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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59621
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 1
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián
* These authors contributed equally

Summary

Nisto nós descrevemos duas aproximações para caracterizar eventos da polarização da pilha em linfócitos de B durante a formação de um IS. O primeiro, envolve a quantificação do recrutamento organela e rearranjos de citoesqueleto na membrana sináptica. A segunda é uma abordagem bioquímica, para caracterizar as mudanças na composição do centrosome, que sofre polarização para a sinapse imune.

Abstract

O reconhecimento de antígenos superfície-tethered pelo receptor da pilha de B (BCR) desencadeia a formação de um sinapse imune (is), onde a sinalização e a captação do antígeno são coordenadas. A formação do is envolve a remodelação dinâmica do actina acompanhada do recrutamento polarizado à membrana sináptica do centrosome e das organelas intracelular associadas tais como lisossomos e o instrumento de Golgi. Os estágios iniciais da remodelação do actina permitem que as pilhas de B aumentem sua superfície da pilha e maximizam a quantidade de complexos do antígeno-BCR recolhidos na sinapse. certas condições, quando as células B reconhecem antígenos associados a superfícies rígidas, este processo é acoplado ao recrutamento local e secreção de lisossomos, o que pode facilitar a extração do antígeno. Os antígenos uptomadas são internalizados em compartimentos Endo-lysosome especializados para processar nos peptídeos, que são carregados em moléculas principais do complexo II do histocompatibilidade (MHC-II) para uma apresentação mais adicional às pilhas do ajudante de T. Conseqüentemente, estudar a dinâmica do organela associou com a formação de um is é crucial a compreender como as pilhas de B são ativadas. No presente artigo, discutiremos a imagem e uma técnica bioquímica usada para estudar as mudanças no posicionamento da organela intracelular e nos rearranjos de citoesqueleto que estão associados à formação de um IS em células B.

Introduction

Os linfócitos B são uma parte essencial do sistema imunológico adaptativo responsável pela produção de anticorpos contra diferentes ameaças e patógenos invasores. A eficiência da produção de anticorpos é determinada pela capacidade das células B de adquirir, processar e apresentar antígenos encontrados em uma forma solúvel ou superfície-tethered1,2. O reconhecimento dos antígenos anexados à superfície de uma célula de apresentação, pelo BCR, conduz à formação de um contato intercelular próximo denominado é3,4. Dentro desta plataforma dinâmica a sinalização a jusante BCR-dependente e a internalização dos antígenos em compartimentos Endo-lysosome acontecem. Os antígenos de uptomado são processados e montados em moléculas de MHC-II e apresentados subseqüentemente aos linfócitos de T. As interações produtivas do B-T, denominadas cooperação da pilha de B-T, permitem que os linfócitos de B recebam os sinais apropriados, que promovem sua diferenciação em pilhas de plasma de produção de anticorpos ou em pilhas de memória8.

Dois mecanismos foram envolvidos na extração do antígeno por pilhas de B. A primeira conta com a secreção de proteases originadas de lisossomos que passam por recrutamento e fusão na fenda sináptica5,6. O segundo, depende das forças de tração miosina IIA-mediadas que desencadeia a invaginação do antígeno contendo membranas que são internalizadas em Poços revestidos com clathrin7. A modalidade da extração do antígeno confia nas propriedades físicas da membrana em que os antígenos são encontrados. Não obstante, em ambos os casos, as pilhas de B submetem-se a dois eventos de remodelação principais: reorganização do citoesqueleto do actina e polarização das organelas ao is. A remodelação do citoesqueleto de Actin envolve um estágio de espalhamento inicial, onde as saliências Actin-dependentes na membrana sináptica aumentam a superfície no contato com o antígeno. Isto é seguido por uma fase de contração, onde os BCRS acoplados com antígenos são concentrados no centro do é pela ação concertada de motores moleculars e do citoesqueleto do actina que remodelam8,9,10, 11. polarization das organelas igualmente confia na remodelação do cytoskeleton do actina. Por exemplo, o centrosome torna-se desacoplado do núcleo, por despolimerização local de actina associada, o que permite o reposicionamento desta organela ao is5,12. Nas células B, o reposicionamento do centrosome para um pólo celular (IS) orienta o recrutamento lisossome para a membrana sináptica, que após a secreção pode facilitar a extração e/ou processamento de antígenos de superfície-tethered6. Os lisossomas recrutados no IS são enriquecidos com MHC-II, o que favorece a formação de complexos peptídeos-MHC-II em compartimentos endossômicos a serem apresentados às células T13. Adicionalmente, o aparelho de Golgi também tem sido observado para ser estreitamente recrutado para o IS14, sugerindo que as vesículas derivadas de Golgi da via secretora poderiam estar envolvidas na extração e/ou processamento de antígenos.

Completamente, os rearranjos intracelular do organela e do citoesqueleto em pilhas de B durante a formação do sinapse são as etapas chaves que permitem a aquisição e o processamento eficientes do antígeno exigidos para sua ativação mais adicional. Neste trabalho apresentamos protocolos detalhados sobre como realizar exames de imagem e bioquímica em células B para estudar a remodelação intracelular de organelas associadas à formação de um IS. Essas técnicas incluem: (i) imunofluorescência e análise de imagens de células B ativadas com grânulos revestidos por antígeno e em coberturas revestidas com antígeno, o que permite a visualização e quantificação de componentes intracelulares que são mobilizados para o IS e (II ) isolamento de frações enriquecidas centrosome em células B por ultracentiogação em gradientes de sacarose, o que permite a identificação de proteínas associadas ao centrosome, potencialmente envolvidas na regulação da polaridade celular.

