Summary
We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.
Abstract
In de mitochondriën van de plant, sommige steady-state transcripten hebben 5 ' trifosfaat afgeleid van transcriptie initiatie (primaire transcripten), terwijl de anderen bevatten 5 ' monofosfaat gegenereerd post-transcriptioneel (verwerkte transcripties). Om onderscheid te maken tussen de twee soorten transcripties, zijn verschillende strategieën ontwikkeld, en de meeste ervan zijn afhankelijk van aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat. Echter, het trifosfaat op primaire 5 ' Termini is instabiel, en het belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripten. Om de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn opgebouwd in maïs mitochondrion systematisch te differentiëren en in kaart te krijgen, hebben we een circulaire RT-PCR (cRT-PCR)-gebaseerde strategie ontwikkeld door de combinatie van cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase Treatment, kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) en Northern Blot. Als een verbetering, deze strategie omvat een RNA normalisatie stap om de invloed van unstable 5 ' trifosfaat te minimaliseren.
In dit protocol wordt het verrijkte mitochondriale RNA voorbehandeld door RNA 5 ' polyphosphatase, dat 5 ' triphsophate naar monofosfaat converteert. Na circularisatie en omgekeerde transcriptie worden de twee Cdna's die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door maïs 26S volwassen rRNA, die een verwerkte 5 ' end heeft en ongevoelig is voor 5 ' poly fosfatase. Na normalisatie worden de primaire en verwerkte transcripten gediscrimineerd door het vergelijken van cRT-PCR-en RT-qPCR-producten die zijn verkregen uit de behandelde en niet-behandelde Rna's. Het transcript Termini wordt bepaald door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en vervolgens geverifieerd door Northern Blot.
Door deze strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion vastgesteld. Vanwege het gecompliceerde transcript patroon van sommige mitochondriale genen, werden een paar steady-state Transcripten niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht, hoewel ze in een Northern Blot werden aangetroffen. We zijn er niet zeker van of deze strategie geschikt is om de steady-state transcripten in andere mitochondriën van de plant of in plastiden te discrimineren en in kaart te krijgen.
Introduction
In de mitochondriën van de plant, veel volwassen en precursor rna's worden opgebouwd als meerdere isoforms, en de steady-state transcripten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen op basis van het verschil op hun 5 ' eindigt1,2,3, 4. De primaire transcripten hebben 5 ' trifosfaat uiteinden, die zijn afgeleid van transcriptie initiatie. De verwerkte transcripten daarentegen hebben 5 ' monofosfaat gegenereerd door post-transcriptionele verwerking. Discriminatie en mapping van de twee soorten transcripten zijn belangrijk voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen onderliggende transcriptie en transcriptie einde rijping.
Om onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in de mitochondrion van de fabriek, zijn vier belangrijke strategieën ontwikkeld. De eerste strategie is het pre-behandelen van de mitochondriale Rna's met tabaks zuur pyrofosfatase (TAP), die 5 ' trifosfaat naar monofosfaat converteert en maakt het mogelijk primaire transcripten om te worden gecircuariseerd door RNA ligase. De transcriptie van de door tap behandelde en niet-behandelde RNA-monsters wordt vervolgens vergeleken met een snelle versterking van de cDNA-uiteinden (RAS) of de circulaire RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. In de tweede strategie worden verwerkte transcripten in de eerste plaats uitgeput van mitochondriale rna's met behulp van Terminator 5 '-fosfaat-afhankelijke exonuclease (tex), en de primaire transcripten links worden vervolgens in kaart gebracht door de primer extensie analyse5,6 . De derde strategie is de pre-Cap van de primaire transcripten met guanylyl transferase, en dan is de positie van trifosfated 5 ' Termini wordt bepaald door primer uitbreiding samen met ribonuclease of S1 Nuclease bescherming analyse7,8 ,9. Verschillend van die afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, de vierde strategie combineert in vitro transcriptie, site-gerichte mutagenese, en primer extensie analyse om de putende promotors karakteriseren en bepalen de transcriptie initiatie plaatsen8,10,11. Door het gebruik van deze strategieën, veel primaire en verwerkte transcripten zijn vastgesteld in de mitochondriën van de plant.
