Summary
MZmine に実装された診断フラグメンテーションフィルタリングは、既知および未知の天然製品のクラス全体について、LC-MS/MS データセットをスクリーニングするための、エレガントで取得後のアプローチです。このツールは、分析者が化合物クラス全体の診断として定義した製品イオンおよび/または中性損失の MS/MS スペクトルを検索します。
Abstract
天然物は、多くの場合、単一の化合物ではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。共通の構造的特徴のために、同じクラス内の多くの化合物は、同様の MS/MS 断片化を受け、いくつかの同一の製品イオンおよび/または中性損失を有する。診断フラグメンテーションフィルタリング (DFF) の目的は、クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を含む MS/MS スペクトルの非ターゲット LC-ms/MS データセットをスクリーニングすることにより、複雑な抽出で特定のクラスのすべての化合物を効率的に検出することです。この方法は、四重極 Orbitrap または四重極のタイムオブフライト質量などの高分解能質量分析計でのデータ依存型集録によって分析されるサンプル抽出を必要とするオープンソース MZmine プラットフォーム内に実装した DFF モジュールに基づいています。アナライザー。このアプローチの主な制限は、アナリストは、天然物の対象となるクラスに固有の製品のイオンおよび/またはニュートラルな損失を最初に定義する必要があります。DFF は、新しい化合物を含む複雑なサンプル内のすべての関連する天然物のその後の発見を可能にします。本研究では、藍藻の原因となるMicrocystis 膿菌の抽出物を、ミクロシスチンの産生に対してスクリーニングすることにより、DFF の有効性を実証する。
Introduction
タンデム質量分析法 (MS/MS) は、前駆体イオンを単離し、衝突誘導解離 (CID) のような活性化エネルギーの適用を介して断片化を誘導することを含む、広く使用されている質量分析方法です。イオンフラグメントがその分子構造と密接に結びついている方法。天然物は、多くの場合、単一のユニークな化学物質2としてではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。そのため、同じ生合成クラスの一部である構造的に関連する化合物は、共通の製品イオンおよび/または中性損失を含む重要な MS/MS フラグメンテーション特性を共有することが多い。クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を有する化合物のための複雑なサンプルをスクリーニングする能力は、化合物のクラス全体を検出する強力な戦略であり、潜在的に新しい天然産物の発見につながる3、4,5,6.何十年もの間、低分解能の測定器で実行される中性損失スキャンや前駆体イオンスキャニングなどの質量分析法により、同じ中性損失または製品イオンによるイオンの検出が可能になりました。しかし、実験を行う前に特定のイオンまたは遷移を定義する必要があった。研究室では高分解能の質量分析計が普及しているため、複雑なサンプルは、対象外のデータ依存型集録 (DDA) メソッドを使用して一般的に選別されています。従来の中性損失および前駆体イオン走査とは対照的に、構造的に関連する化合物は、捕捉後分析7によって同定することができる。本研究では、複雑な行列内の化合物の全クラスを検出するための、診断断片化フィルタリング (DFF)5,6と呼ばれる、簡単でわかりやすい方法を開発した戦略を示します。この DFF モジュールは、オープンソースの MZmine 2 プラットフォームに実装されており、MZmine 2.38 またはそれ以降のリリースをダウンロードすることで利用できます。DFF により、ユーザーは、化合物のクラス全体の診断である製品イオン (複数可) および/または中性損失 (es) を含む MS/MS スペクトルの DDA データセットを効率的にスクリーニングすることができます。DFF の制限は、化合物のクラスのための特徴的な製品イオンおよび/または中性損失がアナリストによって定義されなければならない。
例えば、60以上の異なるフモニシンマイコトキシンのそれぞれが8、9が tricarballylic 側鎖を有していることを識別し、その上にm/z 157.0142 (C6H5-5-) 積イオンを発生する[M-H]-イオン4の断片化。したがって、サンプル中のすべての推定 fumonisins は、著名なm/z 157.0142 製品イオンを含む DDA データセット内のすべての MS/ms スペクトルをスクリーニングすることにより、DFF を使用して検出することができます。同様に、硫酸化化合物は、79.9574 Da (SO3)3の診断中立損失を含む ms/MS スペクトルのための DDA データセットをスクリーニングすることによって検出することができる。このアプローチは、新しい環状ペプチド5およびトリプトファンまたはフェニルアラニン残基6を含む天然産物の検出にも首尾よく適用されている。
MZmine プラットフォーム10内での DFF の有効性とその使いやすさを実証するために、ミクロシスチン (MCs) の分析にこのアプローチを適用しました。淡水シアノバクテリア11、12、13によって生成された240以上の構造的に関連する毒素のクラス。