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Protocol

Nota: as seguintes etapas foram executadas usando células IIA 1.6 B.

1. B célula de ativação com antígeno-revestido de contas

  1. Preparação de grânulos revestidos com antígeno
    1. Para ativar as células B, use o NH2-Beads covalentemente revestido com antígeno (grânulos revestidos por AG), que são preparados usando 50 μL (~ 20 x 106 grânulos) de 3 μm NH2-Beads com ativação (BCR-ligand +) ou não-ativando (BCR-ligand-) antígenos.
    2. Para as células IIA 1.6 B, use o fragmento anti-IgG-F (AB ')2 como BCR-ligand + e anti-IgM-f (AB ')2 ou albumina sérica bovina (BSA) como BCR-ligand-. Para ativar células B primárias ou IgM+ b use a linha de células anti-IgM-F (AB ')2 como BCR-LIGAND + e BSA como BCR-ligand-.
      Nota: para evitar a ligação de ligantes ao receptor FC, utilize fragmentos de anticorpos F (AB ') ou F (AB ')2 em vez de anticorpos de comprimento total.
    3. Para prosseguir com a preparação de grânulos AG-revestidos, coloc os grânulos em baixos tubos de ligação da proteína do microcentrifugador para maximizar a recuperação dos grânulos durante a manipulação da amostra. Adicionar 1 mL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS) para lavar os grânulos e centrifugar a 16.000 x g durante 5 min. aspirar o sobrenadante.
    4. Ressuscitar os grânulos com 500 μL de glutaraldeído a 8% para ativar os grupos NH2 e girar por 4 h à temperatura ambiente (RT).
      PRECAUÇÃO: a solução de glutaraldeído só deve ser utilizada numa capa de fumos químicos. Siga as instruções na ficha de dados de segurança do material (MSDS).
    5. Os grânulos do centrifugador em 16.000 x g por 5 minutos, removem o glutaraldeído e lavam os grânulos mais três vezes com 1 ml de 1X PBS.
      PRECAUÇÃO: a solução de glutaraldeído deve ser descartada como um resíduo químico perigoso.
    6. Ressuspender os grânulos ativados em 100 μL de 1X PBS. A amostra pode ser dividida em dois tubos de microcentrífuga de ligação de baixa proteína: 50 μL para o BCR-ligante + e 50 μL para BCR-ligante-.
    7. Para preparar a solução antigénio utilize dois tubos de microcentrífuga de ligação de 2 mL de baixa proteína contendo 100 μg/mL de solução de antigénio em 150 μL de PBS: um tubo com BCR-ligante + e outro com BCR-ligante-.
    8. Adicionar 50 μL de solução de grânulos ativados a cada tubo contendo 150 μL de solução antigénio, vórtice e rodar durante a noite a 4 ° c.
    9. Adicionar 500 μL de 10 mg/mL de BSA para bloquear os restantes grupos reactivos do NH2 nos grânulos e rodar durante 1 h a 4 ° c.
    10. Centrifugue as contas a 16.000 x g durante 5 min a 4 ° c e retire o sobrenadante. Lave as contas com frio 1X PBS mais três vezes.
    11. Ressuspender os grânulos ativados em 70 μL de 1X PBS.
    12. Para determinar a concentração final de grânulos revestidos de AG, diluir um pequeno volume de grânulos em PBS (1:200) e contagem usando um Hemocytometer. Em seguida, armazene a 4 ° c até o uso.
      Nota: as esferas revestidas de AG não devem ser armazenadas por mais de 1 mês.
  2. Preparação de COVERSLIP de poli-L-lisina
    1. Antes do ensaio da ativação da pilha de B com grânulos AG-revestidos, prepare COVERSLIP poli-L-lysine-revestido (PLL-COVERSLIP). Utilize um tubo de 50 mL contendo 40 mL de 0, 1% p/v de solução de PLL e mergulhe as coberturas de 12 mm de diâmetro na solução. Gire durante a noite no RT.
    2. Lave as coberturas com 1X PBS e deixe secar em uma tampa de placa de 24 poços coberta com película de parafina. Prossiga com a ativação da célula B.
  3. Ativação da célula B
    1. Para iniciar a ativação da célula B com grânulos, primeiro diluir a linha celular IIA 1.6 B para 1,5 x 106 células/ml em meio de clique (rpmi-1640 suplementado com 2 mm l-alanina-l-glutamina + 55 μm beta-Mercaptoetanol + 1 mm piruvato + 100 U/ml de penicilina + 100 μg/ml estreptomicina) + 5% de soro bovino fetal inactivado por calor [FBS]).
    2. Combine 100 μL (150.000 células) de células IIA 1.6 B com grânulos revestidos por AG a 1:1 de proporção em tubos de 0,6 mL. Misture suavemente usando um Vortex e semente sobre PLL-COVERSLIP. Incubar para diferentes pontos temporais em uma incubadora de cultura celular (37 ° c/5% CO2). Os pontos de tempo de ativação típicos são 0, 30, 60 e 120 min. Para o tempo 0, coloque o PLL-COVERSLIP na tampa da placa de 24 poços no gelo. Adicione a mistura Cells-AG-revestida do grânulo e incubar por 5 minutos no gelo.
      Nota: é importante misturar por Vortex em vez de Pipetar para cima e para baixo, porque isso poderia reduzir o número de grânulos na amostra, devido à sua acumulação na ponta plástica da pipeta. Use grânulos revestidos com BCR-ligand-como um controle negativo para cada ensaio. Recomendamos ativar o tempo de incubação mais longo primeiro e, em seguida, os seguintes pontos de tempo. Calcule intervalos de ativação para amostras que estejam prontas para fixação ao mesmo tempo.
    3. Adicione 100 μL de PBS a frio 1x a cada lamínula para interromper a ativação e continuar com o protocolo de imunofluorescência. Consulte a secção 3 do protocolo.

