Summary
نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.
Abstract
في الميتوكوندريا النباتية، تحتوي بعض النصوص ذات الحالة الثابتة على 5'ثلاثي الفوسفات مشتق من بدء النسخ (النصوص الأولية)، في حين تحتوي النصوص الأخرى على 5'أحاديالفوسفات ولدت بعد النسخ (النصوص المجهزة). للتمييز بين هذين النوعين من النصوص، تم وضع العديد من الاستراتيجيات، ويعتمد معظمها على وجود/غياب ثلاثي الفوسفات 5.... ومع ذلك، فإن ثلاثي الفوسفات في المرحلة الابتدائية 5 'تيرميني غير مستقر، وأنه يعوق تمييز واضح من هذين النوعين من النصوص. للتمييز بشكل منهجي وخريطة النصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوشوندريون الذرة، قمنا بتطوير استراتيجية دائرية RT-PCR (cRT-PCR) القائمة على الجمع بين cRT-PCR، الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد البوخباتازي، الكمية RT-PCR (RT-qPCR)، ووصمة عار الشمالية. كتحسين، وتشمل هذه الاستراتيجية خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي للحد من تأثير غير مستقر 5 'ثلاثي الفوسفات.
في هذا البروتوكول، يتم معالجة الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب مسبقا من قبل RNA 5 'polyphosphatase، الذي يحول 5 'triphsophate إلى أحادي الفوسفات. بعد التعميم والنسخ العكسي، يتم تطبيع اثنين من cDNAs المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل الذرة 26S rRNA ناضجة، والتي لديها نهاية معالجة 5 'وغير حساسة ل5'polyphosphatase. وبعد التطبيع، يتم التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من التقييمات RNAs المعالجة وغير المعالجة. يتم تحديد termini النص عن طريق الاستنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ومن ثم التحقق من قبل وصمة عار الشمالية.
باستخدام هذه الاستراتيجية، تم تحديد معظم النصوص ثابتة الدولة في ميتوشوندريون الذرة. بسبب نمط النسخ المعقد لبعض الجينات الميتوكوندريا، لم يتم تمييز بعض النصوص الثابتة و/أو تعيينها، على الرغم من أنها تم اكتشافها في لطخة شمالية. نحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة للتمييز وخريطة النصوص ثابتة الحالة في الميتوكوندريا النباتية الأخرى أو في plastids.
Introduction
في الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع العديد من RNAs ناضجة والسلائف كما isoforms متعددة، ويمكن تقسيم النصوص ثابت الدولة إلى مجموعتين على أساس الفرق في نهايات ها 5'1،2،3، 4. النصوص الأولية لها 5 'نهايات ثلاثي الفوسفات، والتي تستمد من بدء النسخ. وعلى النقيض من ذلك، فإن النصوص المجهزة تحتوي على 5'أحاديالفوسفات يتم إنشاؤها بواسطة المعالجة اللاحقة للنسخ. التمييز ورسم الخرائط من نوعين من النصوص مهمة لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء النسخ والانتهاء من النضج النص.
وللتمييز بين النصوص الأولية والنصوص المجهزة في المتن النباتي، وضعت أربع استراتيجيات رئيسية. وتتمثل الاستراتيجية الأولى في المعالجة المسبقة لمضادات الأوجاع الميتوكوندريا بحمض التبغ البيروففاتيز (TAP)، الذي يحول الفوسفات الثلاثي الفوسفات إلى الفوسفات الأحادي الفوسفات ويمكّن النصوص الأولية من التعميم بواسطة الليغاسي الحمض النووي الريبي. ثم تتم مقارنة وفرة النسخ من عينات الحمض النووي الريبي المعالجة وغير المعالجة عن طريق التضخيم السريع لنهايات cDNA (RACE) أو التعميم RT-PCR (cRT-PCR)2،3،4. في الاستراتيجية الثانية، يتم استنفاد النصوص المجهزة أولا من RNAs الميتوكوندريا باستخدام المنهي 5'-الفوسفات تعتمد exonuclease (تكس)، ثم يتم تعيين النصوص الأولية اليسار عن طريق تحليل التمديد التمهيدي5،6 . الاستراتيجية الثالثة هي قبل سقف النصوص الأولية باستخدام guanylyl transferase، ومن ثم يتم تحديد موقف ثلاثي الفوسفات 5 'تيرميني عن طريق التمديدالتمهيدي جنبا إلى جنب مع ribonuclease أو S1 تحليل حماية nuclease 7،8 ،9. تختلف عن تلك التي تعتمد على وجود / عدم وجود 5 'ثلاثي الفوسفات، والاستراتيجية الرابعة يجمع في النسخ في المختبر، وmutagenesis الموجهة حسب الموقع، وتحليل التمديد التمهيدي لتوصيف المروجين المفترضة وتحديد النسخ بدءمواقع 8،10،11. باستخدام هذه الاستراتيجيات، تم تحديد العديد من النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا النباتية.
ومع ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن 5 'ثلاثي الفوسفات من النصوص الأوليةكانت غير مستقرة، وأنها تحولت بسهولة إلى أحادي الفوسفات لسبب غير معروف 2،4،12،13. وتعوق هذه المشكلة التمييز الواضح بين هذين النوعين من النصوص باستخدام تقنيات تبعاً لوجود/عدم وجود 5'ثلاثي الفوسفات، والجهود السابقة للتمييز المنهجي بين النصوص الأولية والمجهزة في المصنع فشل الميتوكوندريا2،12.
في هذا البروتوكول، ونحن الجمع بين cRT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، RT-qPCR، ووصمة عار الشمالية للتمييز بشكل منهجي النصوص الأولية والمصنعة المتراكمة بشكل ملحوظ في الذرة(Zea mays)mitochondrion (الشكل 1). cRT-PCR يسمح رسم الخرائط في وقت واحد من 5 'و 3' الأطراف من جزيء RNA، وعادة ما يتم تكييفها لخريطة termini نسخة في النباتات2،12،14،15. يمكن أن يزيل الحمض النووي الريبي 5 'polyphosphatase اثنين من الفوسفات من تيرميني ثلاثي الفوسفات 5 '، مما يجعل النصوص الأولية المتاحة للربط الذاتي من قبل الحمض النووي الريبي ligase. وأظهرت الدراسات السابقة أن ناضجة 26S rRNA في الذرة قد عالجت 5 '، وكان غير حساس لRNA 5 'polyphosphatase1،16. لتقليل تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر في الترسيني الأولي 5'، يتم تطبيع 5 'متعدد الفوسفاتات المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل rRNA 26S ناضجة، ثم يتم تمييز النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة cRT-PCR المنتجات التي تم الحصول عليها من عينات RNA اثنين. ويتم التحقق من نتائج رسم الخرائط والتمييز بين اللجنة من خلال اللطخة الشمالية وRT-qPCR، على التوالي. وأخيرا، يتم استخدام التمهيديات البديلة لتضخيم تلك النصوص التي تم الكشف عنها في وصمة عار الشمالية ولكن ليس عن طريق cRT-PCR. باستخدام هذه الاستراتيجية المستندة إلى CRT-PCR، تم تمييز معظم النصوص ثابتة الحالة في ميتوشوندريون الذرة ورسم خرائط1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التمهيدي التصميم 2.