最も一般的に報告されるシアノトキシンは MCs であり、MC-LR (ロイシン [L]/arginine [R]) コンジナー最もよく研究されている (図 1)。MCs は、効果非リボソーム heptapeptides、 Microcystis、アナベナ、ネンジュモ属、およびPlanktothrix12,13を含む複数のシアノバクテリア属によって生合成。MCs は、L-アミノ酸によって占められている5つの共通残基と二つの可変位置からなる。ほぼ全ての Mc は、位置 511に特徴的なβ-アミノ酸 3-アミノ-9-メトキシ-2, 6, 8-トリメチル-10-phenyldeca-4, 6-dienoic 酸 (Adda) 残基を有する。 MCs の ms/ms フラグメンテーション経路はよく説明されています14,15;Adda 残基は、著名な ms/ms 製品イオン、 m/z 135.0803+ (c9H11O+) だけでなく、 m/z 163.1114+ (c11h 15 を含む他の製品のイオンを担当していますO+) (図 2)。Microcystis 膿菌の非標的 DDA データセット細胞抽出物は、これらの診断イオンを使用して存在するすべてのミクロシスチンについてスクリーニングすることができ、ミクロシスチンは Adda 残基を有することが認められる。
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Protocol
1. 非標的液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS データセットの作成
注: DFF は、高分解能質量分析計を使用し、対象クラスの検体に最適化された分析方法で実行できます。MC Orbitrap 質量分析計での LC-MS/MS 条件を材料表に記載しています。
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ダウンロード MZmine 2(http://mzmine.github.io/)
注: サンプルデータ CPCC300 は https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0 で見つけることができます。- Raw データメソッドドロップダウンメニューで、 raw データインポートオプションを選択します。
- 分析するデータファイルを選択します。1つまたは複数のファイルをインポートできます。
- オプションMZmine でベンダーデータフォーマットがサポートされていない場合は、Proteowizard16を使用して centroided mzml データファイルを生成します。
- ベンダー提供の centroiding アルゴリズムを適用するには、ピークピッキングフィルターを選択します。
2. インポートされた DDA ファイルの診断断片化のフィルタリング
- カーソルを使用して、メイン MZmine 画面のRaw データファイル列のデータファイルを選択して強調表示します。
- [ビジュアライゼーションのドロップダウン] メニューで、[診断フラグメンテーションのフィルタリング] オプションを選択します。
- 表示される DFF ダイアログボックス (図 3) で、次のオプションを入力します。
- 保持時間:自動範囲を使用するか、対象の検体が溶出する数分で保持時間の範囲を定義します。
- 前駆体m/z -オートレンジを使用するか、または適切な場合に複数の荷電化合物の可能性を含め、検体の対象クラスのm/z範囲を定義します。
- m/z公差-MSinstrument の達成可能な MS/ms 質量精度を入力します。0.01 m/z または 3.0 ppm は、Orbitrap プラットフォームに適しています。診断製品イオンのみが調査される場合、入力0.0は診断ニュートラル損失値 (Da)オプションになります。逆に、診断的なニュートラル損失のみが調査される場合、入力0.0は診断製品のイオン (m/z)オプションになります。
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診断製品イオン (m/z) –クラス固有の製品イオン (s) m/zを入力します。複数の製品イオンをコンマで区切ってください。
注: 複数の製品イオンを入力すると、記載されているすべての製品イオンを含むスペクトルが可視化されます。 -
診断ニュートラル損失値 (Da) –クラス固有のニュートラル損失 (es) を入力します。複数のニュートラル損失をカンマで区切ります。
注: 複数のニュートラル損失を入力すると、リストにあるすべてのニュートラル損失を含むスペクトルが視覚化されます。診断製品のイオンと中性の損失の両方を入力すると、すべての基準を満たすスペクトルが可視化されます。 - 最小診断イオン強度 (% ベースピーク) – MS/ms スペクトルのベースピークの% として、診断生成物のイオンおよび/または中性損失に対する最小強度を考慮することを規定する。
- Peaklist 出力ファイル-結果を出力するためのパスとファイル名を選択します。
- [ OK ] ボタンをクリックして、DFF 解析を開始します。上記の手順を正常に完了すると、DFF プロットが表示されます
注: 2 つの .csv データファイルが生成されます。{Peaklist 出力ファイル}. csvには、スキャンの前駆体m/z、スキャン番号、保持時間が含まれています。これは、 生データ方式 > ピーク検出 > 目標ピーク検出などの既存の MZmine モジュールで使用して、定義された DFF 基準を満たす前駆体の抽出イオンクロマトグラムを生成することができます。{Peaklist 出力ファイル} _dataには、前駆体m/z、製品イオンm/z 、保持時間が含まれており、MZmine の外側に DFF プロットを生成することができます。
3. ミクロシスチン分析に DFF の使用例
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サンプル調製
- 滅菌 MA 培地17またはその他のシアノバクテリアの成長培地 (BG-11) の三角を含む 250 mL の滅菌フラスコを、発泡ストッパーを装着して殺菌する。