2. ativação da célula B em coberturas revestidas com antígeno

  1. Preparação de coberturas revestidas com antígeno
    1. Antes da activação, prepare a solução antigénio (1X PBS contendo 10 μg/mL de BCR-ligand + e 0,5 μg/mL rato CD45R/B220).
      Nota: considere a preparação dos lamínulas no dia anterior ao ensaio. B220 melhora a adesão da célula B, no entanto, o BCR-ligand + é suficiente para gerar a resposta de propagação.
    2. Coloque a lamínula de 12 mm sobre uma tampa de placa de 24 poços coberta com película de parafina, adicione 40 μL de solução de antígeno em cada lamínula e incubar a 4 ° c durante a noite. Sele a placa para evitar a evaporação da solução do antígeno.
    3. Lave os lamínulas com 1X PBS e ar seco.
  2. Ativação da célula B
    1. Para iniciar a activação, diluir as células IIA 1.6 B para 1,5 x 106 células/ml no meio Click + 5% FBS.
    2. Adicionar 100 μl de células sobre uma lamínula revestida com antigénio (AG-lamela) e activar para diferentes pontos temporais numa incubadora de células a 37 ° c/5% CO2. Os pontos de tempo de ativação típicos são de 0, 30 e 60 min.
      Nota: como na seção 1, nós recomendamos começar com o ponto de tempo de activação o mais longo a fim fixar todas as amostras ao mesmo tempo.
    3. Para o tempo 0, coloc a tampa da placa de 24 poços que contem o AG-COVERSLIP no gelo e adicione as pilhas. Incubar por 5 min no gelo.
    4. Aspirar cuidadosamente a mídia em cada AG-COVERSLIP e, em seguida, adicionar 100 μL de frio 1X PBS para parar a ativação. Continue com o protocolo de imunofluorescência. Ver secção 3.

3. imunofluorescência

Nota: para evitar a reactividade cruzada do anticorpo secundário com as células BCR de IIA 1,6 B, não utilize anticorpos primários derivados do rato.

  1. Retire o 1X PBS e prossiga com a fixação de cada lamínula.
    Nota: para decidir qual o meio de fixação a utilizar, verifique a ficha de dados do anticorpo/corante. Por exemplo, para a rotulagem do actina pelo meio da fixação do paraformaldeído do uso do faloidina (PFA), e para a rotulagem do centrosome pela fixação do metanol do uso do pericentrin.
    1. Adicionar 50 μL de 1X PBS suplementado com 4% de PFA e incubar por 10 min em RT.
      Cuidado: o formaldeído é tóxico. Por favor, leia a MSDS antes de trabalhar com este produto químico. As soluções de PFA devem somente ser feitas uma capa de fumo química que desgasta luvas e vidros de segurança. A solução de PFA deve ser descartada como um resíduo químico perigoso.
    2. Alternativamente, adicionar 50 μL de metanol frio e incubar por 20 min.
  2. Lave três vezes com 1X PBS.
    Nota: as lamínulas podem ser armazenadas a 4 ° c neste ponto durante um máximo de três dias em 1X PBS.
  3. Remover 1X PBS e adicionar 50 μL de tampão de bloqueio (2% BSA + 0,3 M glicina em 1X PBS) para cada lamínula. Incubar em RT por 10 min.
  4. Aspirar suavemente e acrescentar 50 μL de tampão de permeabilização (PB) (0,2% BSA + 0, 5% saponina em 1X PBS). Incubar em RT por 20 min.
  5. Prepare os anticorpos ou corantes em PB (utilize 30 μL por lamínula) e incubar na RT durante 1 h ou durante a noite a 4 ° c. Consulte a tabela de materiais para obter detalhes adicionais.
    1. Para rotular o centro organizador microtúse (MTOC) ou centrosome use os seguintes anticorpos: anti-γ-tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
      Nota: para as células B de rotulagem centrosome pode ser transfected com um plasmídeo de expressão centrin-GFP.
    2. Para o uso do instrumento de rotulagem Golgi anti-Rab6a (1:500).
      Nota: outros anticorpos ou corantes também podem ser usados.
    3. Para etiquetar lisossomas, use Lamp1 (1:200).
      Nota: anti-H2-DM e anti-MHC-II também podem ser usados para rotular os compartimentos de processamento do antígeno15,16.
    4. Para a rotulagem de retículo endoplasmático use anti-Sec61a (1:500).
    5. Para o citoesqueleto de actina, considere o seguinte: a actina polimerizada pode ser visualizada por Phalloidin conjugada a corantes fluorescentes.
      Nota: as células B transfectadas com um plasmídeo de expressão LifeAct-GFP/RFP também podem ser usadas para rotular a actina.
  6. Lave os lamínulas três vezes com PBS.
  7. Diluir o anticorpo secundário ou corantes em PBS (utilizar 30 μL por lamínula) e incubar 1 h na RT.
    Nota: Evite expor as amostras à luz direta para preservar a qualidade do sinal de fluorescência.
  8. Lave os lamínulas três vezes com PBS.
  9. Retire a solução PBS dos lamínulas.
  10. Adicionar 4 μL de reagente de montagem a uma lâmina de microscópio. Monte a lamínula no slide com o lado da célula virado para baixo. Deixe as lâminas secar por 30 min a 37 ° c ou em RT durante a noite.
    Nota: considere o uso de um reagente de montagem "anti-fade" (veja a tabela de materiais).
  11. Adquira imagens de fluorescência em um microscópio confocal ou epifluorescência com um objetivo de imersão de óleo de 60x ou 100x. Para cada aquisição considere a luz transmitida ou campo brilhante para identificar facilmente as células B interagindo com grânulos.
    Nota: Tome imagens tridimensionais (3D), cobrindo toda a célula usando pilhas z. Recomendamos tomar 0,5 μm pilhas grossas, no entanto, isso depende do microscópio.

