Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

גילוי מוצר טבעי עם סינון פיצול LC-MS/MS: בקשה ניתוח Microcystin

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 2
1Department of Chemistry, Carleton University Ottawa, 2London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

סינון פיצול אבחון, מיושם לתוך MZmine, היא גישה אלגנטית, לאחר הרכישה למסך LC-MS/MS datasets עבור מחלקות שלמות של מוצרים טבעיים ידועים ולא ידועים. כלי זה מחפש את MS/MS ספקטרום עבור יוני מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים כי האנליסט הגדיר כאבחון עבור המחלקה כולה של תרכובות.

Abstract

מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית, ולא מתחם אחד. בשל תכונות מבניות נפוצות שלהם, תרכובות רבות בתוך אותה מחלקה עוברים פיצול MS/MS דומה ויש להם כמה יונים מוצר זהה ו/או הפסדים ניטרליים. המטרה של סינון פיצול אבחון (DFF) היא לזהות ביעילות את כל התרכובות של מחלקה נתונה בתמצית מורכבת על-ידי הקרנת מערכות נתונים מסוג LC-MS/MS לצורך הגדרת מערך MS/ms, המכילות יוני מוצרים ספציפיים למחלקה ו/או הפסדים ניטרליים. שיטה זו מבוססת על מודול DFF מיושם בתוך פלטפורמת MZmine מקור פתוח הדורש תמציות לדוגמה להיות מנותח על ידי רכישה תלוי נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כגון אוריוראפ פי ארבעה או מאסה פי ארבעה של הטיסה. אנלייזרים. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שהאנליסט חייב להגדיר תחילה אילו יוני מוצר ו/או הפסדים ניטרליים הם ספציפיים למעמד היעד של מוצרים טבעיים. DFF מאפשר את הגילוי הבא של כל המוצרים הטבעיים הקשורים במדגם מורכב, כולל תרכובות חדשות. בעבודה זו, אנו מדגימים את האפקטיביות של dff על ידי הקרנת תמציות של מיקרוקילף aeruginosa, בולט פריחת אצות בולטים מזיקים גרימת חיידקים, לייצור של microcystins.

Introduction

טנדם המסה (MS/MS) היא בשימוש נרחב ספקטרומטר מסה שיטה הכוללת בידוד יון מקודמת וגורם לפיצול באמצעות יישום של אנרגיה הפעלה כגון התנגשות המושרה (CID)1. האופן שבו שברי יונים מקושרים בצורה אינטימית למבנה המולקולרי שלו. מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית ולא כמו כימיקל יחיד ייחודי2. ככאלה, תרכובות קשורות מבנית המהווים חלק מאותה מחלקה biosynthetic לעתים קרובות לשתף מאפיינים מרכזיים MS/MS הפיצול, כולל יוני מוצרים משותפים ו/או הפסדים ניטרליים. היכולת להקרין דגימות מורכבות עבור תרכובות בעלות יוני מוצר ספציפיים לכיתה ו/או הפסדים ניטרליים היא אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לזהות מחלקות שלמות של תרכובות, שעשויות להוביל לגילוי של מוצרים טבעיים חדשים3, ד , מיכל 5 , 6. במשך עשרות שנים, שיטות ספקטרומטר המסה כגון סריקת הפסד נייטרלי וסריקת יון מקודמות שבוצעו על מכשירים ברזולוציה נמוכה אפשרה יונים עם הפסד נייטרלי או יוני מוצר זהים להתגלות. עם זאת, היונים או המעברים הספציפיים הנחוצים להגדרה לפני ביצוע הניסויים. כאשר ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה הפכו לפופולריים יותר במעבדות מחקר, דוגמאות מורכבות מוקרן כעת בדרך כלל באמצעות שיטות רכישה לא ממוקדות ותלויות נתונים. בניגוד לאובדן נייטרלי מסורתי סריקת יון מקודמן, תרכובות קשורות מבנית ניתן לזהות על ידי ניתוח לאחר הרכישה7. בעבודה זו, אנו מוכיחים אסטרטגיה שפיתחנו לסנן פיצול אבחון (dff)5,6, ישר קדימה וידידותי למשתמש גישה לזהות מחלקות שלמות של תרכובות בתוך מטריצות מורכבות. מודול DFF זה כבר יושם לתוך מקור פתוח, MZmine 2 פלטפורמת והוא זמין על ידי הורדת MZmine 2.38 או מהדורות חדשות יותר. DFF מאפשר למשתמשים למסך ביעילות את מערכות הנתונים של ד. א. ל. (MS/MS ספקטרה המכילים את יון מוצר (ים) ו/או הפסד נייטרלי (es) כי הם אבחון עבור כיתות שלמות של תרכובות. מגבלה של DFF הוא יונים אופייניים מוצר ו/או הפסדים ניטרליים עבור מחלקה של תרכובות חייב להיות מוגדר על ידי האנליסט.