- 無菌状態の下で約5× 105細胞の mL-1に、シアノバクテリアの培養で滅菌された成長培地を接種する。血球計数器でセル密度を監視します。この例では、CPCC300 photoautotrophically 27 ° c で、12 h の光を使用して、涼しい白色の蛍光灯 (30μE M-2 s-1) で照らされています。 12 h 暗レジーム1日1回、旋回します。
- 47 mm 径 GF/C ガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを使用して、真空濾過によって26日後に培養培地から細胞を分離します。
- 14 mL 試験管で採取した細胞に 80% メタノール(aq) 3 ml を加えます。
- 渦とその後超音波処理は、それぞれ 30 s のシアノバクテリア細胞を含む試験管 (s) を測定します。試験管を-20 ° c で1時間保管します。試験管を室温に戻し、サンプルを15分間解凍します。
- セルを効果的に溶解するために、さらに2回3.1.5 手順を繰り返します。
- 得られたシアノバクテリア細胞抽出物を0.22 μ m PTFE シリンジフィルター (s) を通して濾過する。
- 穏やかな窒素ガスの流れを使用して、30° c の温度で蒸発器を有する乾燥エキス (s)。抽出液を-20 ° c の状態で LC-MS/MS 分析まで保存します。
- 乾燥した残渣を500μ l の 90% メタノール(aq)で再構成し、分析前にアンバー HPLC バイアルで30秒間渦流する。
- 高分解能質量分析計における DDA の取得方法を用いて、シアノバクテリアの抽出物を分析します。
注: ここで使用する MC 分析のために最適化された LC-MS 条件は、「材料表」に記載しています。 - DDA の MZmine を準備し、次のステップ1.1 および1.2 にインポートします。
- データファイルを選択し、手順2.1 から2.2 に従って DFF モジュールを開始してください。
- MC 解析では、DFF モジュール内の以下の設定を使用します (図 3)。
- 保持時間– 2.00の範囲を6.00分に入力します。
- 前駆体m/z - 430.00のm/z範囲を1200.00に入力します。
- m/z公差- 0.01 m/z または3.0 ppm のm/z 公差を適用します。
- 診断製品イオン (m/z) –診断製品のイオンとしての135.0803、163.1114の入力m/z
- 診断中立損失値 (Da) –診断中立損失が使用されていないことを定義するための入力0.0 。
- 最小診断イオン強度 (% ベースピーク) –最小強度閾値として15.00を使用
- Peaklist 出力ファイル-出力ファイルをputative_MCsとして定義します。
- [ OK ] ボタンをクリックして、DFF 解析を開始します。上記の手順を正常に完了すると、DFF プロット (図 4) が表示されます
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Representative Results
CPCC300 の分析に従って生成された DFF プロットを図 4に示します。このプロットのx軸は、定義された DFF 基準を満たした前駆体イオンのm/zであり、 y軸は MCs MS/MS スペクトル内の全製品イオンのm/zを示しています。この分析では、MC 検出のための基準には、440-1200 のm/z範囲内の前駆体イオンが含まれ、保存時間は2.00 〜6.00 分であった。最も重要なこととして、これらの MS/MS スペクトルには、定義された 15% の basepeak 強度閾値を超えるm/z 135.0803 と 163.1114 (± 3 ppm) の両方が含まれています。これらの条件下で、LC-MS/MS DDA の分析中に合計4116の MS/MS スペクトルが取得されました。それらのうち、DFF 基準を満足した26個のスペクトルが、CPCC300 抽出物中で検出された。しかし、同じ化合物、特に高強度のイオンに対しては、複数の MS/MS スペクトルを取得することができます。この抽出物では、18個のユニークな前駆体m/zのみが見出された。最小イオン (m/z 497.2746、[m + 2h]2 +) は、DFF によっても検出された [m + H]+前駆体m/z 993.5389 の二重に帯電した補数です。このm. 膿菌歪み18に関する以前に発表された研究に基づいて、検出された主要な MCS は mc-lr および [D-Asp3] mc-lr として確実に割り当てることができる。残りの推定 MCs のマススペクトルを調べると、2つは検出された他の MCs (m/z 993.5389、1025.5343) の13C 同位体と、 m/z 993.5389 の付加物と MC であったことが明らかになった。残りの12個の推定 MCs のうち、4つは既知の MCs の質量に対応し、8は以前は報告されていなかった化合物 (補足ファイルであった。表 S1)。
図 1: MC-LR の化学構造Adda 残基は、既知の MCs の大部分で一般的であり、 m/z 135.0803 および163.1114 で診断製品イオンを生成する。5位に Adda と acetyldemethyl Adda 残基を含む他の MC 変異体は、同一の製品イオンを産生しないことが知られている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: MC-LR の ms/ms スペクトルMS/MS スペクトルは、Adda 残基に由来するm/z 135.0803 で顕著な製品イオンを示す Orbitrap 質量分析計上で得られた。また、 m/z 163.1114 における追加の製品イオンは、Adda 残基に由来し、DFF 分析の選択性を増大させる。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: MZmine 内の DFF ダイアログボックス対象となる化合物クラスの診断である製品イオンおよび/または中性損失が入力されます。