4. análise de imagem

Observação: os seguintes algoritmos são descritos para o software ImageJ. No entanto, isso pode ser executado usando um software equivalente. Também, considere que para todas as medidas da intensidade da fluorescência nós usamos a densidade integrada da fluorescência ("RawIntDen" em ImageJ), porque este parâmetro considera a quantidade total de fluorescência em cada pixel da imagem, tendo a área na consideração.

  1. Análise da distribuição de organelas em células B ativadas com grânulos revestidos por AG
    Nota: para quantificar a polarização dos componentes da célula para o IS, definimos um valor arbitrário como uma medida de proximidade com o IS. O índice varia entre-1 (anti-polarizado) e 1 (totalmente polarizado, objeto no talão), como foi apresentado anteriormente por Reversat et al.12.
    1. Estimar o índice de polaridade para o aparelho centrosome e Golgi (Figura 1b).
      Nota: Este algoritmo pode ser usado para organelas que são confinadas a um ponto um.
      1. Primeiro, defina as áreas de talão e célula para analisar usando a seleção de ferramenta círculo para delimir os limites de ambos e, em seguida, salvá-los como regiões de interesse (ROI). Consulte a figura 1, figura 2, Figura 3e Figura 4.
      2. Determine o centro de células (CC) e o centro de talão (BC) executando Analyze | Medida em áreas da pilha e do grânulo respectivamente. Os valores X e Y obtidos da janela Results determinam as coordenadas do centro.
      3. Determine manualmente o centro do aparelho centrosome ou Golgi (organelle) usando a seleção de ferramenta de ponto no ImageJ e execute Analyze | A medida. Valores de X e Y obtidos da janela de resultados determinam as coordenadas.
      4. Em seguida, desenhe um ângulo de CC para organelle (a) e CC para BC (b) usando a seleção de ferramenta de ângulo e execute Analyze | A medida. O valor Angle na janela Results mostra o ângulo (α) entre os dois vetores (a e b).
      5. Calcule o índice de polaridade usando a seguinte fórmula:
        Equation 1
    2. Estimar o índice de polaridade dos lisossomos (Figura 1F).
      Nota: utilizamos este algoritmo para analisar a polaridade das organelas que exibem uma distribuição mais dispersa, como os lisossomos.
      1. Defina as áreas de talão e célula para analisar, usando a seleção da ferramenta círculo para delimir os limites de ambos e salvá-los como ROI. Uma vez que as áreas do grânulo e da pilha foram determind, ajuste o canal da fluorescência e projetem a imagem em uma z-pilha (imagem | Pilhas | Z-Project [Sum Slices]), em seguida, executar Analyze | Meça e extraia as coordenadas do centro de massa (MC) (MX e My) das janelas de resultados.
      2. Aplique o mesmo algoritmo mencionado antes de mudar organelle para MC. Assim, o ângulo (α) é definido pelo CC-MC (a) e CC-BC (b).
      3. Calcule a polaridade usando a seguinte fórmula:
        Equation 2
    3. Estimar o recrutamento de lisossomo para a área sináptica (Figura 2b).
      Nota: Este algoritmo é usado para quantificar uma organela adjacente ao IS.
      1. Uma vez que as áreas de cordão e célula foram determinadas, determine o ângulo do vetor entre o CC e BC e, em seguida, gire a imagem para atingir um ângulo de 0 °.
      2. Definir o canal fluorescente e projetar a imagem em um z-Stack (imagem | Pilhas | Z-Project [Sum fatias]), elimine toda a fluorescência que cai fora da célula e da área do cordão em conjunto (executar Editar | limpar fora no ImageJ).
      3. Usando a seleção da ferramenta retângulo , desenhe um retângulo adjacente ao cordão e meça a fluorescência da área sináptica (SAF). Este retângulo é um quarto da largura da célula.
      4. Selecione a imagem inteira e execute Analyze | Medida para obter a fluorescência da célula inteira (WCF).
      5. Calcule a porcentagem de fluorescência da organela adjacente ao IS usando a seguinte fórmula:
        Equation 4
    4. Quantificar o recrutamento de componentes celulares para o centrosome.
      Nota: Este algoritmo, adaptado de Obino et al.5, é utilizado para quantificar o enriquecimento de organelas na área centrosome. Momentaneamente, nós consideramos a área centrosome como o domínio em que a fluorescência centrosome-associada do organela remanesce constante ou acima de 70% no lote da fluorescência/raio. É essencial ajustar este parâmetro em condições de descanso porque este raio poderia mudar em cima da ativação.
      1. Uma vez que as áreas de cordão e célula foram determinadas, defina a localização do centrosome usando a seleção de ferramenta de ponto (Figura 3B).
      2. Primeiramente, determine a área máxima em torno do centrosome que é possível quantificar, desenhando um círculo do μm-raio 3 que circunda o centrosome.
      3. Use o perfil radialdo plugin ImageJ, que mede a fluorescência em círculos concêntricos e exibe um gráfico de fluorescência/raio.
      4. Identifique o raio máximo dentro do qual pelo menos 70% da intensidade de fluorescência é mantida.
      5. Calcule a razão de densidade de fluorescência utilizando a seguinte fórmula:
        Equation 5=Equation 6
        Nota: a razão de densidade de fluorescência indica a concentração de uma organela no centrosome em comparação com a sua distribuição em toda a célula.
  2. Análise de espalhamento celular e distribuição de organelas em células B ativadas em COVERSLIP AG
    1. Estimativa da distribuição organela no is (Figura 4B).
      Nota: Este algoritmo permite a quantificação da distribuição XY de organelas e sua concentração no centro do IS. Definimos uma razão de densidade de fluorescência entre a área central e total da sináptica. Os valores obtidos podem variar de negativo para positivo, indicando uma distribuição periférica ou central da organela, respectivamente.
      1. Determine a fatia na qual a célula está em contato com a capa.
        Nota: para delimir os limites da célula pode-se rotular a membrana plasmática ou actina que é enriquecido na periferia do IS.
      2. Altere o tipo da fatia para 8 bits e, em seguida, esta (Process | Binário | Make Binary) e conectar os pontos de estranho mais próximos processo | Binário | Esboço. Delimeie os limites da área de célula (CA) usando a seleção de ferramenta de polígono .
        Nota: esta etapa é útil para aumentar o contraste dos limites da célula e torná-lo mais fácil de identificar. Além disso, neste ponto, é possível aplicar o plugin de partícula Analyze de ImageJ para determinar a CA automaticamente. No entanto, outras células no mesmo campo podem interferir com os resultados.
      3. Tome o CA Parameters (altura e largura) e delimeie uma área arredondada central, que seja separada dos limites por um quarto dos valores da altura e da largura, considere esta área como a área do centro de pilha (CCA).
      4. Calcule a distribuição da densidade de fluorescência no centro do IS usando a seguinte fórmula:
        Equation 7
    2. Medir a distribuição organela em planos Z (Figura 4C).
      Nota: esta análise determina a distribuição geral da fluorescência da organela em planos Z de células B ativadas para as coberturas AG, mostrando a percentagem de fluorescência por fração Z.
      1. Para quantificar a distribuição de fluorescência em Z, primeiro determine o plano do IS onde a célula está em contato com o AG-COVERSLIP e, em seguida, o plano correspondente ao limite superior da célula.
      2. Desenhe uma linha em todo o centro de células.
      3. Reslice a imagem em Z (imagem | Pilhas | Reslice), para obter uma imagem XZ.
      4. Meça a altura e divida a imagem XZ em 10 retângulos consecutivos da mesma altura (fração Z) da parte inferior (interface IS) até o topo (lado superior da célula) e quantifique o sinal de fluorescência em cada um.
      5. Normalize a intensidade de fluorescência de cada fração Z pela soma da fluorescência total das 10 frações.
      6. Plotar a porcentagem de intensidade de fluorescência por fração Z da célula.