לדוגמה, כל אחד יותר מ 60 שונים של fumonisin פטרת מזוהה8,9 בעלי שרשרת של tricarballylic אשר יוצר m/z 157.0142 (C6H5O5-) מוצר יון על פיצול של [M-H]- יון4. לכן, כל pumonisins במדגם ניתן לזהות באמצעות DFF על ידי הקרנת כל MS/MS ספקטרום בתוך ערכת נתונים של לוד המכילים את הבולטים m/z 157.0142 המוצר יון. באופן דומה, תרכובות sulfated ניתן להבחין על ידי הקרנת מגדיר הנתונים של דה לטרשת נפוצה/ms המכילים אובדן ניטרלי אבחון של 79.9574 Da (SO3)3. גישה זו גם הוחל בהצלחה לגילוי חדש פפטידים מחזורי5 ומוצרים טבעיים המכילים טריפטופן או שאריות פנילאלטין6.

כדי להדגים את האפקטיביות של DFF ואת קלות השימוש שלה בתוך פלטפורמת MZmine10, החלתי גישה זו לניתוח microcystins (mcs); מחלקה של מעל 240 רעלים הקשורים מבחינה מבנית המיוצר על ידי כחוליות מים מתוקים11,12,13.

מרבית הרעלים שדווחו הם MCs, עם MC-LR (לאוצין [L]/arginine [R]) congener לרוב למדו (איור 1). מחשבי MCs הם מונלוציציתיים שאינם הריבוזומפיים, ביוסינתזה על ידי מספר סייאובקטריה כולל מיקרוצילסטיס, אננינה, Nostoc, ו- plankto,12. מחשבי MCs מורכבים מחמישה שאריות משותפים ושני תנוחות משתנה שנכבשו על ידי חומצות אמינו. כמעט כל MCs בעלי מאפיין β-אמינו חומצה 3-אמינו-9-מתיונין-2, 6, 8-triמתיק-10-פנילdeca-4, 6-חומצה dienoic (Adda) שאריות בעמדה 511.  משעולים הפיצול ms/ms של mcs מתוארים היטב14,15; שאריות adda אחראי יון מוצר ms/ms בולטים, m/z 135.0803+ (C9H11O+) כמו גם יוני מוצרים אחרים כולל m/z 163.1114+ (C11H15 O+) (איור 2). לא ממוקד הנתונים של מערכת המידע הנייד של מיקרוצילף שניתן להציג עבור כל microcystins הנמצאים באמצעות יוני אבחון אלה, והעניק כי המיקרוcystins יש שאריות adda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת כרומטוגרפיה בלתי ממוקדת (LC)-ערכות נתונים MS/MS

הערה: DFF ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ושיטה אנליטית ממוטבת עבור מחלקת היעד של האנליטים. התנאים של מיטוב LC-MS/MS על ספקטרומטר המסה של אורדרראפ מפורטים בטבלת החומרים.

  1. הורדת MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    הערה: נתונים לדוגמה CPCC300. raw ניתן למצוא ב-https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. תחת התפריט הנפתח שיטות נתונים גולמיים , בחר באפשרות ייבוא נתונים גולמיים .
    2. בחר את קבצי הנתונים שיש לנתח. ניתן לייבא קבצים בודדים או מרובים.
  2. אופציונלי אם תבנית נתוני הספק אינה נתמכת על-ידי MZmine, השתמש ב-פרוטרוביזארד16 כדי ליצור קבצי נתונים centroided. mzmine.
    1. בחר במסנן ' מרב האיסוף ' כדי להחיל אלגוריתם מבני מרחב המסופק על-ידי הספק.