Echter, verschillende studies hebben gemeld dat de 5 ' trifosfaat van primaire transcripten waren instabiel, en ze werden gemakkelijk omgezet in monofosfaat voor onbekendereden2,4,12,13. Dit probleem belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripties met behulp van technieken, afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, en eerdere pogingen om systematisch onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in plant mitochondriën mislukte2,12.
In dit protocol combineren we cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase Treatment, RT-qPCR en Northern Blot om systematisch de primaire en verwerkte transcripten te onderscheiden die stabiel zijn opgebouwd in maïs (Zea mays) mitochondrion (Figuur 1). cRT-PCR maakt gelijktijdige mapping mogelijk van 5 ' en 3 ' extremiteiten van een RNA-molecuul, en het is meestal aangepast aan de map transcript Termini in planten2,12,14,15. RNA 5 ' poly fosfatase kan twee fosfaten uit het trifosfaat 5 ' Termini verwijderen, waardoor de primaire transcripten beschikbaar zijn voor zelf-ligatie door RNA ligase. Eerdere studies toonden aan dat volwassen 26s rRNA in maïs 5 ' eindpunt had verwerkt en ongevoelig was voor RNA 5 ' poly fosfatase1,16. Om de invloed van unstable trifosfaat op primaire 5 ' Termini te minimaliseren, worden de 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door volwassen 26s rRNA, en de primaire en verwerkte transcripten worden vervolgens gedifferentieerd door het vergelijken van de cRT-PCR-producten verkregen uit de twee RNA-monsters. De cRT-PCR-mapping en de discriminatie resultaten worden gecontroleerd door respectievelijk Northern Blot en RT-qPCR. Tot slot worden alternatieve primers gebruikt om die transcripten die in Northern Blot zijn gedetecteerd, maar niet door cRT-PCR, te versterken. Door deze cRT-PCR-gebaseerde strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion gedifferentieerd en toegewezen1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp van de primer
- Ontwerp genspecifieke primers voor reverse transcriptie (RT) met behulp van PCR-primer ontwerp software (Inhoudsopgave) op basis van de algemene regels van Primer design17.
Opmerking: RT-primers zijn zeer specifiek voor de doel transcripten, en ze zijn over het algemeen verankerd op het 5 ' deel van programmeer sequenties (volwassen Mrna's en precursor Rna's), of ~ 500 – 600 NT stroomafwaarts van de verwachte 5 ' end (18S en 26S rRNAs). - Ontwerp paren van uiteenlopende primers om de gecircuariseerde transcripten te versterken door cRT-PCR.
Opmerking: de gepaarde divergente primers flankeren de 5 '-3 ' kruising van de circularized transcripten en hun posities variëren tussen de geanalyseerde doel transcripties (figuur S1). Sommige transcripten hebben lange UTRs; bijvoorbeeld, nad2-1 5 ' UTR en rps4-1 3 ' UTR zijn 1.985 en 1826/1834 NT, respectievelijk1. Als beide primers zijn verankerd in de coderende regio, zal het moeilijk zijn om de doel transcripten te versterken. Daarentegen zijn sommige UTRs kort; bijvoorbeeld, de 3 ' UTRs van nad2-1 en nad4-1 zijn 34/35 en 29 – 31 NT, respectievelijk1. Als de gekoppelde primers zich ver van de codeer sequenties bevinden, zal de PCR mislukken. Over het algemeen zijn twee paren van uiteenlopende primers ontworpen voor elke doel transcripten, terwijl meerdere paren nodig kunnen zijn om diegenen in kaart te stellen waarvan de transcript patronen ingewikkeld zijn en/of UTRs erg lang zijn. - Ontwerp paren van convergerende primers voor het bereiden van RNA-sondes voor Northern Blot.