5. isolação da fração centrosome-enriquecida das pilhas de descanso e ativadas de B

Nota: mantenha todas as soluções a 4 ° c durante o experimento para evitar a degradação da proteína. Este protocolo foi adaptado do trabalho anterior17,18.

  1. Ativar 2 x 107 B células com AG-revestido contas em 2 ml de Click médio + 2% calor-INACTIVATED FBS (rácio 1:1). Considere células B não ativadas como células B em repouso.
  2. Adicionar citocalasin D (2 μM) e nocodazol (0,2 μM) e incubar por 1 h a 37 ° c.
    Nota: estes fármacos são utilizados para separar suavemente o centrosome do núcleo, por despolimerizar o citoesqueleto de actina e microtúbulos, respectivamente, para evitar a contaminação nuclear.
  3. Lave cada amostra com 5 mL de frio 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) e, em seguida, com 1 mL de 0,1 x TBS suplementado com 8% de sacarose.
  4. Ressuscite as células com 150 μL de tampão de Lise centrosome (1 mM HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% beta-Mercaptoetanol, 1 mm de fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF) ou inibidor de protease cocktail) e pipeta para cima e para baixo até a viscosidade diminui, o que indica que a lise celular é identificada na amostra. Coloque a amostra em um tubo de 1,5 mL.
  5. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° c, para separar as organelas do núcleo.
  6. Recupere cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o no topo de um tubo de 1,5 mL com 300 μL de tampão de gradiente (GB) (tubos de 10 mM pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% beta-Mercaptoetanol) contendo 60% de sacarose.
  7. Centrifugador a 10.000 x g durante 30 min a 4 ° c para concentrar os centrosomas na fração de sacarose 60%.
  8. Enquanto isso, prepare um gradiente descontínuo em 2 mL de tubos ultracentlee por sobrepondo 450 μL de GB + 70% de sacarose com 270 μL de GB + 50% de sacarose e, em seguida, 270 μL de GB + 40% de sacarose.
  9. Após a primeira centrifugação (fração concentrada centrosome), descarte a fração superior (porção menos densa) até atingir a interface e vórtice da amostra restante no tubo. Em seguida, sobreposição em cima do gradiente descontínuo previamente preparado com a amostra enriquecida centrosome.
    Nota: tenha cuidado para não interromper o gradiente, todos os procedimentos de pipetagem devem ser cuidadosamente realizados.
  10. Centrifugador em 40.000 x g para 1 h em 4 ° c com aceleração mínima e com o freio do centrifugador ajustado para fora, para evitar interromper o inclinação.
  11. Colete 12 frações de 100 μL em tubos separados, começando do topo.
  12. Identifique as frações enriquecidas centrosome pelo immunoblot usando o γ-tubulin como o marcador do centrosome.
    Nota: costumamos encontrar extratos enriquecidos pelo centrosome entre as frações 6 e 8.