2. סינון פיצול אבחון של קובצי הדה המיובאים

  1. באמצעות הסמן, בחר וסמן את קבצי הנתונים בעמודת קבצי הנתונים הגולמיים של מסך MZmine הראשי.
  2. תחת התפריט הנפתח החזותי , בחר באפשרות סינון פיצול אבחון .
  3. בתיבת הדו DFF המופיעה (איור 3), הקלט את האפשרויות הבאות:
    1. זמן שמירה – השתמש בטווח אוטומטי או הגדר את טווח זמני השמירה בדקות שבהן המחלקה הייעודית של האנליטים תהיה בסדר.
    2. שימוש בטווח אוטומטי m/z להשתמש או להגדיר את טווח m/z של מחלקת היעד של האנליטים, כולל האפשרות של תרכובות טעונה מרובים בעת הצורך.
    3. m/z סובלנות – להזין את הדיוק של MS/ms השגה המוני של MSinstrument; 0.01 מ'/ת' או 3.0 ppm מתאים לפלטפורמת אורדרראפ. אם רק יוני מוצרים אבחוניים ייחקרו, קלט 0.0 לתוך האפשרות האבחונית (Da) של אבחון הפסד נייטרלי . לעומת זאת, אם הפסדים מסוימים בלבד לא ייבדקו, הקלט 0.0 לתוך האפשרות של יוני מוצר האבחון (m/z) .
    4. יוני מוצרים אבחוניים (m/z) -קלט את יון המוצרים הספציפי (עם) m/zשל המחלקה. הפרד בין יוני מוצרים מרובים באמצעות פסיק.
      הערה: הזנת יוני מוצרים מרובים ידמיינו את הספקטרום המכיל את כל יוני המוצרים המפורטים.
    5. ערך הרזיה נייטרלי (Da) – קלט הפסד נייטרלי מסוים (es). הפרד בין הפסדים ניטרליים מרובים באמצעות פסיק.
      הערה: הזנת הפסדים ניטרליים מרובים תדמיין את הספקטרום המכיל את כל ההפסדים הניטרליים המפורטים. הזנת יוני מוצר אבחון והפסדים נייטרליים יהיה להמחיש ספקטרום שיספק את כל הקריטריונים.
    6. עוצמת יון אבחונית מינימלית (% בסיס שיא) – כ-% מפסגת הבסיס של ספקטרום MS/ms, להגדיר את העוצמה המינימלית עבור יוני מוצר אבחון ו/או הפסדים ניטרליים להיחשב.
    7. Peaklist קובץ פלט – בחר נתיב ושם קובץ כדי להפיק את התוצאות.
    8. לחץ על אישור לחצן כדי להפעיל את ניתוח dff. העלילה DFF תופיע על השלמת השלבים לעיל בהצלחה
      הערה: קבצי נתונים משני. csv ייווצרו. {קובץ הפלט של Peaklist}. csv מכיל את המספרים המקודטים של m/z, מספרי הסריקה ושעות השמירה של הסריקות. זה יכול לשמש מודולים MZmine הקיים כולל שיטות נתונים גולמיים ≫ זיהוי שיא ≫ ממוקד לזיהוי השיא כדי ליצור כרומטוגרמות ion שחולצו של סמנים שנתקלו בקריטריוני dff המוגדרים. {קובץ הפלט של Peaklist} _ data. csv מכיל את ה- m/zהקודמן, המוצר יון /ת' וזמני השמירה כדי לאפשר יצירה של חלקות Dff מחוץ ל-mzmine.