Opmerking: De gekoppelde primers bevinden zich op de codeer regio van het doel-gen en de grootte van het PCR-product moet in het bereik van 100 tot 1.000 BP liggen. Elke voorwaartse primer moet een restrictie-enzym site bevatten om vector sequenties in de resulterende probes te minimaliseren.
2. bereiding van de ruwe mitochondrion van maïs die kernels ontwikkelt
- Steriliseren van pestels, mortels, glazen trechters, tubes en tips van autoclaaf, en droog ze in de oven.
- Voer alle procedures uit bij 4 °C of op ijs en pre-cool alle oplossingen.
- Bereid 100 mL extractiebuffer (EB), samengesteld uit 0,3 M sucrose, 5 mM Tetrasodium diphosphate pyrofosfaat, 10 mM KH2po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] Polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] boviene serumalbumine, 5 mm L-cysteïne en 20 mm ascorbinezuur. Breng aan op pH 7,3 met KOH en steriliseren door filtratie.
- Bereid 100 mL wasbuffer (WB) bestaande uit 0,3 M sucrose, 1 mM EGTA en 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur). Aan te passen aan pH 7,2 met NaOH en steriliseren door filtratie.
Opmerking: Er wordt voorgesteld om EB en WB te bereiden met DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O. - Verzamel 20 g ontwikkelende kernels bij 11 – 20 dagen na bestuiving (DAP) naar een buis van 50 mL, geplaatst op ijs, en breng vervolgens de kernels over naar voorgekoelde mortels.
Opmerking: Gebruik een verhouding van 100 mL EB tot 20 g maïs pitten. - Voeg 10 – 20 mL ijskoud EB toe aan elke mortel en slijp de pitten volledig.
- Voeg meer EB toe en filtreer de grond weefsels door twee lagen filterdoek (tabel met materialen).
- Centrifugeer het filtraat bij 8.000 x g gedurende 10 minuten en gooi de pellet weg.
- Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en Centrifugeer het gedurende 10 minuten op 20.000 x g .
- Giet het supernatant af en regeef de pellet in 6 mL WB.
- Aliquot de suspensie tot vijf 1,5 mL RNase-vrije buizen en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 14.000 x g .
- Gooi het supernatant weg, Vries de mitochondriale pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C.
3. extractie van mitochondriaal RNA
- Extract mitochondriale RNA met een commercieel reagens (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
Let op: Dit reagens bevat fenol en guanidine isothiocyanaat. Werk ermee in een rook afzuigkap en draag een labjas en handschoenen. - Los het geïsoleerde mitochondriale RNA op in DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O en schat de RNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer (tabel met materialen).
Opmerking: In het algemeen, ~ 250 μg mitochondriale RNA wordt verkregen uit 20 g van 15-DAP maïs kernels. - Bereid één agarose gel samengesteld uit 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1mM EDTA), 1,5% agarose (tabel van de materialen), en 1x nucleaire kleuring Dye (tabel van de materialen).
- Voeg een geschikt volume van 10x laad buffer (0,5% broomfenolblauw, 0,5% xyleen cyanol FF en 50% glycerol), en load mitochondriale RNA/laden buffer mengsel op de 1,5% agarose gel.
- Voer de gel in 1x TAE buffer bij 5 – 6 V/cm gedurende 20 – 25 minuten en evalueer de mitochondriale RNA-integriteit door de gel te voorzien van een gel-documentatiesysteem (tabel met materialen).
Opmerking: De aanwezigheid van twee verschillende bands (~ 3.510 en ~ 1.970 NT voor maïs mitochondriale 26S en 18S rRNAs, respectievelijk) is een acceptabele standaard voor intact mitochondriaal RNA. Om mogelijke degradatie uit te sluiten, moet de RNA-integriteit worden onderzocht tijdens de meervoudige stappen van een circularized RNA-preparaat (Figuur 2).
4. RNA 5 ' poly fosfatase behandeling
- Stel RNA 5 ' poly hosphatase (tafel en materiaal) behandeling (tabel1) in en Inbroed bij 37 °c gedurende 30 – 60 minuten.
- Herstel het 5 ' poly fosfatase-behandelde RNA met een RNA zuiverings pakket (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- Herhaal de stappen 3,3 tot en met 3,5.
5. RNA Circularisatie
- Bereid twee circularisatie reacties met dezelfde hoeveelheden van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde mitochondriale Rna's (tabel 2), en incureer beide reacties bij 16 °c gedurende 12 – 16 uur.
- Herstel de twee sets zelfdragende Rna's met dezelfde Kit als in stap 4,2.
Opmerking: Opgemerkt moet worden dat slechts een fractie van mitochondriaal RNA zelf wordt geligeerd, en het herstelde RNA een mengsel van lineaire en circularized transcripten zal zijn. - Herhaal de stappen 3,3 tot en met 3,5.
6. omgekeerde transcriptie
- Synthetiseren twee sets Cdna's uit dezelfde hoeveelheden circularized 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's (200 ng).
- Maak een primer mengsel door een gelijke verhouding van 26S-CRT en tot 7 andere RT-primers toe te voegen.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van het primer mengsel moet 1 μM zijn. - Bereid twee voor mengsels door de in tabel 3vermelde reagentia te combineren, inbroed bij 65 °c gedurende 5 minuten en ontspan vervolgens 2 minuten op ijs.
- Monteer twee RT-reactie systemen (tabel 4) en inbroed ze bij 42 °c gedurende 50 min.
- Verwarm beide RT-reacties bij 70 °C gedurende 5 minuten en chill ze vervolgens op ijs.
7. normalisering
- Bereid twee PCR-reacties voor door hetzelfde volume sjabloon Cdna's toe te voegen, afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde of niet-behandelde Rna's, afwijkende primers die de 5 '-3 ' kruising van circularized 26S rRNA (d.w.z. 26S-CF1 en-CR1), etc. (tabel 5) flaneren.
- Voer de twee reacties uit in een thermische cycler (tabel met materialen) onder de in tabel 6beschreven omstandigheden.
- Bereid een agarose gel samengesteld uit 1x TAE buffer, 1,0% agarose en 1x Nuclear kleuring Dye.
- Voeg 2 μL 10x laad buffer (0,5% broomfenolblauw, 0,5% xyleen cyanol FF en 50% glycerol) toe aan elk van de twee PCR-producten en laad ze op de gel.
- Voer de gel in 1x TAE buffer bij 5 – 6 V/cm voor 30 – 40 min, en beeld het met behulp van hetzelfde gel-documentatiesysteem als stap 3,5.
- Vergelijk de overvloed van de twee PCR-producten met behulp van computer software (tabel met materialen, figuur 4a) en Optimaliseer de normalisatie door de bedragen van de sjabloon cdna's zo nodig te wijzigen.
8. PCR-versterking
- Bereid paren van PCR-reacties voor door het juiste volume van de genormaliseerde Cdna's toe te voegen en een paar afwijkende primers flankerende 5 '-3 ' kruising van de doel transcripten (tabel 7).
Opmerking: De hoeveelheid sjabloon cDNAs die wordt gebruikt voor PCR-amplificatie van de doel transcripten, wordt bepaald door het 26S rRNA normaliserings resultaat. - Voer de PCR-reacties uit volgens het programma dat wordt beschreven in tabel 8.
- Herhaal de stappen 7,3 tot en met 7,5.
- Ga naar geneste divergente primers en verifieer de eerste ronde PCR-resultaten door de stappen 8,1 en 8,2 te herhalen.
- Herhaal de stappen 7,3 tot en met 7,5.
- Herstel de prominente bands die kunnen worden herhaald in twee rondes van PCR-versterking met behulp van een gel DNA-herstel Kit (tabel met materialen).
9. bepaling van het transcript Termini
- Kloon de gel-gezuiverde PCR-producten in een Blunt-end vector (tabel met materialen) met behulp van standaardtechnieken.
- Voer Colony PCR uit om positieve klonen met de doel inserts te selecteren en deze commercieel te sequenties.
Opmerking: Positieve klonen met wisselplaten met variabele grootte worden meestal gedetecteerd uit een enkele herstelde band omdat veel steady-state transcripten in de mitochondriale plant heterogene 5 ' en/of 3 ' eindigt1,12. - Lijn de sequentiaire gegevens uit met maïs mitochondriale genoom met behulp van Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) van het National Center for Biotechnology Information (NCBI). Kies organisme "maïs (taxid: 4577)", en zoekdata base "nucleotide collectie (nr/NT)".
- Zoek de 5 '-3 ' kruising van de circularized transcript, en bepaal de posities van 5 ' en 3 ' Transcript Termini.
- Bereken de grootte van doel transcripten.
10. verificatie van de cRT-PCR-mapping resultaten door RNA gel Blot-hybridisatie
Opmerking: RNA gel Blot hybridisatie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële Kit (tabel van materialen), die de reagentia bevat voor transcriptie-LABELING van RNA met digoxigenin (dig) en T7 RNA polymerase, hybridisatie en immunologische detectie. Raadpleeg de protocollen die in deze kit worden meegeleverd voor meer informatie. Zorg ervoor dat alleen RNase gratis apparatuur wordt gebruikt voor de hele procedure.
- Vergroot het DNA-fragment dat wordt gebruikt om de RNA-sonde voor te bereiden en kloon het naar dezelfde vector als in stap 9,1, die een T7 Promoter 17 BP stroomopwaarts van de insertie site bevat.
- Linearize de constructie met behulp van de juiste restrictie enzym, herstellen van de gelineariseerde plasmide door een DNA-zuiverings pakket (tabel van de materialen), en los het op in dePC behandeld gedeïoniseerd H2O.
- Label RNA probes met DIG-11-UTP door een commerciële Kit (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 500 mL 10x MOPS buffer (0,2 M MOPS, 50 mM natriumacetaat en 10 mM EDTA) met DEPC behandeld gedeïoniseerd H2O. Breng aan op pH 7,0 door NaOH, en steriliseren door filtratie.
- Voeg 2 – 3 volumes van de laad buffer (50% formamide, 6,2% formaldehyde, 1x Mops, 10% glycerol en 0,1% broomfenolblauw) toe aan het mitochondriale RNA dat is bereid in stappen 3.1 – 3.3.
- Denatureren het RNA monster/loading buffer mengsel bij 65 °C gedurende 10 minuten, en vervolgens chill op ijs gedurende 1 minuut.
- Bereid een gedenatureerde agarose-gel (2% formaldehyde, 1,2% agarose en 1x MOPS) en laad het RNA monster/loading buffer mengsel in de gel (1 – 2 μg mitochondriaal RNA per put).
- Run de gel in 1x MOPS bij 3 – 4 V/cm voor ~ 4 h.
- Bereid 2 L van 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitraat, pH 7,0). Behandel het met 0,1% DEPC 's nachts en steriliseer door autoclaaf.
- Spoel de gel twee keer in 20x SSC (15 min elke keer), en overdracht gel RNA naar een nylon membraan (tabel van materialen) door capillaire overdracht met 20x SSC voor 10 – 16 h.
- Bevestig het RNA aan het membraan door gedurende 30 minuten te bakken bij 120 °C.
- Voer RNA-hybridisatie en immunologische detectie uit met een commerciële Kit (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
11. discriminatie van primaire en verwerkte 5 ' einden
- Discrimineert de primaire en verwerkte 5 ' uiteinden door de cRT-PCR-producten te vergelijken die zijn verkregen uit de genormaliseerde 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's.
Opmerking: Voor primaire Transcripten is de overvloed aan PCR-producten uit 5 ' poly fosfatase-behandeld RNA veel hoger dan die van niet-behandelde tegenhanger (Figuur 1, ' Gene A ' en figuur 4a). Voor verwerkte transcripten zou echter een vergelijkbaar niveau van PCR-producten worden versterkt uit de twee sets van mitochondriale Rna's (Figuur 1, ' Gene B '). - Ontwerp RT-qPCR-primers op basis van de cRT-PCR-toewijzingsresultaten.
- Controleer de resultaten van cRT-PCR-discriminatie door RT-qPCR.
Opmerking: De twee cDNA-monsters die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's worden genormaliseerd door de RT-qPCR-producten van 26S mature rRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schatting van mitochondriale RNA circularisatie efficiëntie
In een eerdere studie werden zowel totale als mitochondriale Rna's gebruikt voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), en de twee soorten rna's gaven vergelijkbare mapping resultaten12. In eerste instantie gebruikten we ook Total Rna's voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in maïs. Na veel proeven vonden we dat de doel transcripten moeilijk te detecteren waren. Als een verbetering, we verrijkt het mitochondriale RNA van maïs ontwikkelen kernels, en het maakte de versterking van de circularized target transcripten in een ronde van PCR mogelijk.
Om de eenvoudige versterking van doel transcripten na de verrijking te verklaren, hebben we geschat dat RNA circularisatie-efficiëntie door het uitvoeren van RT-PCRs op representatieve mitochondriale gen nad5 (Figuur 3 en figuur S2). Het maïs nad5 gen bevat twee trans-en twee CIS-splicing introns. Na zelf-ligatie van Total en mitochondriale Rna's, werden de eerste streng cDNAs onafhankelijk gesynthetiseerd met behulp van nad5-RT1 en-RT2 primers. De twee primers konden omkeren transcriberen zowel lineair en circularized nad5 mRNAs (figuur S2). Er worden vier paar convergerende primers gebruikt voor PCR-versterking: sqF1 & sqR1 en sqF2 & sqR2 voor semi-kwantitatieve RT-PCR (RT-sqPCR) en qF1 & qR1 en qF2 & qR2 voor RT-qPCR. Voor cDNAs getranscribeerd door nad5-RT1, alle vier paren van primers gedetecteerd zowel circularized en lineaire Nad5 volwassen mrna's; voor de nad5-RT2 reverse transcriptie reactie ondervraagde SqF2 & SqR2 en QF2 & qR2 beide vormen van mRNA, terwijl SqF1 & SqR1 en QF1 & qR1 PCR-producten alleen werden afgeleid uit circularized nad5 . Op basis van deze analyse gebruikten we de sqF2 & sqR2 (voor RT-sqPCR) en qF2 & qR2 (voor RT-qPCR) PCR-producten om de nad5-RT1 en-RT2 reverse transcriptie reacties te normaliseren en de ratio van circularized nad5 te vergelijken door de sqF1 & sqR1 (voor RT-sqPCR) of qF1 & qR1 (voor RT-qPCR) PCR-producten. Voorafgaand aan zelf-ligatie werden Rna's voorbehandeld door RNA 5 ' polyphosphatase om alle transcripten beschikbaar te maken voor circularisatie door RNA ligase. De RT-sqPCR-analyse toonde een zeer kleine fractie van nad5 mRNA werd gecircuariseerd toen totaal RNA werd gebruikt, maar de verhouding was dramatisch toegenomen toen het verrijkte MITOCHONDRIALE RNA werd gebruikt (Figuur 3b). De RT-qPCR-resultaten toonden aan dat de ratio van zelf-ligated nad5 mRNA steeg van 3,7% naar 32% na de verrijking (figuur 3c). Analyse van nad1 gaf vergelijkbare resultaten, en de circularisatie-efficiëntie van nad1 mRNA steeg van 0,7% naar 30% (figuur 3D-F).