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Representative Results

O artigo atual mostra como as pilhas de B podem ser ativadas usando o antígeno imobilizado em grânulos ou em COVERSLIP para induzir a formação de um IS. Fornecemos informações sobre como identificar e quantificar a polarização de diferentes organelas por imunofluorescência e como caracterizar proteínas que passam por mudanças dinâmicas em sua associação ao centrosome, que polariza para o IS, utilizando um abordagem bioquímica.

A imagem latente de pilhas de B pela imunofluorescência permite que nós sigam a dinâmica dos organelas tais como o centrosome, o instrumento de Golgi e os lysosomes, que são recrutados ao is em cima da ativação da pilha de b. Pode-se obter parâmetros quantitativos para medir a polarização dessas organelas no IS e compará-las em diferentes condições. Como mostramos na Figura 1a, os aparelhos centrosome e Golgi são recrutados para o is após a ativação da célula B. O recrutamento não foi observado nas células B estimuladas com BCR-ligand-indicando que o engajamento do BCR é necessário para mobilizar o aparelho centrosome e Golgi para o IS (Figura 1a). Para obter um índice de polaridade para cada organela, como medida de sua proximidade com o IS, consideramos três características: a distância entre a organela e o centro da célula, a distância entre o centro do cordão e o centro celular, e o ângulo entre estes dois vetores (Figura 1b). Este índice varia entre-1 (anti-polarizado) e 1 (totalmente polarizada, objeto no talão). Figura 1C e 1D mostram gráficos onde os índices de polaridade de cada organela são plotados versus o tempo de ativação. De acordo com a coloração de imunofluorescência, tanto o aparelho centrosome quanto o de Golgi, apresentam índices de polaridade mais positivos em pontos de tempo mais longos de ativação, refletindo como eles são progressivamente recrutados para o IS. Este algoritmo é aplicável para organelas confinadas a um ponto.

Adicionalmente, quantificamos a polarização de organelas que exibem uma distribuição dispersa, como lisossomos (Figura 1e), aplicando o mesmo algoritmo mencionado anteriormente, mas mudando a coordenada de ponto pelas coordenadas do centro de massa de lisossomas (Figura 1F). Observa-se que os índices de polaridade de pools de lisossoma atingem valores mais positivos na ativação, o que indica que os lisossomos estão sendo mobilizados para a sinapse sobre a ativação da célula B (Figura 1G).

Também definimos dois algoritmos para determinar organelas que estão em contato com a interface sináptica (talão) e a quantidade de organelas na proximidade da sinapse, mas não necessariamente em contato. Como mostramos na Figura 2, quantificamos lisossomos contatando a interface sináptica (Figura 2a), dividindo-se o sinal Lamp-1 na área do cordão pela fluorescência total na célula mais o talão (Figura 2b). É importante considerar que o diâmetro da área do grânulo determina as escalas das porcentagens obtidas. Por exemplo, na quantificação apresentada (Figura 2b), desenhamos um círculo com um diâmetro de 3 μm para medir a fluorescência no cordão, que é um parâmetro restritivo Considerando o tamanho do cordão (3 μm). Utilizando esse parâmetro, os resultados mostram que os lisossomos são progressivamente recrutados para a interface sináptica na ativação da célula B, atingindo 10-15% da massa total (Figura 2C). Outra abordagem mostrada é a quantificação de lisossomos na área sináptica. A Figura 2D mostra que os lisossomas acumulam progressivamente até 25% de seus LISOSSOMOS no is. Globalmente, realizando ambos os tipos de análise pode-se avaliar a polarização e a ancoragem de organelas no IS.

Durante a ativação da célula B, as alterações no pool de proteínas associadas ao centrosome foram documentadas5. Por exemplo, uma dessas proteínas que muda sua associação no Centrosome durante a ativação da célula B é actina. Neste caso o actina torna-se esgotado dentro desta região, que permite que o centrosome se torne destacado do núcleo, promovendo seu polarização ao is5. Aqui apresentamos a quantificação da actina no Centrosome e como ela se esgota na ativação da célula B (Figura 3). Para definir a área centrosome utilizada para quantificar a actina associada, medimos a intensidade de fluorescência desta etiqueta em círculos concêntricos em torno do centrosome. O raio foi definido com base no ponto em que pelo menos 70% da intensidade de fluorescência do rótulo é mantida (Figura 3B). Usando essa abordagem pode-se quantificar a diminuição da densidade de actina no centrosome após a ativação da célula B, como mostra a Figura 3C.

Para obter maior resolução na distribuição de organelas na interface is, foram ativadas células B em coberturas revestidas com antígeno, rotulagem de actina, aparelho de Golgi e retículo endoplasmático (figura 4a). A distribuição das organelas no IS pode ser realizada mergulhando a área sináptica em uma área central e periférica, aplicando-se um critério mostrado na Figura 4B. Isso se baseou no trabalho prévio que mostra que os BCRS se reúnem dentro dessa área central, o que provavelmente corresponde ao complexo central de ativação supramoleculares (csmac)10,19. A figura 4a mostra que as organelas recrutadas para o is, como o aparelho de Golgi e o retículo endoplasmático apresentam distribuições opostas. De fato, seus índices de distribuição se correlacionaram com a coloração da imunofluorescência mostrada na Figura 4C. O aparelho de Golgi mostra um valor positivo, o que significa que está concentrado no centro da IS enquanto o retículo endoplasmático apresenta valores negativos, o que significa que está localizado principalmente na região periférica do IS. Adicionalmente, é possível tomar os valores da área sináptica previamente determinado, para medir a área de espalhamento durante a ativação da célula B, como é mostrado nas figuras 4D e 4e. Estes resultados mostram um aumento na área de espalhamento sobre a ativação da célula B, como descrito anteriormente10,20.