3. שימוש לדוגמה ב-DFF לניתוח microcystin

  1. הכנה לדוגמא
    1. לחטא 250 mL מבחנות erlenmeyer אייר המכיל 30 מ ל של מדיה סטרילית של MA17 או אחרים מדיה הצמיחה כחוליות (BG-11) מצויד בפקק קצף.
    2. איחסן מדיה הצמיחה מעוקר עם התרבות הציאנקטריה כ 5 × 105 תאים mL-1 תחת תנאים אספטי. הצג את צפיפות התאים עם הדימום. בדוגמה זו, לגדול M. aeruginosa זן CPCC300 פוטואוטוטרופי ב 27 ° c, מואר עם אור פלורסנט לבן קריר (30 μe M-2 s-1) באמצעות אור 12 h: 12 h כהה המשטר. מערבולת את התאים פעם ביום.
    3. הפרד את התאים מתוך מדיום התרבות לאחר 26 ימים על ידי סינון ואקום באמצעות 47 מילימטר בקוטר GF/C מיקרופייבר מטלית זכוכית.
    4. הוסף 3 מ"ל של 80% מתנול (aq) לתאים שנקטפו 14 מ ל שפופרת בדיקה (s).
    5. מערבולת ולאחר מכן sonicate את שפופרת הבדיקה (עם) המכילים תאי כחוליות עבור 30 s כל אחד. אחסן את שפופרת הבדיקה ב-20 ° c עבור 1 h. החזר את צינורית הבדיקה לטמפרטורת החדר ואפשר למדגם (ים) להפשיר במשך 15 דקות.
    6. חזור על השלב 3.1.5 שתי פעמים נוספות כדי לשחזר ביעילות את התאים.
    7. לסנן את התמצית כתוצאה מהחיידקים (ים) באמצעות מסנני 0.22 יקרומטר (s).
    8. תמצית יבש (ים) עם מאייד בטמפרטורה של 30 ° צ' באמצעות זרם עדין של גז חנקן. אחסן את התמצית יבש ב-20 ° c עד לניתוח LC-MS/MS.
    9. מרכיבים מחדש את שאריות יבשים עם 500 μL של 90% מתנול (aq) ו מערבולת עבור 30 בקבוקון כתום ענבר לפני ניתוח.
  2. באמצעות שיטת רכישה. ברזולוציה גבוהה של ספקטרומטר מסה
    הערה: תנאי LC-MS אופטימיזציה עבור ניתוח MC משמש כאן מפורטים בטבלה של חומרים.
  3. הכן את ה-datafile (s) ויבא לתוך MZmine בעקבות שלבים 1.1 ו-1.2.
  4. בחר את datafiles והפעל את מודולי DFF בעקבות השלבים 2.1-2.2.
  5. עבור ניתוח MC, השתמש בהגדרות הבאות בתוך מודול DFF (איור 3).
    1. זמן השמירה – הקלט את הטווח של 2.00 עד 6.00 דקות.
    2. מקודמן m/z – טווח קלט m/z של 430.00 עד 1200.00.
    3. m/z סובלנות – החל את הסובלנות m/z של 0.01 m/z או 3.0 ppm.
    4. יוני מוצרים אבחוניים (m/z) – קלט m/z של 135.0803, 163.1114 כיוני מוצרים אבחוניים
    5. ערך הרזיה נייטרלי (Da) – קלט 0.0 כדי להגדיר כי לא נעשה שימוש בהפסדים ניטרליים לאבחון.
    6. עוצמת יון אבחונית מינימלית (% בסיס שיא) – שימוש 15.00 כסף האינטנסיביות המינימלי
    7. Peaklist קובץ הפלט – להגדיר את קובץ הפלט כמו putative_MCs. csv.
  6. לחץ על אישור לחצן כדי להפעיל את ניתוח dff. מגרש DFF (איור 4) יופיע על השלמת השלבים לעיל בהצלחה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העלילה DFF שנוצרה לאחר ניתוח של M. aeruginosa CPCC300 מוצג באיור 4. ציר ה-xשל מחלקה זו הוא m/z של היונים המקודרים המביעות את קריטריוני ה-dff המוגדרים כאשר ציר ה- yמציג את ה- m/z של כל יוני המוצרים בתוך ספקטרום ה-mcs ms/ms. עבור ניתוח זה, הקריטריונים של זיהוי ה-MC כללו יונים מקודמן בתוך טווח m/z של 440-1200, זמני שמירה בין 2.00 – 6.00 min. והכי חשוב, ספקטרום MS/MS זה מכיל הן m/z 135.0803 ו 163.1114 (± 3 דפים לדקה) מעל הסף המוגדר 15% בסיס שיא העוצמה. בתנאים אלה, סך של 4116 MS/MS ספקטרום נרכשו במהלך הניתוח LC-MS/MS אדה. של אלה, 26 ספקטרה מרוצה את הקריטריונים DFF זוהו בתמצית M. aeruginosa CPCC300. עם זאת, ספקטרום MS/MS מרובים ניתן לרכוש באותו מתחם, במיוחד עבור יונים בעוצמה גבוהה יותר. בתמצית זו, נמצאו רק 18 הקודמן הייחודי m/z . יון הקטן ביותר (m/z 497.2746, [m + 2h]2 +) הוא המשלים כפליים של [m + h]+ קודמן m/z 993.5389, אשר זוהה גם על ידי dff. בהתבסס על מחקרים שפורסמו בעבר על מאמץ מסוג M. aeruginosa 18, זיהה את mcs העיקריים ניתן להקצות בביטחון כמו MC-lr ו [D-Asp3] MC-lr. חקירת הספקטרום ההמוני של מחשבי ה-MCs הנותרים חשפו כי שניים היו 13C איזוטופים של mcs שזוהו אחרים (m/z 993.5389, 1025.5343) ועוד אחד היה האדקט של ו-MC של m/z 993.5389. מתוך 12 המירכזים הנותרים, ארבעה התכתב עם ההמונים המוכרים של MCs, ושמונה היו תרכובות שלא דווחו בעבר (קובץ משלים. טבלת S1).