保持時間および前駆体イオンフィルターは、分析の選択性を高めるために使用することができる。最小診断イオン強度とは、スペクトルが DFF 基準を満たすために達成されなければならない診断製品イオンの閾値強度および中性損失を指す。この値を下げると、偽陽性のヒットが発生する可能性があります。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: m. 膿細胞抽出物の MC 分析のための DFF プロット。CPCC300 抽出物の DFF 分析は、定義された DFF 基準を満たす26のスペクトルを発見し、18個のユニークなM/z値を含む。プロットを右クリックすると、ユーザーはドメインや範囲軸を「縮小」することができます。ダブルチャージされた前駆体イオンをm/z 497.2746 で検出し、未知の MC に [m + H]+ 993.5389 で対応した。ひずみ CPCC300 によって生成される2つの知られている MCs は [D-Asp3] MC-LR および MC-lr 18である。合計で、8つの推定 Mc は、既知の MCs のm/zに対応していなかったが、4個の mcs は複数の同族体のm/zに相当し、3つは他の mcs の同位体/付加体 (補足ファイル) であることが判明した。表 S1)。 ここに示す DFF プロットは、DFF モジュールの実行時に自動的に行われた"putative_MCs_data"から Excel で手動で生成されました。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル。M. 膿菌抽出物の LC-MS/MS 分析のための最適化された条件。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DFF は、化合物のクラス全体を検出するための簡単で迅速な戦略で、特に天然物の化合物の発見に関連しています。DFF の最も重要な側面は、対象となる化合物クラスの特定の MS/MS フラグメンテーションの基準を定義することです。この代表例では、DFF は、 m. 膿菌細胞抽出物中に存在する MCs を含むすべての Adda 残基を検出するために使用した。MCs の大半は Adda 残留物を含んでいるが、この位置にある他の残基は知られているが、特にデメチル-および acetyldemethyl-Adda 変異体19である。これらの残基を持つ MCs は、定義された基準を使用して検出されません。ただし、DFF は取得後のアプローチであるため、ここで概説されている簡単なステップバイステッププロトコルを使用して、同じデータセットで追加の診断フラグメントを簡単に調査できます。また、これにより、診断製品のイオンおよび/または中性損失を変化させる架空の修飾を含む化合物を検出することができます。
付加およびソース断片はまた、DFF 基準を満たしており、誤ってユニークな検体として解釈されることがあります。抽出物中に存在する他の化合物が同じ製品イオンおよび/または中性損失を呈する場合には偽陽性が生じることがある。どちらの場合も、これは、追加の製品イオンと方法選択性を高める中性損失を使用することによって緩和することができます。
前駆体イオンは、アナリストによって定義されたすべての DFF 基準を満たし、対象クラス内の化合物を表すことができるが、その絶対的な同一性は依然として推定される。Schymanski (2014) によって提案された識別信頼水準を使用して、この MS/MS アプローチを用いて検出した MCs は、正確な質量と同位体によって前駆体イオンのはっきりした分子式を割り当てることができる場合、「レベル3」識別信頼を有するプロファイル20. この例では、8つの推定 MCs は、複数のアイソバリック MCs11に対応する質量を有していた。絶対同一性は、保持時間と MS/MS スペクトルを真正な基準で比較するか、または精製後に NMR および他の分光法によって確認されたものである。ここで検出された8つの推定 MCs など、対象となるクラスの既知のメンバーの質量に対応しない推定化合物は、新しい天然物を発見するための具体的な目標を表しています。
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Disclosures
著者は何も開示することはありません
Acknowledgments
著者たちは、Roshon (カナダ林内藻類相文化センター、ウォータールー大学で、研究しているシアノバクテリアの文化を提供し、Sawsan Abusharkh (カールトン大学) の技術支援に感謝した。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cyanobacteria | |||
Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
Software | |||
Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
LC-MS | |||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
Solvents | |||
Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
Other | |||
Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
Media | |||
MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
P(IV) metal solution, 5 mL | |||
Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).