Como no ensaio do grânulo, nós podemos determinar a distribuição das organelas para o sinapse imune tomando as imagens de XZ das pilhas de B ativadas em COVERSLIP antígeno-revestidos e medindo a fluorescência do organela através da dimensão de Z (Figura 4F). A intensidade de fluorescência da actina no plano Z foi medida, pois é representada no plano XZ na Figura 4F, onde pode ser observado um enriquecimento progressivo da actina na interface sináptica (frações 1 e 2) (Figura 4G).

Além da análise de imagens de células B, realizamos o isolamento de frações enriquecidas com centroalguns para quantificar as proteínas associadas ao centrosome (Figura 5a). Essa abordagem pode ser importante para complementar o estudo da formação de IS em células B, uma vez que o centrosome polariza a membrana sináptica e demonstrou coordenar o tráfico de lisosalguns envolvidos na extração e apresentação do antígeno21. Este método foi descrito previamente usando grandes quantidades de pilhas (1 x 109 pilhas)17,18 mas nós estandardizamos uma versão simplificada, que use uma quantidade reduzida de pilhas e possa ser executada usando o baixo-volume ultracentlee-tubes (2-3 mL). Como mostramos na Figura 5b, analisamos diferentes frações celulares por imunoblotting e determinamos quais correspondem a frações ricas em centrosome, por coloração de tubulina gama. Aqui nós mostramos um exemplo das proteínas que sofrem mudanças em sua acumulação no centrosome, tal como Actin e Arp2, que foram relatados previamente5.

Figure 1
Figura 1 : Polarização de organelas em direção ao is. (A) coloração de imunofluorescência do aparelho de Golgi (Rab6a) e microtúbulos (α-tubulina) em células IIA 1,6 B incubadas com BCR-ligand + (0, 30, 60 e 120 min) ou BCR-ligand-beads (120 min). Os ARROWHEADS indicam o centrosome. BF = campo brilhante. Barra de escala = 3 μm. (B) esquema descrevendo como calcular o índice de polaridade de organelas (centrosome ou aparelho de Golgi) em direção ao is. a = distância entre o centro da célula (CC) para a organela. b = distância do CC e do centro do talão (BC). (C, D) Parcelas representativas do ponto que mostram índices da polaridade dos organelas em pontos diferentes do tempo da ativação. Cada ponto representa uma célula. (E) coloração de imunofluorescência de lisossomos (Lamp1) em células B incubadas com BCR-ligand + (0, 30, 60 e 120 min) ou BCR-ligand-beads (120 min). BF = campo brilhante. Barra de escala = 3 μm. (F) esquema que representa como calcular o índice de polaridade dos lisossomos. a = distância entre CC para o centro de massa (MC). b = distância do CC ao BC. G Parcelas representativas do ponto que mostram índices da polaridade dos lisossomos em pontos diferentes do tempo da ativação. Cada ponto representa uma célula. ANOVA de 2 vias com o pós-teste de Sidak foi realizada. Os meios com SEM são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Acumulação de lisossomos no is. (A) coloração de imunofluorescência de lisossomos (Lamp1) em células B incubadas com BCR-ligand + (0, 30, 60 e 120 min) ou BCR-ligand-beads (120 min). BF = campo luminoso. Barra de escala = 3 μm. (B) esquema descrevendo como calcular o acúmulo de organelas como lisossomos no cordão e na área sináptica. Fluorescência de toda a célula (WCF), fluorescência de cordão (BF) e a fluorescência da área sináptica (SAF) são indicadas. (C, D) Gráficos de barras representativos para o acúmulo de lisossomos no cordão e na área sináptica. N = 1. 20 > Cells. ANOVA de 2 vias com o pós-teste de Sidak foi realizada. Os meios com SEM são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Quantificação de actina no centrosome durante a formação de is. (A) coloração por imunofluorescência de actina (Phalloidin) e microtúbulos (α-tubulina) em células B incubadas com BCR-ligand + (0 e 60 min) ou BCR-ligand-Beads (0 e 60 min). As cabeças de flecha indicam o centrosome. Barra de escala = 3 μm. (B) esquema descrevendo como calcular o recrutamento ou depleção de componentes associados centrosome. A área centrosome é calculada usando um raio (X μm) que mantêm pelo menos 70% da fluorescência máxima. (C) parcelas representativas de pontos que demonstrem actina no centrosome condições ativadoras (BCR-ligand +) e não ativadoras (BCR-ligand-). N = 1. 15 > Cells. ANOVA de 2 vias com o pós-teste de Sidak foi realizada. Os meios com SEM são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Distribuição de componentes celulares na interface sináptica. (A) coloração de imunofluorescência de actina (Phalloidin), Reticulum endoplasmático (Sec61a), aparelho de Golgi (transfected com um kdelr-DN-GFP um dominante negativo do receptor de KDEL, que localiza no Golgi). As células B foram semeadas em coberturas revestidas com BCR-ligand + por 60 min. BF = campo brilhante. Barra de escala = 5 μm. (B) esquema descrevendo como determinar a área de espalhamento da célula e o recrutamento de organelas no centro da is. No esquema, a CA indica a área da célula delimitada pela actina cortical e a CCA indica a área da célula central. (C) aparelho de Golgi e distribuição de retículo endoplasmático no is, representado por um gráfico de barras onde um valor > 0 indica um enriquecimento no centro do is e < 0 indica uma distribuição periférica. N = 1. 20 > Cells. Os meios com SEM são mostrados. D) imagens representativas de células B rotuladas para actina (Phalloidin) ativadas em coberturas revestidas com AG em diferentes pontos temporais (0, 30 e 60 min), mostrando o plano XZ e XY. (E) gráfico mostrando a área de espalhamento de células B em e. (F) esquema descrevendo como determinar a distribuição do sinal de interesse no plano z e o gráfico por fração z. O retângulo indica a interface IS. (G) distribuição de actina através do plano Z representado por um gráfico de linha da porcentagem de distribuição de fluorescência versus cada fração Z. O retângulo representa a interface IS. N = 1. 25 > Cells. Os meios com SEM são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Frações enriquecidas Centrosome de pilhas de B. (A) fluxo de trabalho de como obter frações enriquecidas pelo centrosome por ultracentlee gradiente de sacarose. (B) immunoblot de frações obtidas das células B em repouso e ativadas (60 min). As frações centrosome-ricas são detectadas etiquetando com γ-tubulin e são indicadas dentro do retângulo tracejado (fração 6 a 8). As proteínas associadas centrosome (Actin e Arp2) são mostradas em frações centrosome-ricas em condições de activação e de descanso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós descrevemos um método detalhado para estudar como os linfócitos de B re-organizam sua arquitetura intracelular para promover a formação de um is. Este estudo inclui o uso de técnicas de imagem para quantificar a distribuição intracelular de organelas, como centrosoma, aparato de Golgi e lisossomas durante a ativação da célula B, e como elas se polarizam com o IS. Adicionalmente, nós descrevemos uma aproximação bioquímica para estudar mudanças na composição do centrosome em cima da ativação da pilha de B.