Figure 1
איור 1: המבנה הכימי של MC-LR. שאריות Adda נפוץ בחלק גדול של MCs ידוע ומייצרת יונים מוצר אבחון ב m/z 135.0803 ו 163.1114. משתני MC אחרים המכילים שאריות דימתיל-Adda ו-acetyldemethyl-Adda במיקום 5 ידועים ולא ייצרו את אותם יונים של מוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ms/ms ספקטרום של MC-LR. MS/MS ספקטרום נרכש על ספקטרומטר המסה של אורדרראפ המציג את יון המוצר הבולט ב- m/z 135.0803 נגזר משאריות adda. יון מוצרים נוסף ב- m/z 163.1114 נגזר גם משאריות adda ומגדיל את הסלקטיביות של ניתוח dff. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תיבת הדיאלוג של DFF בתוך MZmine. יוני המוצרים ו/או הפסדים ניטרליים המיועדים לאבחון מחלקת היעד של התרכובות, אינם מוספים. ניתן להשתמש בזמן השמירה ובמסנני יון מקודמי כדי להגדיל את הסלקטיביות של הניתוח. עוצמת יון האבחנה המינימלית מתייחסת לעוצמת הסף של יוני האבחון וההפסדים הניטרליים שיש להשיג כדי שהספקטרום יוכל לספק את קריטריוני DFF. הפחתת ערך זה עלולה לגרום לפגיעות חיוביות כוזבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מגרש DFF לניתוח של M. aeruginosa של תמצית הסלולר. Dff ניתוח של התמצית M. aeruginosa CPCC300 נמצא 26 ספקטרום שנפגשו קריטריונים dff הגדיר, המורכב 18 ערכי M/z ייחודי. לחיצה ימנית על העלילה מאפשרת למשתמש "להקטין את הגודל" של התחום ו/או את צירי הטווח. יון כפול טעון כפליים זוהה ב m/z 497.2746 והתכתב MC לא ידוע ב [m + H]+ 993.5389. שני המוכרים MCs המיוצר על ידי זן CPCC300 הם [D-Asp3] MC-lr ו-MC-lr 18. בסך הכל, שמונה מחשבי mcs לא התכתב עם m/z של mcs ידוע, ארבעה mcs התכתב עם m/z של congeners מרובים ושלושה נמצאו איזוטופים/Adducts של Mcs אחרים (קובץ משלים. טבלת S1).  ההתוויה של DFF המוצגת כאן נוצרה באופן ידני ב-Excel מ- "putative_MCs_data. csv" שבוצעו באופן אוטומטי בעת ביצוע מודול dff. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים. תנאים ממוטבים עבור ניתוח LC-MS/MS של תמציות aeruginosa. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DFF היא אסטרטגיה ישר-קדימה ומהירה לזיהוי מחלקות שלמות של תרכובות, רלוונטיות במיוחד עבור גילוי מתחם טבעי מוצר. ההיבט החשוב ביותר של DFF הוא הגדרת קריטריונים ספציפיים MS/MS הפיצול עבור המעמד המיועד של תרכובות. בדוגמה זו, השתמשו ב-DFF כדי לאתר את כל שאריות Adda המכילים מחשבי MCs בתמצית סלולרית של M. aeruginosa . למרות שהרוב המכריע של MCs מכילים שאריות Adda, שאריות אחרים בעמדה זו ידועים, בעיקר deמתיל ו-acetyldemethyl-Adda משתנים19. כל MCs עם שאריות אלה לא יזוהו באמצעות הקריטריונים שהוגדרו. עם זאת, כמו DFF היא גישה לאחר הרכישה, קטעי אבחון נוספים ניתן לחקור בקלות על אותה ערכת נתונים באמצעות פרוטוקול צעד אחר צעד פשוט המתואר כאן. זה גם מאפשר לאנליסט לזהות תרכובות עם שינויים היפותטי שישנה את יוני מוצר אבחון ו/או הפסד נייטרלי.