- تصميم التمهيديات الجينات محددة للنسخ العكسي (RT) باستخدام PCR التمهيدي تصميم البرمجيات (جدولالمواد)على أساس القواعد العامة للتصميم التمهيدي17.
ملاحظة: التمهيديات RT هي محددة للغاية للنصوص المستهدفة، وأنها ترتكز عموما على الجزء 5 'من تسلسل الترميز (mRNAs ناضجة والسلائف RNAs)، أو ~ 500-600 NT المصب من نهاية 5 'المتوقعة (18S و 26S rRNAs). - تصميم أزواج من التمهيديات المتباينة لتضخيم النصوص الدائرية من قبل cRT-PCR.
ملاحظة: التمهيديات المتباينة المقترنة تحيط تقاطع 5'--3 'من النصوص الدائرية، وتختلف مواقفهم بين النصوص المستهدفة التي تم تحليلها (الشكل S1). بعض النصوص لديها UTRs طويلة; على سبيل المثال، nad2-1 5 'UTR وrps4-1 3' UTR هي 1,985 و 1,826/1,834 nt، على التوالي1. إذا كان كل من التمهيديات راسية على منطقة الترميز، سيكون من الصعب تضخيم النصوص المستهدفة. وعلى النقيض من ذلك، فإن بعض وحدات التّجانب التّجانب قصيرة؛ على سبيل المثال، 3' UTRs من nad2-1 و nad4-1 هي 34/35 و 29-31 nt، على التوالي1. إذا تم تحديد موقع التمهيديات المقترنة بعيداً عن تسلسلات الترميز، ستفشل PCR. بشكل عام، تم تصميم زوجين من التمهيديات المتباينة لكل النصوص المستهدفة، في حين قد يكون من الضروري أزواج متعددة لرسم خريطة تلك التي أنماط النصوص معقدة و / أو UTRs طويلة جدا. - أزواج تصميم التمهيديات المتقاربة لإعداد تحقيقات الحمض النووي الريبي لوصمة عار الشمالية.
ملاحظة: وتقع المواد التمهيدية المقترنة في منطقة ترميز الجين المستهدف، وينبغي أن يكون حجم منتج PCR في حدود 100 إلى 1000 نقطة أساس. يجب أن يحتوي كل التمهيدي إلى الأمام على موقع إنزيم تقييدي لتقليل تسلسل اتّجاهات في المسبارات الناتجة عن ذلك.
2. إعداد الميتوشوندريون الخام من حبات الذرة النامية
- تعقيم الآفات وقذائف الهاون والمسارات الزجاجية والأنابيب، ونصائح عن طريق الأوتوكلاف، وتجفيفها في الفرن.
- تنفيذ جميع الإجراءات في 4 درجة مئوية أو على الجليد، وقبل تبريد جميع الحلول.
- إعداد 100 مل من العازلة استخراج (EB)، وتتألف من 0.3 M السكروز، 5 M M رباعي الصوديوم بيروفوسفات، 10 مل KH2بو4،2 MM EDTA، 1٪ [ث / الخامس] بولي فينيل بيروليدون 40، 1٪ [ث / الخامس] بوملين المصل البقري، 5 مل L-سيستين، و 20 مل حمض الاسكوربيك. ضبط لpH 7.3 مع KOH وتعقيم عن طريق الترشيح.
- إعداد 100 مل من العازلة غسل (البنك الدولي) تتكون من 0.3 M السكروز، 1 MM EGTA، و 10 MM MOPS (3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك). ضبط لpH 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم عن طريق الترشيح.
ملاحظة: ويقترح إعداد EB والبنك الدولي باستخدام DEPC المعالجة Deionized H2O. - جمع 20 غرام من حبات النامية في 11-20 يوما بعد التلقيح (DAP) إلى أنبوب 50 مل وضعت على الجليد، ومن ثم نقل حبات إلى قذائف الهاون المبردة مسبقا.
ملاحظة: استخدام نسبة 100 مل من EB إلى 20 غرام من حبات الذرة. - أضف 10-20 مل من الجليد البارد EB إلى كل هاون، وطحن حبات تماما.
- إضافة المزيد من EB، وتصفية الأنسجة الأرضيةمن خلال طبقتين من القماش مرشح (جدول المواد).
- الطرد المركزي في filtrate في 8000 × ز لمدة 10 دقيقة، وتجاهل بيليه.
- نقل supernatant إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
- صب قبالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 6 مل البنك الدولي.
- Aliquot التعليق إلى خمسة أنابيب خالية من RNase 1.5 مل، والطرد المركزي لهم في 14،000 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل supernatant، وتجميد بيليه الميتوكوندريا في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. استخراج الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا
- استخراج الحمض النووي الميتوكوندريا معكاشف تجاري (جدول المواد) وفقا لتعليمات التصنيع.
تحذير: يحتوي هذا الكاشف على الفينول وإيزوثيوسيانات غوانيدين. العمل معها في غطاء محرك السيارة الدخان، وارتداء معطف المختبر والقفازات. - حل الحمض النووي الميتوكوندريا معزولة في DEPC المعالجة deionized H2O، وتقدير تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء مع مقياس الطيف (جدولالمواد).
ملاحظة: عموما، يتم الحصول على ~ 250 ميكروغرام RNA الميتوكوندريا من 20 غرام من حبات الذرة 15-DAP. - إعداد هلام أجاروز واحد يتكون من 1X TAE العازلة (40 MM تريس، 20 MM حمض الخليك،1MM EDTA)، 1.5٪ أغاروز (جدول المواد)، و1X صبغ تلطيخ النووية (جدولالمواد).
- إضافة حجم مناسب من 10X تحميل العازلة (0.5٪ بروموفينول الأزرق، 0.5٪ زيلين سيانول FF، و 50٪ الجلسرين)، وتحميل الميتوكوندريا RNA / تحميل خليط العازلة على هلام أغاروز 1.5٪.
- تشغيل هلام في 1X TAE العازلة في 5-6 V / سم لمدة 20-25 دقيقة، وتقييم سلامةالحمض النووي الريبي الميتوكوندريا عن طريق تصوير هلام مع نظام وثائق هلام (جدول المواد).
ملاحظة: وجود اثنين من العصابات متميزة (~ ~ 3,510 و ~ 1,970 nt للذرة الميتوكوندريا 26S و 18S rRNAs, على التوالي) هو معيار مقبول لRNA الميتوكوندريا سليمة. لاستبعاد التدهور المحتمل، يجب التحقيق في سلامة الحمض النووي الريبيخلال الخطوات المتعددة لإعداد الحمض النووي الريبي الدائري (الشكل 2).
4. الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد الفوسفات
- إعداد الحمض النووي الريبي 5'polyphosphatase (الجدول والمواد) العلاج (الجدول1)،وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- استرداد الحمض النووي الريبي 5 'متعدد الفوسفاتيزالمعالجة مع مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.
5. تعميم الحمض النووي الريبي
- إعداد اثنين من ردود الفعل التعميم باستخدام نفس كميات 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجةوغير المعالجة الميتوكوندريا RNAs (الجدول 2)، واحتضان كلا ردود الفعل في 16 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- استرداد مجموعتين من RNAs الذاتي ربط باستخدام نفس المجموعة كما في الخطوة 4.2.
ملاحظة: وتجدر الإشارة إلى أن جزءا فقط من الحمض النووي الميتوكوندريا سوف تكون ذاتية الربط، والحمض النووي الريبي المسترد سيكون مزيجا من النصوص الخطية والدائرية. - كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.
6. النسخ العكسي
- توليف مجموعتين من cDNAs من نفس كميات من 5 'تعميم 5' متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs (200 نانوغرام).
- إعداد خليط التمهيدي عن طريق إضافة نسبة متساوية من 26S-CRT وتصل إلى 7 التمهيديات RT أخرى.
ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي للخليط التمهيدي 1 μM. - إعداد اثنين من الخلائط قبل عن طريق الجمع بين الكواشف المدرجة في الجدول3، وحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم البرد على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- تجميع اثنين منأنظمة رد فعل RT (الجدول 4)، واحتضانها في 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
- سخني ردّي ردّات فعل RT عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدّة 5 دقائق، ثم ّ ابردهما على الثلج.
7- التطبيع
- إعداد اثنين من ردود الفعل PCR عن طريق إضافة نفس الحجم من cDNAs قالب مشتق ة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة أو غير المعالجة RNAs، التمهيديات المتباينة المحيطة تقاطع 5'-3 'من دائري 26S rRNA (أي 26S-CF1 و -CR1)، الخ (الجدول 5).
- تشغيل رد الفعل اثنين في دورة الحرارية (جدول المواد) في ظل الظروف الموصوفة في الجدول 6.
- إعداد هلام أجاروز واحد يتكون من 1X TAE العازلة، 1.0٪ أغاروز، و1X صبغ تلطيخ النووية.
- إضافة 2 μL 10X التخزين المؤقت التحميل (0.5٪ بروموفينول الأزرق، 0.5٪ إكسيلين سيانول FF، و 50٪ الجلسرين) إلى كل من اثنين من منتجات PCR، وتحميلها على هلام.
- قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت TAE بمعدل 5-6 فولت/سم لمدة 30-40 دقيقة، وصورة باستخدام نفس نظام توثيق الجل كالخطوة 3.5.
- مقارنة وفرة من اثنين من منتجات PCR باستخدام برامج الكمبيوتر (جدولالمواد، الشكل 4A)، وتحسين التطبيع عن طريق تغيير كميات cDNAs قالب إذا لزم الأمر.
8. تضخيم PCR
- إعداد أزواج من ردود فعل PCR عن طريق إضافة حجم مناسب من cDNAs تطبيع وزوج من التمهيديات المتباينة المحيطة تقاطع 5 '-3' من النصوص المستهدفة (الجدول7).
ملاحظة: يتم تحديد مقدار cDNAs القالب المستخدمة لتضخيم PCR من النصوص المستهدفة من قبل نتائج التطبيع rRNA 26S. - إجراء ردود فعل PCR وفقا للبرنامج الموصوف في الجدول 8.
- كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.5.
- تغيير إلى التمهيديات المتباينة المتداخلة، والتحقق من نتائج الجولة الأولى PCR عن طريق تكرار الخطوتين 8.1 و 8.2.
- كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.5.
- استعادة العصابات البارزة التي يمكن تكرارها في جولتين من تضخيمPCR باستخدام مجموعة استرداد الحمض النووي هلام (جدول المواد).
9. تحديد النص تيرميني
- استنساخ منتجات PCR الهلام تنقية في ناقلاتنهاية حادة (جدول المواد) باستخدام التقنيات القياسية.
- قم بإجراء PCR مستعمرة لتحديد النسخ الموجب الذي يحتوي على إدراجات الهدف، وتسلسلها تجاريًا.
ملاحظة: عادة ما يتم الكشف عن استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج مع حجم متغير من الفرقة واحدة تعافى لأن العديد من النصوص ثابت الدولة في الميتوكوندريا النباتية لديها غير متجانسة 5 ' و / أو 3 ' ينتهي1،12. - مواءمة بيانات التسلسل مع جينوم الميتوكوندريا الذرة باستخدام أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الأحيائية (NCBI). اختر الكائن الحي "الذرة (taxid:4577)"، وقاعدة بيانات البحث "جمع النيوكليوتيد (nr/nt)".
- العثور على تقاطع 5 '-3' من النص الدائري، وتحديد مواقف 5 ' و 3 ' termini النص.
- حساب حجم النصوص المستهدفة.
10. التحقق من نتائج رسم الخرائط cRT-PCR بواسطة RNA جل لطخة التهجين
ملاحظة: يتم تنفيذ التهجين هلام RNA باستخدام مجموعةتجارية (جدول المواد)، والذي يحتوي على الكواشف لتدوين تسمية الحمض النووي الريبي مع ديجوكجينين (DIG) وT7 RNA البلمرة، والتهجين، والكشف المناعي. يرجى الرجوع إلى البروتوكولات الواردة في هذه المجموعة للحصول على مزيد من التفاصيل. تأكد من استخدام المعدات المجانية RNase فقط للإجراء بأكمله.
- تضخيم جزء الحمض النووي المستخدم لإعداد مسبار الحمض النووي الريبي، واستنساخه إلى نفس المتجه كما هو الحال في الخطوة 9.1، والذي يحتوي على المروج T7 17 نقطة أساس من موقع الإدراج.
- خطي ة البناء باستخدام إنزيم تقييد السليم، واستعادة بلازميدخطي بواسطة مجموعة تنقية الحمض النووي (جدول المواد)، وحلها في DEPC المعالجة deionized H2O.
- تسمية الحمض النووي الريبي تحقيقات مع DIG-11-UTP من قبل مجموعة تجارية (جدولالمواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إعداد 500 مل من 10X MOPS العازلة (0.2 M MOPS، 50 MM خلات الصوديوم، و 10 MM EDTA) باستخدام DEPC المعالجة Deionized H2O. ضبط إلى درجة الحموضة 7.0 من قبل هيدروكسيد الصوديوم، وتعقيم عن طريق الترشيح.
- إضافة 2-3 مجلدات من المخزن المؤقت التحميل (50٪ الفورماميد، 6.2٪ الفورمالديهايد، 1X MOPS، 10٪ الجلسرين، و 0.1٪ بروموفينول الأزرق) إلى الحمض النووي الميتوكوندريا أعدت في الخطوات 3.1-3.3.
- تشويه عينة RNA / تحميل خليط العازلة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومن ثم البرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة.
- إعداد هلام أغاروز مشوه (2٪ الفورمالديهايد، 1.2٪ أغاروز، و 1X MOPS)، وتحميل عينة RNA / تحميل خليط العازلة إلى هلام (1-2 ميكروغرام RNA الميتوكوندريا لكل بئر).
- تشغيل هلام في 1X MOPS في 3-4 V / سم ل ~ 4 ساعة.
