicherung in der Mitte des IS und < 0 auf eine periphere Verteilung hinweist. N = 1. 20 > Zellen. Mittel mit SEM werden angezeigt. (D) Repräsentative Bilder von B-Zellen, die für Actin (Phalloidin) gekennzeichnet sind und zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 30 und 60 min) auf Ag-beschichteten Abdeckungen aktiviert sind und die XZ- und XY-Ebene zeigen. (E) Diagramm, das die Verbreitungsfläche von B-Zellen in E. (F) Schema zeigt, wie die Verteilung des Interessessignals in der Z-Ebene und die Parzelle pro Z-Fraktion zu bestimmen ist. Das Rechteck zeigt die IS-Schnittstelle an. (G) Verteilung von Aktin über die Z-Ebene, dargestellt durch ein Liniendiagramm des Prozentsatzes der Fluoreszenzverteilung gegenüber jeder Z-Fraktion. Das Rechteck stellt die IS-Schnittstelle dar. N = 1. 25 > Zellen. Mittel mit SEM werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Centrosome angereicherte Fraktionen von B-Zellen. (A) Workflow zur Gewinnung von zentromangereicherten Fraktionen durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation. (B) Immunoblot von Fraktionen aus ruhenden und aktivierten B-Zellen (60 min). Centrosome-reiche Fraktionen werden durch Beschriftung mit dem S-Tubulin erkannt und innerhalb des gestrichelten Rechtecks (Fraktion 6 bis 8) angezeigt. Centrosome assoziierte Proteine (Actin und Arp2) werden in zentromigen-reichen Fraktionen in aktivierungs- und Ruhebedingungen gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben eine umfassende Methode, um zu untersuchen, wie B-Lymphozyten ihre intrazelluläre Architektur neu organisieren, um die Bildung eines IS zu fördern. Diese Studie umfasst den Einsatz von bildgebenden Verfahren zur Quantifizierung der intrazellulären Verteilung von Organellen, wie Zentrom, Golgi-Apparat und Lysosomen während der B-Zellaktivierung, und wie sie zum IS polarisieren. Zusätzlich beschreiben wir einen biochemischen Ansatz zur Untersuchung von Veränderungen in der Zentromsomenzusammensetzung bei der Aktivierung von B-Zellen.
Um die Bildung eines IS in B-Zellen zu fördern, verwendeten wir immobilisierte Antigene (antigenbeschichtete Perlen) anstelle von löslichen Immunkomplexen, da erstere die Einrichtung einer diskreten Kontaktstelle auslöst, an der Zytoskelett-Umlagerungen und Organellen Polarisation leicht untersucht werden kann. Ein kritischer Aspekt bei der bildgebenden B-Zellaktivierung ist die Vorbereitung der Proben. Alle Bildaufnahmeen sollten idealerweise ein 1:1-Zell: Perlenverhältnis erhalten, um die Polarisation von Organellen zu einem einzigartigen Ort des Antigenkontakts zu quantifizieren. In einigen Fällen können B-Zellen jedoch zwei oder mehr Perlen erfassen, wodurch es schwierig wird, einen einzigen Ort der Antigenbegegnung zu wählen. Um die Bildung von Perlenaggregaten zu vermeiden, ist es wichtig, Antigen-konjugierte Perlen gründlich zu wirbeln, bevor sie zu den Zellen hinzugefügt werden. Darüber hinaus empfehlen wir für Immunfluoreszenzexperimente, Zellen, die mehr als eine Perle aufnehmen, von Quantifizierungszellen auszuschließen, um Fehlinterpretationen bei der Bildanalyse zu vermeiden. Ein weiterer kritischer Schritt bei der Probenvorbereitung ist die Fixierungs-/Permeabilisierungsbedingung. Zum Beispiel empfehlen wir, Zellen mit Methanol zu fixieren, um die Mikrotubulifärbung zu optimieren, und 4% PFA für die Phalloidin-Färbung. Bei der gleichzeitigen Kennzeichnung von Aktin-Zytoskelett und Mikrotubuli kann eine Alternative sein, den Actin-Pool durch Transfizieren von Zellen mit einem LifeAct-GFP/RFP-Expressionsplasmid in Kombination mit Mikrotubuli-Färbung zu kennzeichnen. Die Bildaufnahme zur Quantifizierung der Polarisation des Centrosomes und anderer intrazellulärer Organellen kann mit einem Epifluoreszenzmikroskop durchgeführt werden. Um jedoch eine genaue Quantifizierung an verschiedenen Z-Ebenen, z.B. im Streutest, zu erhalten, ist eine konfokale Mikroskopie erforderlich.
Für das hier beschriebene Zentromit-Isolationsprotokoll besteht ein kritischer Schritt darin, eine angemessene Menge an Proben zu erhalten, um Proteine per Immunoblot quantifizieren zu können. Da B-Zellen einen großen Kern haben und ihr Zytoplasma weniger als 30% ihres gesamten Zellvolumens beträgt, kann es eine Herausforderung sein, höhere Erträge an zytoplasmatischen Proteinen zu erhalten. Aus diesem Grund empfehlen wir die Verwendung von ca. 20 x 106 B Zellen für jeden Aktivierungszeitpunkt für die Zentromatisolation.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Methoden besteht darin, dass die Aktivierung mit antigenkonjugierten Perlen nicht die Komplexität der Umgebung umfasst, in der oberflächengebundene Antigene B-Zellen in vivo präsentiert werden. Diese Einschränkung kann durch die Ergänzung der Kultur oder Perlen mit anderen kostimulierenden Faktoren, wie Zytokine und Komponenten der extrazellulären Matrix, behoben werden. Es ist jedoch von entscheidender Bedeutung, in diesen Fällen die entsprechenden Kontrollen zu verwenden, um die Ergebnisse richtig zu interpretieren.
Die Bedeutung der in dieser Arbeit vorgestellten Methoden beruht auf dem integrierten Ansatz zur Untersuchung der Immunsynapse der B-Zell-Zelle: (1) die Polarisation von Organellen und deren Verteilung und (2) die Veränderungen der Proteinzusammensetzung am Zentromom. Aufgrund der großen Anzahl von Zellen, die für eine signifikante Analyse erforderlich sind, und der großen Menge an Daten, die in diesem Prozess generiert werden, erleichtern die verschiedenen Quantifizierungsalgorithmen, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, die Analyse der Zellbildgebung. Darüber hinaus sind die Algorithmen, die für die Zellpolarisation verwendet werden, einfach durch MACROS-Funktionen in ImageJ zu automatisieren, was ein nützliches Werkzeug ist, um sich wiederholende Aufgaben zu verringern und Zeit zu sparen.
Diese experimentellen Verfahren können auf andere Zelltypen extrapoliert werden, die polarisierte Phänotypen etablieren, um eine bestimmte zelluläre Funktion zu erfüllen. Darüber hinaus können diese Protokolle optimiert werden, indem andere Assays aufgenommen werden, z. B. die Aktivität der zugehörigen Proteine wie Kiinasen oder Proteasen in Mit dem Centrosome angereicherten Fraktionen. Insgesamt können diese Studien mechanistische Einblicke in Zellsignalisierung und molekulare Pfade liefern, die die Etablierung der Zellpolarität regulieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
M.-I.Y. wird durch ein Forschungsstipendium von FONDECYT #1180900 unterstützt. J.I., D.F. und J.L. wurden durch Stipendien der Comisién Nacional de Ciencia y Tecnologa unterstützt. Wir danken David Osorio von der Pontificia Universidad Catélica de Chile für die Videoaufnahme und -bearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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