שברי adducts ו-in-source עשויים גם לעמוד בקריטריונים DFF ולהתפרש באופן שגוי כאנליטים ייחודיים. תוצאות חיוביות כוזבות עלולות להתעורר כאשר תרכובות אחרות הקיימות בתמצית מציגות את אותם יונים מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים. בשני המקרים, ניתן להקל על זה באמצעות יוני מוצרים נוספים והפסדים ניטרליים המגבירים את שיטת הסלקטיביות.

למרות שיוני הקודמן יכולים לעמוד בכל הקריטריונים של DFF שהוגדרו על-ידי האנליסט ולייצג תרכובות בתוך המעמד המיועד, הזהות המוחלטת שלהם עדיין תהיה מפויית. באמצעות האמון רמות זיהוי, המוצעים על ידי Schymanski (2014), MCs זיהה באמצעות זו גישה MS/MS יש ביטחון זיהוי ברמה 3 כאשר נוסחה מולקולרית מדויק של יון מקודמן ניתן להקצות על ידי מסה מדויקת ואיזוטופ . פרופיל20  בדוגמה זו, לשמונה מחשבי מדעי העבר היו מיסות שתאמו למספר רב של מחשבי MCs11. זהות מוחלטת היה מושגת על ידי השוואה של זמן ההחזקה ו MS/MS ספקטרום עם תקן אותנטי או אישר על ידי NMR ושיטות אחרות ספקטרוסקופיות לאחר הטיהור. תרכובות שאינן מתאימות לגושים של כל חברי מחלקת היעד, כגון שמונה מחשבי ה-MCs שזוהו כאן, מייצגים מטרות מוחשיות לגילוי מוצרים טבעיים חדשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

המחברים מודים הת רושון (מרכז התרבות Phycological הקנדי, אוניברסיטת ווטרלו על מתן התרבות הקיבקקטריה למד וסורסאן אבושרף (אוניברסיטת קרפלטון) לקבלת סיוע טכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300 CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE CPCC300 https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software) software http://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2 software http://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive Orbitrap Thermo - Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLC Agilent Equipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 column Agilent 959757-902 Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade Methanol Fisher A456-4
OptimaLC-MS grade Acetonitrile Fisher A955-4
OptimaLC-MS grade Water Fisher W6-4
LC-MS grade Formic Acid Fisher A11710X1-AMP
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21 Thermo Scientific 75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/caps Agilent 5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filters Pall Corp. 4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters Sigma-Aldrich WHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L) Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg Sigma-Aldrich C2786
KNO3, 100 mg Sigma-Aldrich P8291
NaNO3, 50 mg Sigma-Aldrich S5022
Na2SO4, 40 mg Sigma-Aldrich S5640
MgCl2·6H20, 50 mg Sigma-Aldrich M2393
Sodium glycerophosphate, 100 mg Sigma-Aldrich G9422
H3BO3, 20 mg Sigma-Aldrich B6768
Bicine, 500 mg Sigma-Aldrich RES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HO Sigma-Aldrich E6635
FeCl3 ·6H2O Sigma-Aldrich 236489
MnCl2·4H2O Baker 2540
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
Na2MoO4·2H2O Baker 3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution Sigma-Aldrich C3061-500mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
  2. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  3. Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
  4. Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
  5. Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
  6. Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
  7. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
  8. Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
  9. Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
  10. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
  11. Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
  12. Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
  13. Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
  14. Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
  15. Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
  16. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  17. Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
  18. Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
  19. Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
  20. Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).

Tags

כימיה גיליון 147 MZmine LC-MS/MS ניתוח ממוקד למחצה רכישה תלוית נתונים גילוי מוצר טבעי אורדרראפ מיקרוקינים
גילוי מוצר טבעי עם סינון פיצול LC-MS/MS: בקשה ניתוח Microcystin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullin, D. R., Hoogstra, S.,… More

McMullin, D. R., Hoogstra, S., McDonald, K. P., Sumarah, M. W., Renaud, J. B. Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis. J. Vis. Exp. (147), e59712, doi:10.3791/59712 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter