Summary
Die in MZmine implementierte Diagnostik-Fragmentierungsfilterung ist ein eleganter, nach der Übernahme eingesetzter Ansatz, um LC-MS/MS-Datensätze für ganze Klassen bekannter und unbekannter Naturprodukte zu überprüfen. Dieses Tool sucht MS/MS-Spektren nach Produkt-Ionen und/oder neutralen Verlusten, die der Analyst als diagnostisch für die gesamte Klasse von Verbindungen definiert hat.
Abstract
Natürliche Produkte werden oft als Mischungen strukturell ähnlicher Verbindungen und nicht als eine einzige Verbindung biosynthetisiert. Aufgrund ihrer gemeinsamen Strukturmerkmale durchlaufen viele Verbindungen innerhalb der gleichen Klasse eine ähnliche MS/MS-Fragmentierung und haben mehrere identische Produktideonen und/oder neutrale Verluste. Der Zweck der diagnostischen Fragmentierungsfilterung (DFF) ist es, alle Verbindungen einer bestimmten Klasse in einem komplexen Extrakt effizient zu erkennen, indem nicht gezielte LC-MS/MS-Datensätze für MS/MS-Spektren geprüft werden, die klassenspezifische Produktzionen und/oder neutrale Verluste enthalten. Diese Methode basiert auf einem DFF-Modul, das innerhalb der Open-Source-MZmine-Plattform implementiert wird und Probenextrakte durch datenabhängige Erfassung eines hochauflösenden Massenspektrometers wie Quadrupole Orbitrap oder Quadrupole Flugmasse analysiert. Analysatoren. Die Haupteinschränkung dieses Ansatzes ist, dass der Analyst zunächst definieren muss, welche Produktzionen and/oder neutrale Verluste spezifisch für die angestrebte Klasse von Naturprodukten sind. Die DFF ermöglicht die anschließende Entdeckung aller verwandten Naturprodukte innerhalb einer komplexen Probe, einschließlich neuer Verbindungen. In dieser Arbeit zeigen wir die Wirksamkeit der DFF, indem wir Extrakte von Microcystis aeruginosa, einer prominenten schädlichen Algenblüte, die Cyanobakterien verursacht, für die Herstellung von Mikrozystinen untersuchen.
Introduction
Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist eine weit verbreitete Massenspektrometrie-Methode, bei der ein Vorläuferion isoliert und durch die Anwendung von Aktivierungsenergie wie kollisionsbedingte Dissoziation (CID)1 eine Fragmentierung induziert wird. Die Art und Weise, wie ein Ionenfragmente eng mit seiner molekularen Struktur verbunden ist. Natürliche Produkte werden oft als Mischungen strukturell ähnlicher Verbindungen und nicht als eine einzige einzigartige Chemikalie2biosynthetisiert. Als solche teilen strukturell verwandte Verbindungen, die zur gleichen biosynthetischen Klasse gehören, oft wichtige MS/MS-Fragmentierungsmerkmale, einschließlich gemeinsamer Produktzionen und/oder neutraler Verluste. Die Fähigkeit, komplexe Proben auf Verbindungen zu untersuchen, die klassenspezifische Produkt-Ionen and/oder neutrale Verlustebesitzen, ist eine leistungsfähige Strategie, um ganze Klassen von Verbindungen zu erkennen, was möglicherweise zur Entdeckung neuer natürlicher Produkte führt 3, 4 , 5 , 6. Massenspektrometrie-Methoden wie das neutrale Verlustscannen und das Vorläuferkonten von Ionen, die auf Instrumenten mit niedriger Auflösung durchgeführt werden, lassen seit Jahrzehnten Ionen mit den gleichen neutralen Verlust-oder Produktzonen erkennen. Die spezifischen Ionen oder Übergänge mussten jedoch vor der Durchführung der Experimente definiert werden. Da hochauflösende Massenspektrometer in Forschungslabors immer beliebter geworden sind, werden komplexe Proben heute häufig mit nicht zielgerichteten, datenabhängigen Akquisitionsmethoden (DDA) untersucht. Im Gegensatz zum traditionellen neutralen Verlust-und Vorläuferkonten lassen sich durch die Nachbeschaffungsanalyse 7 strukturbezogene Verbindungenidentifizieren. In dieser Arbeit zeigen wir eine Strategie, die wir als diagnostische Fragmentierungsfilterung (DFF) 5, 6 entwickelthaben, einen geradlinigen und benutzerfreundlichen Ansatz, um ganze Verbindungen in komplexen Matrizen zu erkennen. Dieses DFF-Modul wurde in der Open-Source-Plattform MZmine 2 implementiert und ist über den Download von MZmine 2.38 oder neueren Versionen verfügbar. DFF ermöglicht es Nutzern, DDA-Datensätze für MS/MS-Spektren, die Produkt-Ionen (s) and/oder neutrale Verluste (es) enthalten, die für ganze Klassen von Verbindungen diagnostiziert sind, effizient zu durchsuchen. Eine Begrenzung der DFF sind charakteristische Produktideonen und/oder neutrale Verluste für eine Klasse von Verbindungen muss vom Analytiker definiert werden.
Zum Beispiel, jedes der mehr als 60 verschiedenen Fumonisin Mykotoxineidentifiziert 8,9besitzen eine trikarballylische Seitenkette,die ein m/157.0142 (C6H 5 O5-) Produkt-Ion erzeugt auf Fragmentierung der [M-H]-Ion 4. Daher können alle vermeintlichen Fumonisine einer Probe mit DFF durch das Screening aller MS/MS-Spektren in einem DDA-Datensatz, die das markante m/157.0142-Produkt enthalten, erkannt werden. In ähnlicher Weise können sulvated Verbindungen durch das Screening von DDA-Datensätzen auf MS/MS-Spektren, die einen diagnoseinen-neutralen Verlust von 79.9574 Da (SO3)3enthalten, nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde auch erfolgreich angewendet, um neue zyklische Peptide 5 und Naturprodukte zu entdecken, die Tryptophan oder Phenylalanin-Rückstände6 enthalten.
Um die Wirksamkeit der DFF und ihre Benutzerfreundlichkeit innerhalb der MZmine-Plattform10zu demonstrieren, haben wir diesen Ansatz bei der Analyse von Mikrozystinen (MCs) angewandt; Eine Klasse von über 240 strukturell verwandten Giftstoffen, die von Süßwassercyanobakterien11,12,13produziert werden.
Die am häufigsten gemeldeten Cyanotoxine sind MCs, wobei die MC-LR (Leucine [L]/Arginin [R]) kongener am häufigsten untersucht wird (Abbildung1). Die MCs sind monozyklische nicht-ribosomale Heptapeptide, biosynthetisiert durch mehrere Cyanobakterien-Gattungen , darunter Microcystis, Anabaena, Nostoc und Planktothrix12,13. Die MCs bestehen aus fünf gemeinsamen Rückständen und zwei variablen Positionen, die mit L-Aminosäuren belegtwerden. Fast alle MCs besitzen eine charakteristische β-Aminosäure 3amino-9-Methoxy-2, 6, 8-Trimethyl-10-Phenyldezen-4,6-Dieno-Säure (Adda) Rückstände an Position 511. Die MS/MS-Fragmentierungswege der MCs sindgut beschrieben 14,15; Die Adda-Reste sind verantwortlich für das prominente MS- /MS-Produkt Ion, m/135.0803+ (C 9 H 11 O+)sowie andere Produktzionen wie m/163.1114 + (C11H 15) . O+) (Abbildung 2). Mit diesen diagnostischen Ionen können nicht zielgerichtete DDA-Datensätze von Microcystis aeruginosa-Kellinextrakten für alle vorhandenen Mikrocystine untersucht werden, sofern die Mikrozystine eine Adda-Rückstände aufweisen.
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Protocol
1. Vorbereitung der nicht zielgerichteten Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS Datensätze
Hinweis: Die DFF kann mit jedem hochauflösenden Massenspektrometer und Analysemethode durchgeführt werden, die für eine Zielklasse von Analyten optimiert sind. MC-optimierte LC-MS/MS-Bedingungen auf Orbitrap-Massenspektrometer sind in der Materiallisteaufgeführt.
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Download von MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Hinweis: Beispieldaten CPCC300.raw finden Sie auf https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- Unter dem Drop-Down-Menü von Raw wählen Sie die Option " Raw-Datenimport ".
- Wählen Sie die zu analysierenden Daten aus. Einzelne oder mehrere Dateien können importiert werden.
- (Optional) Wenn das Datenformat des Anbieters nicht von MZmine unterstützt wird, verwenden Sie Proteowizard16 , um zentroidierte .mzmml-Dateien zu erzeugen.
- Wählen Sie den Peak Picking Filter, um den von Heranern gelieferten Zentroiding-Algorithmus anzuwenden.
2. Diagnostische Fragmentierung Filterung von importierten DDA-Dateien
- Mit dem Cursor wählen Sie die Datendatei (n) in der Spalte Raw-Dateien des Hauptbildschirms MZmine aus.
- Wählen Sie im Menü Visualisierung Drop-Down-Menü die Option Diagnostische Fragmentierung .
- In der DFF-Dialogbox, die erscheint (Abbildung 3), geben Sie folgende Optionen ein:
- Die Aufbewahrungszeit – die Auto-Reichweite verwenden oder den Bereich der Aufbewahrungszeiten in Minuten festlegen, in denen die angestrebte Klasse von Analyten ausläuft.
- Vorläufer m/-verwenden Sie den Autobereich oder definieren Sie den m/z-Bereich der angestrebten Klasse von Analyten, einschließlich der Möglichkeit für mehrere geladene Verbindungen, wenn es angebracht ist.
- m/z Toleranz – Die erreichbare MS/MS-Massengenauigkeit des MSinstruments einfügen; 0,01 m/oder 3.0 ppm ist für eine Orbitrap-Plattform geeignet. Wenn nur diagnostische Produkt-Ionen untersucht werden, Eingabe 0,0 in die Option Diagnostik-neutraler Verlustwert (Da) . Umgekehrt, wenn nur diagnostische neutrale Verluste untersucht werden, Eingabe 0,0 in die Option Diagnostik-Produkt Ionen (m/z) .
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Diagnostik-Produkt-Ionen (m/z) – geben Sie das klassenspezifische Produkt Ion (s) m/z. Trennen Sie mehrere Produkt-Ionen mit einem Komma.
Hinweis: Das Einfügen mehrerer Produkt-Ionen visualisiert Spektren, die alle aufgeführten Produkt-Ionen enthalten. -
Diagnostisch-neutraler Verlustwert (Da) – geben Sie den klassenspezifischen neutralen Verlust (es) ein. Trennen Sie mehrere neutrale Verluste mit einem Komma.
Hinweis: Die Einfügen mehrerer neutraler Verluste wird Spektren visualisieren, die alle aufgeführten neutralen Verluste enthalten. Die Eingabe von Diagnostik-Ionen und Neutralverlusten wird Spektren visualisieren, die alle Kriterien erfüllen. - Minimale diagnostische Ionenintensität (% Basisspitze) – Als% des Basisgipfels der MS/MS-Spektren, definieren Sie die minimale Intensität für diagnostische Produkt-Ionen and/oder neutrale Verluste zu berücksichtigen.
- Peaklist-Ausgabedatei – Wählen Sie einen Pfad und Dateinamen aus, um die Ergebnisse auszugeben.
- Klicken Sie auf den OK-Button, um die DFF-Analyse zu starten. Eine DFF-Plot erscheint nach erfolgreichem Abschluss der oben genannten Schritte
Hinweis: Es werden zwei .csv-Dateien erzeugt. {Peaklist output file} .csv contains the vorsor m/z, scan numbers, and Retentionszeiten of the scans. Dies kann in bestehenden MZmine-Modulen verwendet werden, einschließlich Rohdatenmethoden > Peak-Erkennung > gezielte Peak-Erkennung zur Erzeugung von extrahierten Ionenchromatogrammen von Vorläufern, die die definierten DFF-Kriterien erfüllten. {Peaklist output file} _ data.csv contains the preursor m/z, product ion m/z and Retentimes to allow generation of DFF-plots outside of MZmine.
3. Beispiel für die Mikrocystin-Analyse der DFF
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Probenvorbereitung
- Sterilisieren 250 mL Erlenmeyer-Flaschen, die 30 mL steriler MA-Medien 17 oder andere Cyanobakterien-Wachstumsmedien (BG-11) enthalten, die mit einem Schaumstopper ausgestattet sind.
- Sterilisierte Wachstumsmedien mit einer Cyanobakterien-Kultur auf etwa 5 × 105 Zellen mL-1 unter aseptischen Bedingungen. Die Zelldichte mit einem Hämozytometer überwachen. In diesem Beispiel wachsen M . aeruginosa Stamm CPCC300 photoautotrophisch bei 27 ° C, beleuchtet mit kühlem weißem Leuchtstofflicht (30 μE m-2 s-1 ) mit einem 12 h Licht: 12 h dunkles Regime. Wirbeln Sie die Zellen einmal täglich.
- Trennen Sie die Zellen nach 26 Tagen durch Vakuumfiltration durch Vakuumfiltration mit GF/C-Glasfaserfilterpapieren mit einem Durchmesser von 47 mm.
- Fügen Sie 3 ml 80% Methanol (aq) in 14 mL-Reagenzglas (n) zu den geernteten Zellen hinzu.
- Die Reagenzgläser, die Zyanobakterien-Zellen für jeweils 30 s enthalten, wirbel und anschließend sondieren. Bewahren Sie die Reagenzgläser bei-20 ° C für 1 Stunde auf.
- Wiederholungsschritt 3.1.5 zwei zusätzliche Male, um die Zellen effektiv zu lärmen.
- Filtern Sie die daraus resultierenden Cyanobakterien-Zellextrakte (n) durch einen 0,22 μm PTFE-Spritzenfilter (n).
- Trockenextrakt (n) mit einem Verdampfer bei einer Temperatur von 30 ° C mit einem sanften Strom von Stickstoffgas. Bewahren Sie den Extrakt trocken bei-20 ° C bis zur LC-MS/MS-Analyse.
- Die getrockneten Rückstände mit 500 μL von 90% Methanol (aq) und Wirbel für 30 s in einer Bernstein-HPLC-Vial vor der Analyse neu aufrichten.
- Analysieren Sie den Cyanobakterien-Extrakt mit einer DDA-Akquisitionsmethode auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.
Hinweis: Die hier verwendeten optimierten LC-MS-Bedingungen für die MC-Analyse sind in der Materialtabelleaufgeführt. - Bereiten Sie die DDA-Datafile vor und importieren Sie in MZmine nach den Schritten 1.1 und 1.2.
- Wählen Sie die Datenblätter aus und starten Sie die DFF-Module nach den Schritten 2.1-2.2.
- Für die MC-Analyse verwenden Sie die folgenden Einstellungen innerhalb des DFF-Moduls (Abbildung 3).
- Aufbewahrungszeit – Geben Sie die Reichweite von 2,00 bis 6.00 min ein.
- Vorläuferin m/– Input m/z-Bereich von 430,00 bis 1200.00.
- m/z Toleranz – Die Toleranztoleranz von 0,01 m/oder 3,0 ppm.
- Diagnostikprodukt-Ionen (m/z ) – Input m/@ @
- Diagnostisch-neutraler Verlustwert (Da) – Input 0.0 , um zu definieren, dass keine diagnostischen neutralen Verluste verwendet werden.
- Minimale Diagnostik-Ionenintensität (% Basisspitze ) – Verwendung 15,00 als Mindestintensitätsschwelle
- Peaklist-Ausgabedatei – Definieren Sie die Ausgabedatei als putative _ MCs.csv.
- Klicken Sie auf den OK-Button, um die DFF-Analyse zu starten. Eine DFF-Handlung (Abbildung 4) erscheint nach erfolgreichem Abschluss der oben genannten Schritte
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Representative Results
Das DFF-Grundstück, das nach der Analyse von M. aeruginoosa CPCC300 erstellt wurde, wird in Abbildung4 gezeigt. Die x-Achse dieses Diagramms ist das m/z der Vorläufer-Ionen, die die definiertenDFF-Kriterien erfüllt haben, während die y--Achse den m/z aller Produktzionen innerhalb der MCs MS/MS-Spektren zeigt. Für diese Analyse wurden Vorläufer-Ionen im m/Bereich von 440-1200, Aufbewahrungszeiten zwischen 2,00 – 6,00 min, zu den Kriterien für die MC-Erkennung. Am wichtigsten ist, dass diese MS/MS-Spektren sowohl m/z 135.0803 als auch 163,1114 (± 3 ppm) über der definierten 15% Grundlagenintensitätsschwelle liegen. Unter diesen Bedingungen wurden im Rahmen der LC-MS/MS-DDA-Analyse insgesamt 4116 MS/MS-Spektren erworben. Von diesen wurden 26 Spektren, die die DFF-Kriterien erfüllten, im M. Aeruginosa CPCC300-Extrakt nachgewiesen. Allerdings können mehrere MS/MS-Spektren auf der gleichen Verbindung erworben werden, insbesondere bei Ionen mit höherer Intensität. In diesem Auszug wurden nur 18 einzigartige Vorläufer m/z gefunden. Das kleinste Ion (m/497.2746, [M+2H] 2+)ist die doppelt aufgeladene Ergänzung des ebenfalls von der DFF entdeckten [M + H ] + Vorläufer m/993.5389. Auf der Grundlage bereits veröffentlichter Studien zu diesem M. Aeruginosa-Stamm 18können die wichtigsten festgestellten MCs getrost als MC-LR und [D-Asp3] MC-LR zugeordnet werden. Die Untersuchung der Massenspektren der verbleibenden putativen MCs ergab, dass zwei 13 C-Isotope anderer festgestellter MCs waren (m/993.5389, 1025.5343) und ein weiteres ein Addukt und MC von m/z 993.5389. Von den zwölf verbliebenen vermeintlichen MCs entsprachen vier den Massen bekannter MCs, und acht waren zuvor nicht gemeldete Verbindungen(Ergänzungsdatei). Tabelle S1).
Abbildung 1: Chemische Struktur von MC-LR. Die Adda-Rückstände sind in einem großen Teil der bekannten MCs weit verbreitet und produzieren diagnostische Produktikrankungen bei m/135.0803 und 163.1114. Andere MC-Varianten, die an Position 5 eine Dimethyl-Adda und eine Acetyldemethyl-Adda-Rückstände enthalten, sind bekannt und würden nicht die gleichen Produktzonen produzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: MS/MS Spektren von MC-LR. MS/MS-Spektren, die auf einem Orbitrap-Massenspektrometer erworben wurden, das das prominente Produkt-Ion bei m/135.0803 zeigt, das aus den Adda-Resten stammt. Ein zusätzliches Produkt-Ion bei m/163.1114 wird ebenfalls aus den Adda-Rückständen abgeleitet und erhöht die Selektivität der DFF-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: DFF-Dialogbox innerhalb der MZmine. Das Produkt Ionen and/oder neutrale Verluste, die für die angestrebte Klasse von Verbindungen diagnostiziert werden, werden eingegeben. Die Retentionszeit und Vorläuferionenfilter können verwendet werden, um die Selektivität der Analyse zu erhöhen. Die minimale diagnostische Ionenintensität bezieht die Schwellintensität der diagnostischen Produktikrankonen und neutrale Verluste, die erreicht werden müssen, damit die Spektren die DFF-Kriterien erfüllen. Eine Absenkung dieses Wertes kann zu falschen positiven Treffern führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: DFF-Plot zur MC-Analyse von M. aeruginoosaZellextrakt. Die DFF-Analyse des M. Aeruginosa CPCC300-Extrakts ergab 26 Spektren, die die definierten DFF-Kriterien erfüllten, die 18 einzigartige m/z-Werte umfassten. Mit einem Rechtsklick auf die Handlung kann der Benutzer die Domain and/oder die Bereichsachsen "auszoomen". Ein doppelt geladenes Vorläuferion wurde bei m/z 497.2746 festgestellt und entsprach einer unbekannten MC bei [M + H] + 993.5389. Die beiden bekannten MCs, die von der Sorte CPCC300 produziert werden, sind [D-Asp3] MC-LR und MC-LR 18. Insgesamt entsprachen acht putative MCs nicht dem m/z der bekannten MCs, vier MCs entsprachen dem m/z von mehreren Kongenern und drei wurden als isotopes/adducts anderer MCs (Zusatzdatei) festgestellt. Tabelle S1). Das hier gezeigte DFF-Diagramm wurde manuell in Excel aus dem "putative _ MCs _ data.csv" generiert, das automatisch bei der Ausführung des DFF-Moduls erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Zusatzdatei. Optimierte Bedingungen für die LC-MS/MS-Analyse von M. aeruginosa-Extrakten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die DFF ist eine einfache und schnelle Strategie zur Erkennung ganzer Klassen von Verbindungen, die insbesondere für die Entdeckung von Naturprodukten relevant sind. Der wichtigste Aspekt der DFF ist die Festlegung der spezifischen MS-MS-Fragmentierungskriterien für die angestrebte Klasse von Verbindungen. In diesem repräsentativen Beispiel wurde DFF verwendet, um alle Adda-Reste zu erkennen, die MCs enthalten, die in einem M. Aeruginosa-Kellagerextrakt vorhanden sind. Obwohl die überwiegende Mehrheit der MCs einen Adda-Rückstand enthält, sind andere Rückstände an dieser Stelle bekannt, insbesondere die Detryla-und Acetyldemethyl-Adda-Varianten19. Alle MCs mit diesen Rückständen würden nicht anhand der definierten Kriterien erkannt. Da es sich bei der DFF jedoch um einen Post-Acquisition-Ansatz handelt, können zusätzliche diagnostische Fragmente mit dem hier skizzierten einfachen Schritt-für-Schritt-Protokoll leicht auf dem gleichen Datensatz untersucht werden. Dies ermöglicht es dem Analytiker auch, Verbindungen mit hypothetischen Modifikationen zu erkennen, die die diagnostischen Produktiroionen und/oder neutralen Verlust verändern würden.
Addukte und In-source-Fragmente können auch DFF-Kriterien erfüllen und fälschlicherweise als eindeutige Analysen interpretiert werden. Falsche Positive können entstehen, wenn andere Verbindungen, die im Extrakt vorhanden sind, die gleichen Produkt-Ionen und/oder neutrale Verluste aufweisen. In beiden Fällen kann dies durch den Einsatz zusätzlicher Produktionen und neutraler Verluste, die die Methodenselektivität erhöhen, gelindert werden.
Obwohl Vorläuferionen alle vom Analysten definierten DFF-Kriterien erfüllen und Verbindungen innerhalb der Zielklasse darstellen können, wird ihre absolute Identität dennoch vermeintlich sein. Mit Hilfe der von Schymanski (2014) vorgeschlagenen Identifikationsvertrauensstufen haben MCs, die mit diesem MS-MS-Ansatz entdeckt wurden, ein "Level 3"-Identifikationsvertrauen, wenn eine eindeutige molekulare Formel des Vorläuferions durch genaue Masse und Isotop zugeordnet werden kann. Profil20. In diesem Beispiel hatten acht vermeintliche MCs Massen, die mehreren, isobarischen MCs11entsprachen. Eine absolute Identität wäre entweder durch den Vergleich von Retentionszeit und MS/MS-Spektren mit einem authentischen Standard erreicht worden oder durch NMR und andere spektroskopische Methoden nach der Reinigung bestätigt worden. Putative Verbindungen, die nicht den Massen von bekannten Mitgliedern der Zielgruppe entsprechen, wie die acht hier entdeckten vermeintlichen MCs, stellen konkrete Ziele dar, um neue Naturprodukte zu entdecken.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Die Autoren danken Heather Roshon (Canadian Phycological Culture Centre, University of Waterloo für die Bereitstellung der Can-Obakteria-Kultur und Sawsan Abusharkh (Carleton University) für technische Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