- إعداد 2 لتر من 20X SSC (3 M NaCl, 0.3 M سيترات الصوديوم, درجة الحموضة 7.0). علاج مع 0.1٪ DEPC بين عشية وضحاها، وتعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
- شطف هلام مرتين في 20X SSC (15 دقيقة في كل مرة)، ونقل هلام RNA إلى غشاء النايلون (جدولالمواد)عن طريق نقل الشعرية مع 20X SSC لمدة 10-16 ساعة.
- إصلاح الحمض النووي الريبي إلى غشاء عن طريق الخبز في 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إجراء التهجين الحمض النووي الريبيوالكشف المناعي مع مجموعة تجارية (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
11. التمييز في النهايات الابتدائية والمجهزة 5'
- التمييز بين الغايات الأولية والمجهزة 5 'عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR التي تم الحصول عليها من 5 'تطبيع polyphosphatase المعالجة وغير المعالجة RNAs.
ملاحظة: إلى النصوص الأولية، وفرة من منتجات PCR من 5 'الحمض النووي الريبي متعدد الفوسفاتيز المعالجة أعلى بكثير من ذلك من النظير غير المعالجة (الشكل1،'جين A،' والشكل 4A). ومع ذلك، إلى النصوص المجهزة، سيتم تضخيم مستوى مماثل من منتجات PCRمن مجموعتين من RNAs الميتوكوندريا (الشكل 1، 'جين B'). - تصميم التمهيديات RT-qPCR استناداً إلى نتائج رسم الخرائط cRT-PCR.
- تحقق من نتائج التمييز cRT-PCR بواسطة RT-qPCR.
ملاحظة: يتم تطبيع عينتين cDNA المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل منتجات RT-qPCR من rRNA ناضجة 26S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقدير كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا
في دراسة سابقة، تم استخدام كل من RNAs الكلي والميتوكوندريا لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في أرابيدوبسي (أرابيدوبيس ثاليانا)،وقدم نوعين من RNAs نتائج رسم الخرائط مماثلة12. في البداية، استخدمنا أيضا مجموع RNAs لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في الذرة. بعد العديد من التجارب، وجدنا أن النصوص المستهدفة كان من الصعب اكتشافها. وكتحسين، أثرينا الحمض النووي الميتوكوندريا من حبات الذرة النامية، وجعل تضخيم النصوص المستهدفة الدائرية في جولة واحدة من PCR ممكنًا.
لشرح التضخيم السهل للنصوص المستهدفة بعد الإثراء، قدرنا كفاءة تعميم الحمض النووي الريبي من خلال إجراء RT-PCRs على الجين الميتوكوندريا التمثيلي nad5 (الشكل3 والشكل S2). يحتوي جين الذرة nad5 على اثنين منالإنترترونات المتحولة - واثنان من رابطة الدول المستقلة. بعد الربط الذاتي من مجموع وRNS الميتوكوندريا، تم توليف cDNAs حبلا الأولى بشكل مستقل باستخدام nad5-RT1 و -RT2 التمهيدية. يمكن للتمهيداثنين عكس تدوين كل من الخطية والدائرية nad5 mRNAs (الشكلS2). وتستخدم أربعة أزواج من التمهيديات المتقاربة لتضخيم PCR: sqF1&sqR1 وsqF2&sqR2 لRT-PCR شبه الكمية (RT-sqPCR) وqF1&qR1 و qF2&qR2 لRT-qPCR. بالنسبة للقدرات المركزية التي كتبها nad5-RT1، اكتشفت جميع الأزواج الأربعة من المواد التمهيدية كلاً من المحركات الناضجة القابلة للتعميم والخطية؛ لnad5-RT2 رد فعل النسخ العكسي، sqF2 وsqR2 و qF2 و qR2 مسح كلا الشكلين من mRNA، في حين أن sqF1 وsqR1 و qF1 و qR1 و qR1 PCR المنتجات مستمدة من nad5 دائريفقط. بناء على هذا التحليل، استخدمنا sqF2 وsqR2 (لRT-sqPCR) و qF2&qR2 (لRT-qPCR) منتجات PCR لتطبيع ردود الفعل النسخالعكسي nad5-RT1 و RT2، وقدرت نسبة nad5 التعميم من خلال مقارنة sqF1 وsqR1 (لRT-sqPCR) أو qF1 و qR1 (لRT-qPCR) منتجات PCR. قبل الربط الذاتي، تم التعامل مع RNAs مسبقًا بواسطة بولي فوسفاتيز RNA 5 لجعل جميع النصوص متاحة للتعميم بواسطة RNA ligase. أظهر تحليل RT-sqPCR أن جزءًا صغيرًا جدًا من nad5 mRNA تم تعميمه عند استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي، ولكن تم زيادة النسبة بشكل كبير عند استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب (الشكل3B). وأظهرت نتائج RT-qPCR أن نسبة nad5 mRNA الذاتي الأربطة زادت من 3.7٪ إلى 32٪ بعد التخصيب (الشكل3C). أعطى تحليل nad1 نتائج مماثلة، وزيادة كفاءة التعميم من nad1 mRNA من 0.7٪ إلى 30٪ (الشكل3D-F).
وفي هذه التحليلات، كانت حوالي 30 في المائة من الذرة الميتوكوندريا الميتوكوندريا ذاتية الربط بعد التحسين، وتفسر زيادة كفاءة التعميم سهولة الكشف عن النصوص المستهدفة عن طريق cRT-PCR.
تحديد الذرة محمد الدوسري mRNA termini باستخدام استراتيجية المستندة إلى CRT-PCR
استخدمنا جين cox2 كمثال لإدخال رسم الخرائط والتمييز من الذرة الميتوكوندريا النصوص باستخدام استراتيجية المستندة إلى CRT-PCR (الشكل4).
في بداية رسم خرائط cox2 mRNA، تم تصميم ثلاثة التمهيديات التي تواجه الخارج CF1، CF2، وCR1 على منطقة ترميز الجينات (الشكل4D). كان CF1 وCF2 التمهيديين المتداخلة، وكان CF2 69 نقطة أساس المصب من CF1. باستخدام القالب cDNAs توليفها في الخطوات 6.1-6.5 وتطبيع في الخطوات 7.1-7.6، وCF1 & CR1 التمهيدي الزوج تضخيم اثنين من العصابات البارزة، وتكررت نتائج التضخيم من قبل التمهيديات المتداخلة CF2 & CR1 (الشكل4A). وعلاوة على ذلك، تم تضخيم النطاقين بقوة من الحمض النووي الريبي 5 'متعدد الفسفات، في حين أنها كانت صعبة للكشف في النظير غير المعالجة، مما يشير إلى أنها حساسة لRNA 5 'polyphsophatase ولها الأولية 5 'تيرميني.
تم تسمية النطاقين المرشحين cox2-1 و -2، وتم استردادها بشكل مستقل من هلام أغاروز واستنساخها في ناقلات. وأظهرت نتائج PCR مستعمرة أن استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج مع حجم متغير، مما يعني غير متجانسة 5 ' و / أو 3 ' تيرميني من النصوص (الشكل5). وقد تم تسلسل النسخ اتّصالاً تجارياً، وتتماشى بيانات التسلسل مع جينوم الميتوكوندريا الذرة كما هو موضح في الخطوة 9-3.
وأظهرت نتائج التسلسل والمحاذاة أن النصين كانا متطابقين عند 3 نهايات، ولكنهما مختلفان في طول الـ 5'UTRs (الشكل 4D). تم إثراء نهايات 5 'من cox2-1 و -2 في 992-1,030 و 1,276-1,283 NT المنبع من AUG, على التوالي, في حين أن نهايتها 3'nt كان 39 NT المصب من codon وقف. ومن خلال نتائج الـ cRT-PCR، كانت الأحجام المحسوبة لكوكس2-1 و-2 1,804-1,832 و2,088-2,095 nt، على التوالي.
للتحقق من نتائج رسم الخرائط cRT-PCR، تم تنفيذ التهجين هلام RNA باستخدام التحقيق المستمدة من منطقة الترميز الجيني cox2، وتم الكشف عن اثنين من العصابات الرئيسية مع حجم مماثل كوكس2-1و -2 (الشكل4C). وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن نطاقين أكبر حوالي 500 2 و 800 2 متر في اللطخة الشمالية، ولكن لم يتم تضخيمهما بواسطة cRT-PCR. تم تسمية النطاقين أكبر كما cox2-3 و -4، على التوالي. ولرسم خريطة لها، تم تصميم اثنين آخرين من المواد التمهيدية المواجهة للخارج (أي CR2 وCF3)، الراسية على الـ 5' و3'UTRs من cox2-2، وكانت مواقفهم قريبة من نهايات النص المتوقع ة من cox2-3و-4. باستخدام الزوج التمهيدي CF3 & CR2، تم تضخيم اثنين من العصابات الرئيسية بقوة من cDNAs المستمدة من 5 'الحمض النووي الريبي متعدد الفسوفتاز المعالجة ولكن ليس من النظير غير المعالجة (الشكل4A). وأظهرت نتائج التسلسل أن لديهم متطابقة 5 'تيرميني في حين متغير 3' ينتهي. وكان الحجم المحسوب للنسختين 2,512/2,513 و2,833-2,835 nt، على التوالي، وكانت قريبة من الحجم مع اثنين من العصابات أكبر الكشف في وصمة عار الشمالية. وعلاوة على ذلك، أشارت نتائج cRT-PCR إلى أن كوكس2-3 و-4 لديهم الترميني الأساسي 5'.
ولتأكيد نتائج التمييز، تم تصميم خمسة مواد أولية مواجهة للخارج وفقاً لنتائج رسم الخرائط cRT-PCR، أي qCF1 وqCF2 وqCR1 وqCR2 وqCR3، كما تم استخدام أزواج الالتمهيدي qCF1&qCR1 وqCF1&qCR2 وqCF1&qCR3 وqCF2&qCR3 تحليل RT-qPCR من cox2-1 و -2 و -3 و-4 على التوالي. وكانت الوفرة النسبية لجميع المنتجات الأربعة من مادة RT-qPCR في عينة معالجة متعددة الفسفات اتُهم بكثير من تلك التي تُجرى في النظير غير المعالج، مما يؤكد نتائج التمييز بين الـ CRT-PCR.
وباختصار، فإن نمط النسخ من جين كوكس 2 الذرة معقد، والاستراتيجية المستندة إلى CRT-PCR تميز بشكل فعال وخرائط isoforms متعددة من cox2 mRNA.
الشكل 1: لمحة عامة عن الاستراتيجية القائمة على الـ CRT-PCR. رسم توضيحي للخطوات الرئيسية للاستراتيجية المستندة إلى PCR. 5'+ و 5'- = عينات الحمض النووي الريبي اثنين المعالجة وغير المعالجة من قبل RNA 5'polyphosphatase، على التوالي. يتم تطبيع عينتين cDNA المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل rRNA ناضجة 26S في الذرة، ويتم التمييز النصوص الأولية والمصنعة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR. بالنسبة للجين A، فإن الحمض النووي الريبي المقابل له نهاية أساسية 5'لأن وفرة منتج PCR من 5'RNA المعالجة بالبولي فوسفاتيز أعلى بكثير من ذلك من النظير غير المعالج. بالنسبة للجين B، يتم تضخيم منتجات PCR من مجموعتين من RNAs الميتوكوندريا على مستوى مماثل، مما يعني وجود نهاية معالجة 5 'من الحمض النووي الريبي المقابلة. يتم تمثيل منطقة الترميز وUTRs بواسطة مربع رمادي وخطوط غامقة، على التوالي. CRT = التمهيدي للنسخ العكسي؛ CF1، CF2، CR1، و CR2 = التمهيديات PCR المحيطة تقاطع 5 '-3' من النص الدائري؛ qCF وqCR = التمهيديات المتباينة لRT-qPCR. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم سلامة الحمض النووي الميتوكوندريا بواسطة الكهربائي هلام أغاروز. (أ) RNAs الميتوكوندريا أعدت من 15-DAP حبات الذرة. M = علامة الحمض النووي الجزيئية. (ب) نواة الميتوكوندريا RNA بعد العلاج من قبل 5 'polyphosphatase و / أو التعميم من قبل T4 RNA ligase. 5'+ = الحمض النووي الميتوكوندريا بعد العلاج من قبل 5 'polyphosphatase; T4&5'+ = الحمض النووي الميتوكوندريا بعد العلاج من قبل 5 'polyphosphatase والتعميم من قبل T4 RNA ligase; T4&5'- = الحمض النووي الميتوكوندريا بعد التعميم فقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كفاءة التعميم في الناد5 وnad1 mRNAs التي تقدرها التقارير التشغيلية الـ RT-PCRs. (أ) و (د) الرسم التخطيطي للجينات nad5 و nad1، على التوالي. السابقين = exon. وتظهر الطاردات والإينترونات كمربعات رمادية وخطوط منحنية، على التوالي. يتم الإشارة إلى موقف التمهيديات النسخ العكسي RT1 و RT2 بواسطة الأسهم. تشير النقاط السوداء إلى موضع التمهيديات PCR، ويظهر الحجم المتوقع لمنتجات PCR. sqF1، sqF2، sqR1، وsqR2 هي التمهيديات لRT-sqPCR؛ qF1، qF2، qR1، و qR2 هي التمهيديات لRT-qPCR. (B) و (E) RT-sqPCR تحليل كفاءة التعميم من nad5 و nad1 mRNAs، على التوالي. M = علامة الحمض النووي الجزيئية. (C) و (F) RT-qPCR تحليل كفاءة التعميم من nad5 و nad1 mRNAs، على التوالي. يتم تطبيع عينتي cDNA عكس التي تم نسخها بواسطة RT1 و RT2 التمهيدية من قبل sqF2 وsqR2 (لRT-sqPCR) أو qF2 وqR2 (لRT-qPCR) منتجات PCR. وتقدر كفاءة التعميم من nad5 و nad1 mRNAs عن طريق مقارنة منتجات PCR من sqF1&sqR1 (لRT-sqPCR) أو qF1 & qR1 (لRT-qPCR). دائري / (دائري + خطي) = qF1 & qR1 على qF2 & qR2 في رد فعل RT2 / qF1 & qR1 على qF2 & qR2 في رد فعل RT1. القيم هي وسائل وSDs من ثلاثة تكرارالبيولوجي. لاستبعاد التأثير المحتمل من قبل 5′ ثلاثي الفوسفات, تم التعامل مع RNAs من قبل 5′ polyphosphatase قبل الربط الذاتي. المجموع وميتو = المجموع وRNAs الميتوكوندريا، على التوالي. RT1 و RT2 = cDNAs عكس المنقولة من قبل RT1 و RT2 التمهيدية، على التوالي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم خرائط لـ cox2 الأرمران الناضج باستخدام استراتيجية cRT-PCR-cased. (A) فصل هلام من المنتجات كوكس 2 cRT-PCR. + و - = cDNAs المستمدة من 5′ متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة الميتوكوندريا RNAs, على التوالي. تم تطبيع عينتين cDNA عن طريق تضخيم 26S cDNA(26S). وتستخدم خمسة مواد أولية لتحليل cRT-PCR من cox2 mRNA دائري: CF1، CF2، وCF3 هي التمهيديات المتداخلة، وCF2 و CF3 هي 69 و 138 نقطة أساس المصب من CF1، على التوالي؛ CR1 و CR2 هي التمهيديات المتداخلة، وCR2 هو 1288 نقطة في الثانية من المنبع من CR1. تم تضخيم النطاقات المشار إليها من قبل '1' و '2' من قبل كل من CF1&CR1 و CF2 & CR1، في حين تم تضخيم النطاقين '3' و '4' بواسطة CF3&CR2. وقد تم تسلسل جميع النطاقات الأربعة بالاستنساخ. ولا يمكن تكرار النطاقات التي تحمل علامات نجمية، وتم استبعادها من النتائج. M = علامة الحمض النووي الجزيئية. (ب) تحليل RT-qPCR للوفرة النسبية من cox2 mRNA دائرية بعد 5 'العلاج متعدد الفوسفات. وقد تم تصنيع عينات cDNA اثنين من قبل خليط التمهيدي الذي يحتوي على 26S-CRT، cox2-CRT، nad5-CRT، nad6-CRT، nad7-CRT، nad9-CRT، cob-CRT، وcox1-CRT بنسبة متساوية، وcDNA المستمدة من 26S ناضجة rRNA استخدمت للتطبيع. +/- = cox2 أكثر من 26S في عينة المعالجة /cox2 أكثر من 26S في عينة غير المعالجة. قيم يمثّل [منس] و [سد] من ثلاثة تكرارات أحيائيّة. ويشار إلى المواد التمهيدية المستخدمة في RT-qPCR. (ج) تحليل وصمة عار الشمالية من النصوص cox2. تم تحميل 2 ميكروغرام من الحمض النووي الميتوكوندريا. يتم وضع علامة على العصابات المقابلة لisoforms مختلفة من cox2 mRNA ناضجة. (د) النص termini من cox2 mRNA يستنتج من نتائج cRT-PCR. يتم عرض UTRs وإطارات القراءة المفتوحة كخطوط غامقة ومربعات رمادية، على التوالي. يتم عرض مواقف 5' و 3' تيرميني بالنسبة AUG (+1) و UAA (-1)، وأعداد من استنساخ واحد تسلسل في تلك المواقف. وتظهر مواضع النسخ العكسي والتمهيديات التمهيدية لتضخيم PCR كرؤوس سهم مغلقة ومفتوحة، على التوالي. وتظهر المواد التمهيدية الموجهة للخارج المستخدمة لRT-qPCR كمربعات مفتوحة، كما هو مبين في موضع مسبار cox2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اختيار الحيوانات المستنسخة الإيجابية التي تحتوي على إدراج كوكس2-4بواسطة PCR المستعمرة. (أ) مستعمرة PCR لفحص استنساخ واحد يحتوي على coxinsertcox2-4. حجم cox2-4 إدراج حوالي 1,165 نقطة أساس, وأن تسلسل المتجهات هو 100 نقطة أساس. يبلغ الحجم المحسوب لمنتجات PCR المستعمرة حوالي 1,265 نقطة أساس، ولم يتم تسلسل تلك النسخ التي تحتوي على إدراجات صغيرة الحجم، أي الأرقام 11 و14 و22 و23. (ب) نتائج تسلسل النسخ الإيجابية التي تم فحصها في (A). 5'/3' ينتهي = 5' و 3' ينتهي نسبة إلى AUG (+1) و UAA (-1)، على التوالي. واستُبعدت نتائج التسلسل للرقمين 12 و20 لأنها كانت أصغر بكثير من النتائج الأخرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون | حجم لتفاعل 50 ميكرولتر (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| 10X RNA 5 'بولي فوسفاتيتاز العازلة | 5 | 1x |
| مثبط اتّصال RNase (40 U/μL) | 0.75 | 0.6 U/μL |
| الحمض النووي الميتوكوندريا | x | 0.2 ميكروغرام/ميكرولتر |
| الحمض النووي الريبي 5 'بوليفوسفاتيز (20 U / μL) | 2.5 | 1 U/μL |
| DePC المعالجة منزوع ة H2O | إلى 50 ميكرولتر | - |
الجدول 1: مكونات رد الفعل من العلاج بولي فوسفاتيز RNA 5'.
| مكون | حجم لتفاعل 20 ميكرولتر (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| 10x T4 RNA ligase I العازلة | 2 | 1x |
| dATP (1 متر) | 1 | 50 درجة مئوية |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15 في المائة |
| مثبط الحمض النووي الريبي (40 U/μL) | 0.5 0.5 | 1 U/μL |
| 5' بولي فوسفاتاز المعالجة أو غير المعالجة الميتوكوندريا RNA | x | 0.1 ~ 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر |
| T4 RNA ligase I (30 U/μL) | 0.4 | 0.6 U/μL |
| DEPC المعالجة منزوع الأيونات H2O | إلى 20 ميكرولتر | - |
الجدول 2: مكونات رد الفعل من تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا.
| مكون | حجم ل10 ميكرولتر قبل الخليط (ميكرولتر) |
| خليط التمهيدي (1 ميكرومتر المجموع)أ | 2 |
| خليط dNTP (10 mM لكل منهما) | 1 |
| تعميم 5 'بولي فوسفاتيتاز المعالجة أو غير المعالجة الميتوكوندريا RNAب | x |
| DePC المعالجة منزوع ة H2O | إلى 10 ميكرولتر |
الجدول 3: ما قبل الخليط لرد فعل النسخ العكسي. (أ) يحتوي الخليط التمهيدي على نسبة متساوية من 26S-CRT وما يصل إلى 7 مواد أولية RT أخرى، والتركيز النهائي هو 1 μM.b يتم إعداد اثنين من المخاليط المسبقة جنبا إلى جنب، وأنها تحتوي على نفس الكمية (200 نانوغرام) من 5'polyphosphatase المعالجة أو المعالجة دائرية 5'polyphosphatase المعالجة أو غير المعالجة الحمض النووي الميتوكوندريا.
| مكون | حجم نظام التفاعل 20 ميكرولتر (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| قالب RNA / التمهيدي / dNTP * | 10 سنوات | - |
| 5x RTase العازلة | 4 | 1x |
| مثبط اتّصال RNase (40 U/μL) | 0.5 0.5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| DEPC المعالجة منزوع الأيونات H2O | إلى 20 ميكرولتر | - |
الجدول 4: مكونات رد الفعل للنسخ العكسي. * قالب RNA / التمهيدي / dNTP قبل الخلائط أعدت في الخطوة 6.3.
| مكون | حجم نظام التفاعل 20 ميكرولتر (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| منزوع ة ح2س | 7 | - |
| 2X رد الفعل العازلة | 10 سنوات | 1x |
| خليط dNTP (10 mM لكل منهما) | 0.4 | 0.2 مليون متر مربع لكل منهما |
| 26S-CF1 (10 ميكرومتر) | 0.8 | 0.4 مليون متر مربع |
| 26S-CR1 (10 درجة مئوية) | 0.8 | 0.4 مليون متر مربع |
| قوالب cDNA مشتقة من 5 'تعميمية متعددة الفوسفاتيز المعالجة أو غير المعالجة RNAs * | 0.6 | - |
| بوليميراز الحمض النووي (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U / ميكرولتر |
الجدول 5: مكونات التفاعل لتضخيم PCR من 26S cDNA. * في البداية، يتم استخدام حجم متساو من cDNAs القالب (0.6 μL) للتطبيع. إذا لزم الأمر، تغيير كميات cDNAs قالب لضمان نفس وفرة من منتجات PCR 26S بين رد فعل PCR اثنين.
| خطوه | درجه الحراره | الوقت | رقم الدورة |
| التناطور الأولي | 95 درجة مئوية | 3 دقائق | دورة واحدة |
| التناطور | 95 درجة مئوية | 15 ثانية | 22-25 دورة |
| التمهيدي الصلب | 56 درجة مئوية | 15 ثانية | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | 5 دقائق | دورة واحدة |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ | - |
الجدول 6: شروط PCR لتضخيم 26 S cDNA للتطبيع.
| مكون | حجم نظام التفاعل 20 درجة مئوية (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| H2O منزوع ة | إلى 20 ميكرولتر | - |
| 2X رد الفعل العازلة | 10 سنوات | 1x |
| خليط dNTP (10 mM لكل منهما) | 0.4 | 0.2 مليون متر مربع لكل منهما |
| تباين التمهيدي إلى الأمام (10 درجة مئوية) | 0.8 | 0.4 مليون متر مربع |
| عكس التمهيدي متباينة (10 درجة مئوية) | 0.8 | 0.4 مليون متر مربع |
| قالب cDNA مشتق من RNAs 5'polyphosphatase المعالجة أو غير المعالجة * | x | - |
| بوليميراز الحمض النووي (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U / ميكرولتر |
الجدول 7: مكونات التفاعل لتضخيم PCR لنصوص الهدف المعممة. * يتم تحديد حجم cDNAs قالب المستخدمة في هذه ردود الفعل من قبل نتائج التطبيع rRNA 26S.
| خطوه | درجه الحراره | الوقت | رقم الدورة |
| التناطور الأولي | 95 درجة مئوية | 3 دقائق | دورة واحدة |
| التناطور | 95 درجة مئوية | 15 ثانية | 22-40 دورات ج |
| التمهيدي الصلب على | 50-65 درجة مئوية | 15 ثانية | |
| التكثيف(ب) | 72 درجة مئوية | 0.5-1 دقيقة | |
| تمديد فيناتل | 72 درجة مئوية | 5 دقائق | دورة واحدة |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ | - |
الجدول 8: شروط PCR لتضخيم النصوص المستهدفة. (أ) يعتمد المعتدلة الصلب الدقيق على درجة حرارة ذوبان التمهيديات PCR. (ب) يعتمد وقت الاستطالة على طول الهدف الذي سيتم تضخيمه. الوقت الموصى به هو 1 دقيقة لكل 1 كيلو بايت من جزء PCR. (ج) بشكل عام، 30 ~ 35 دورات كافية لإنتاج كمية كافية من المنتج PCR. لنصوص وفيرة منخفضة, زيادة عدد دورات تصل إلى 40 دورات.
الشكل S1: موضع مواد تمهيدية لنصوص الميتوكوندريا التمثيلية للذرة. CRT = التمهيدي النسخ العكسي؛ CF1، CF2، CR1، و CR2 = التمهيديات المتباينة لتضخيم PCR؛ qCF وqCR = التمهيديات المتباينة لRT-qPCR. وقد تم تحديد termini نسخة من الذرة nad2-1، rps4-1، وnad4 -1 سابقا (Zhang et al., 20191). يتم عرض المراكز 5'- و 3'-ينتهي نسبة إلى AUG (+1) والنيوكليوتيد الأخير من توقف codon (-1). يشار إلى مناطق الترميز وUTRs كمربعات رمادية وخطوط غامقة، على التوالي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل S2: مبدأ تقدير كفاءة التعميم من nad5 mRNA في الذرة. في رد فعل الربط الذاتي، يتم تعميم جزء صغير فقط من RNAs الميتوكوندريا. لحساب نسبة nad5 mRNA دائرية، يتم استخدام اثنين من التمهيديات الجينات محددة لتجميع cDNAs حبلا الأولى، أي nad5-RT1 و-RT2. في رد فعل النسخ العكسي nad5-RT2 ،، يتم تضخيم منتجات PCR من قبل sqF2 & sqR2 (لRT-sqPCR) و qF2 & qR2 (لRT-qPCR) من كل من الخطية والدائرية nad5، في حين أن sqF1 & sqR1 (لRT-sqPCR) و qF1 &qR1 (لRT-qPCR) يتم اشتقاق منتجات PCR من nad5 دائريفقط; في nad5-RT1 رد فعل، يمكن لجميع أزواج أربعة من التمهيديات PCR تضخيم كلا الشكلين من nad5. لحساب نسبة الناد5 mRNA الدائرية، يتم تطبيع اثنين من ردود الفعل من قبل sqF2 وsqR2 أو qF2 وqR2 PCR المنتجات. من خلال مقارنة وفرة من sqF1 وsqR1 أو qF1 & qR1 PCR المنتجات بين اثنين من ردود الفعل RT، ويقدر تقريبا كفاءة التعميم من nad5 mRNA. السابق = exon. وتظهر الطاردات والإينترونات كمربعات رمادية وخطوط منحنية، على التوالي. يتم الإشارة إلى مواقف nad5-RT1 و -RT2 التمهيدية بواسطة الأسهم. تشير النقاط السوداء إلى مواضع التمهيديات PCR، ويظهر الحجم المتوقع لمنتجات PCR. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول S1: معلومات التمهيدي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في دراسة سابقة، تم استخدام مجموع وRNS الميتوكوندريا من ثقافة تعليق الخلايا من Arabidopsis لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني من قبل cRT-PCR، وتم الحصول على نتائج مماثلة12. ومع ذلك، تم استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب فقط لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني في العديد من الدراسات الأخرى1،2،3،9. وجدنا أن إثراء الحمض النووي الميتوكوندريا هو خطوة هامة لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في الذرة. بعد هذا الإثراء، يتم زيادة نسبة الحمض النووي الميتوكوندريا الدائري بشكل كبير من 0.3٪ -3.7٪ إلى ~ 30٪ (الشكل3 والشكل S2)،مما يجعل تضخيم النصوص المستهدفة الدائرية ممكنة في جولة واحدة من PCR.
وقد قدرت كفاءة التعميم من الحمض النووي الميتوكوندريا من خلال تحليل RT-PCR على الذرة nad1 و nad5، وكلاهما ينقسم إلى سلائف مستقلة من قبل رابطة الدول المستقلة-- الربط الإينترونات. لأن التأثير المحتمل من وجود RNAs السلائف، فضلا عن الاختلاف في كفاءة RT لا يمكن استبعادها، وهذا ليس سوى تقدير تقريبي لكفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا الحقيقي.
غيرنا شروط الربط الذاتي عن طريق تغيير تركيز الحمض النووي الميتوكوندريا وPEG8000، وكذلك عن طريق إطالة وقت الحضانة، ولكن هذه التغييرات لا يبدو أن تؤثر على كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا. وعلى الرغم من أننا لسنا متأكدين مما إذا كان من الممكن أن يؤدي المزيد من تنقية تدرج بيركول إلى زيادة كفاءة التعميم، فإن نوعية الميتوكوندريا الخام المعدة في القسم 2 جيدة بما يكفي لرسم خرائط cRT-PCR لمصطلح الميتوكوندريا في الذرة. وبما أن جولات متعددة من الـ PCRs قد تتسبب في نتائج إيجابية خاطئة، فإن تضخيم النصوص المستهدفة في جولة واحدة من الـ PCR يجعل نتائج رسم الخرائط أكثر موثوقية.
و5 'ثلاثي الفوسفات من النصوص الأولية غير مستقر، ويمكن تحويله إلى 5 'أحادي الفوسفات لأسباب غير معروفة. هذه المشكلة تعيق التمييز الواضح بين النصوص الأولية والمجهزة باستخدام النهج اعتمادا على وجود/ عدم وجود 5 'ثلاثي الفوسفات 1،2،4. شكل ناضجة من الذرة 26S rRNA له نهاية أحادي الفوسفات 5 '، وأنه غير حساس لRNA 5 'polyphosphatase. للحد من تأثير تريهوواست غير مستقر 5 '، ويستخدم ناضجة 26S rRNA لتطبيع عينات الحمض النووي الريبي اثنين، ومعالجتها وغير المعالجة من قبل 5 'polyphosphatase، ويظهر أن تكون خطوة هامة للتمييز بين نوعين من النصوص في الذرة ميتوشوندريون. بعد التطبيع، يمكن التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة من خلال مقارنة نتائج cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من عينات الحمض النووي الريبي (RNA) المعالجة بالبولي فوسفاتياس وغير المعالجة. النصوص الأولية حساسة ل5 'polyphosphatase، ويتم تضخيمها بقوة من عينة 5 'متعدد الفوسفاتات المعالجة ولكن ليس (أو على مستوى منخفض جدا بسبب غير مستقر 5'ثلاثي الفوسفات) من النظير غير المعالجة. وعلى النقيض من ذلك، يتم الكشف عن النصوص المجهزة بمستويات مماثلة بين العينات.
في النباتات، وأنماط النص من العديد من الجينات الميتوكوندريا معقدة إلى حد ما1،2. على سبيل المثال، يتم التعبير عن الجينات nad6 الذرة وatp6 على حد سواء monocistrons وdicistrons، وnad6، atp6، وatp6-na6 mRNAs ناضجة لديها اثنين، ثلاثة، وisoforms اثنين، على التوالي. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة النسخ من جين الميتوكوندريا واحد هو في الواقع خليط من السلائف، وناضجة، وتدهور RNAs. PCRs عرضة لتضخيم جزيئات صغيرة الحجم، وأنه من الصعب الكشف عن جميع isoforms النص باستخدام زوج واحد من التمهيديات. ولذلك، فإن التهجين هلام الحمض النووي الريبي وصمة عار مطلوب للتحقق من نتائج رسم الخرائط cRT-PCR، وقد يكون من الضروري التمهيديات البديلة لتضخيم تلك النصوص التي تم الكشف عنها في اللطخة الشمالية ولكن ليس من قبل أول مرة cRT-PCR.
يتضمن هذا البروتوكول خطوة RT-qPCR للتحقق من نتائج التمييز cRT-PCR. لأن النظائر المتعددة لبعض mRNAs ناضجة قريبة جدا في الحجم1، فمن المستحيل تأكيد جميع نتائج التمييز من قبل RT-qPCR ، وتم تحديد بعض النصوص حالة ثابتة من خلال مقارنة نتائج cRT-PCR بين المعالجة وRNAs غير المعالجة فقط.
في هذا البروتوكول، تم تعيين الـ 5' و3' التبصات النصوص المستهدفة عن طريق استنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ويحد من عدد الحيوانات المستنسخة المفردة التي سيتم تسلسلها. وكطريقة بديلة، يمكن تسلسل منتجات cRT-PCR بواسطة تسلسل الجيل التالي، الذي يتسلسل آلاف الجزيئات لمجموعة واحدة من النصوص الثابتة، وستكون نتائج رسم الخرائط أكثر دقة.
وإلى جانب التمييز في التبتير ة الأولية والمجهزة 5 'من قبل cRT-PCR وRT-qPCR، يمكن تحديدالترسيني أحادي الفوسفات 5 'عن طريق تحديد الهياكل الثانوية RNA المحيطة 1،12. ومن المعروف جيدا أن الهياكل الثانوية RNA مثل tRNA وT-عنصر يمكن التوسط في تشكيل نهاية نسخة الميتوكوندريا عن طريق توجيه الانقسامات الإندونوليولية من RNase P و / أو RNase Z12،18،19، 20. ولذلك، فإن تلك الأرمنة 5 'المتاخمة لtRNA أو عنصر ر ينبغي أن تستمد من المعالجة ما بعد النسخ وتحتوي على أحادي الفوسفات.
باستخدام هذا البروتوكول، تم تحديد جزء كبير من النصوص ثابت ة في الميتوكوندريا الذرة1. ومع ذلك، لم يتم تمييز عدد قليل و /أو تعيين لسبب غير معروف1. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن موقف 5 'termini النص من الأفضل أن تؤكد من خلال تحليل التمديد التمهيدي، على الرغم من أنه مدرج في هذا البروتوكول. بسبب عدم وجود بيانات تجريبية، ونحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة لأنواع النباتات الأخرى، مثل الأرز(أوريزا ساتيفا) وأرابيدوبويس. وإلى جانب الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع كل من النصوص الأولية والمجهزة بشكل كبير في plastids21، ومن غير المؤكد ما إذا كان يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لرسم الخرائط والتمييز بين النصوص اللاستيّسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31600250، Y.Z.)، ومشاريع العلم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201804020015، H.N.)، ونظام البحوث الزراعية الصينية (رقم المنحة. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R.