Para promover a formação de um is em pilhas de B, nós usamos antígenos imobilizados (grânulos antígeno-revestidos) em vez dos imune-complexos solúveis porque o anterior provoca o estabelecimento de um local discreto do contato onde os rearranjos e o organela do citoesqueleto a polarização pode facilmente ser estudada. Um aspecto crítico na ativação da célula B de imagem é a preparação das amostras. Todas as aquisições de imagem devem idealmente obter uma 1:1 célula: razão de cordão, para quantificar a polarização de organelas para um local único de contato do antígeno. No entanto, em alguns casos, as células B podem capturar dois ou mais grânulos, dificultando a escolha de um único local de encontro antigénio. Para evitar a formação de agregados do grânulo, é importante para vórtice-grânulos conjugados do antígeno completamente antes de adicioná-los às pilhas. Adicionalmente, para experimentos de imunofluorescência, recomendamos excluir das células de quantificação que capturam mais de um talão, a fim de evitar interpretações erradas durante a análise da imagem. Outro passo crítico na preparação das amostras é a condição de fixação/permeabilização. Por exemplo, recomendamos a fixação de células com metanol para otimizar a coloração de microtúcitos e 4% de PFA para coloração de faloidina. Ao simultaneamente etiquetar o citoesqueleto e os microtubules do actina, uma alternativa pode ser etiquetar a associação do actina transfecting pilhas com um plasmídeo da expressão de LifeAct-GFP/RFP em combinação com a mancha do microtubule. A aquisição de imagem utilizada para quantificar a polarização do Centrosome e de outras organelas intracelulares pode ser realizada com um microscópio de epifluorescência. No entanto, para obter uma quantificação exata em diferentes planos-z, por exemplo, no ensaio de espalhamento, a microscopia confocal é necessária.

Para o protocolo de isolamento centrosome descrito aqui, um passo crítico é a obtenção de uma quantidade adequada de amostras para ser capaz de quantificar proteínas por immunoblot. Dado que as pilhas de B têm um grande núcleo e seu citoplasma é menos de 30% de seu volume total da pilha, obtendo uns rendimentos mais elevados de proteínas cytoplasmic pode ser desafiante. Por esta razão, recomendamos o uso de aproximadamente 20 x 106 células B para cada ponto de tempo de ativação para o isolamento centrosome.

Uma limitação significativa destes métodos é que a ativação com grânulos antígeno-conjugados não inclui a complexidade do ambiente em que os antígenos superfície-tethered são apresentados às pilhas de B in vivo. Esta limitação pode ser abordada completando a cultura ou grânulos com outros fatores coestimulatórios, como citocinas e componentes da matriz extracelular. Entretanto, é crucial usar os controles apropriados nestes casos a fim interpretar corretamente os resultados.

O significado dos métodos apresentados neste trabalho baseia-se na abordagem integrada utilizada para estudar a sinapse imune da célula B: (1) a polarização das organelas e sua distribuição e (2) as alterações na composição protéica no centrosome. Devido ao grande número de células necessárias para realizar uma análise significativa e a grande quantidade de dados gerados nesse processo, os diferentes algoritmos de quantificação apresentados neste trabalho facilitam a análise da imagem celular. Além disso, os algoritmos usados para a polarização da pilha são fáceis de automatizar por funções das macros em ImageJ, que é uma ferramenta útil para diminuir tarefas repetitivas e para conservar o tempo.

Estes procedimentos experimentais podem ser extrapolados para outros tipos de células que estabelecem fenótipos polarizados, a fim de realizar uma determinada função celular. Adicionalmente, estes protocolos podem ser otimizados, incluindo outros ensaios, por exemplo, a atividade das proteínas associadas, tais como quinases ou proteases em frações enriquecidas com Centrosome. No geral, esses estudos podem fornecer informações mecanísticas sobre sinalização celular e vias moleculares que regulam o estabelecimento da polaridade celular.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

M.-I.Y. é apoiado por uma subvenção de pesquisa da FONDECYT #1180900. J.I., D.F. e JL foram apoiados por bolsas do Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio da Pontificia Universidad Católica de Chile pela gravação e edição de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

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References

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