Per deze analyses, ongeveer 30% maïs mitochondriale Rna's waren zelf-ligated na de verbetering, en de verhoogde circularisatie efficiëntie verklaart de eenvoudige detectie van de doel transcripten door cRT-PCR.
Bepaling van maïs COX2 mRNA Termini met behulp van de cRT-PCR-gebaseerde strategie
We gebruikten het COX2 -gen als voorbeeld om de mapping en discriminatie van mitochondriale transcripten van maïs te introduceren met behulp van de CRT-PCR-gebaseerde strategie (Figuur 4).
In het begin van de mapping COX2 mRNA werden drie naar buiten gerichte PRIMERS CF1, CF2 en cr1 ontworpen op de gencoderende regio (figuur 4D). CF1 en CF2 waren genest primers, en CF2 was 69 BP stroomafwaarts van CF1. Met behulp van de sjabloon cDNAs gesynthetiseerd in stappen 6.1 – 6.5 en genormaliseerd in stappen 7.1 – 7.6, de CF1 & CR1 primer paar versterkte twee prominente bands, en de versterkings resultaten werden herhaald door geneste primers CF2 & CR1 (figuur 4a). Bovendien werden de twee bands sterk versterkt uit het 5 ' polyphsophatase-behandelde RNA, terwijl ze moeilijk te detecteren waren in de niet-behandelde tegenhanger, wat suggereert dat ze gevoelig zijn voor RNA 5 ' polyphsophatase en een primaire 5 ' Termini hebben.
De twee kandidaat-bands werden COX2-1 en-2 genoemd, en ze werden onafhankelijk van de agarose-gel teruggewonnen en gekloond in vectoren. Kolonie PCR-resultaten toonden aan dat de positieve klonen wisselplaten met variabele grootte bevatten, wat een heterogene 5 ' en/of 3 ' Termini van de transcripten impliceert (Figuur 5). De positieve klonen werden commercieel gesequentieerd en de sequentie gegevens werden afgestemd op het mitochondriale genoom van maïs, zoals beschreven in stap 9,3.
De sequentie-en uitlijnings resultaten toonden aan dat de twee transcripten identiek waren aan 3 ' uiteinden, maar verschillend in de lengte van 5 ' UTRs (figuur 4D). De 5 ' uiteinden van COX2-1 en-2 werden verrijkt op 992-1030 en 1276-1283 NT stroomopwaarts van aug, respectievelijk, terwijl hun 3 ' einde was 39 NT stroomafwaarts van de halte codon. Afgeleid van de cRT-PCR-resultaten waren de berekende grootten van COX2-1 en-2 respectievelijk 1804 – 1832 en 2088 – 2095 NT.
Om de cRT-PCR-toewijzingsresultaten te controleren, werd RNA gel Blot hybridisatie uitgevoerd met behulp van de sonde afgeleid van COX2 gencoderende regio, en twee grote bands met vergelijkbare grootte als COX2-1 en-2 werden gedetecteerd (figuur 4c). Daarnaast werden er twee grotere bands over 2.500 en 2.800 NT aangetroffen in de Northern Blot, maar ze werden niet versterkt door cRT-PCR. De twee grotere bands werden respectievelijk COX2-3 en-4 genoemd. Om ze in kaart te brengen, werden nog twee naar buiten gerichte primers (d.w.z. CR2 en CF3), verankerd op de 5 ' en 3 ' UTRs van COX2-2, ontworpen en hun posities waren dicht bij de verwachte transcript uiteinden van COX2-3 en-4. Met behulp van het primer paar CF3 & CR2 werden twee belangrijke bands sterk versterkt van Cdna's afgeleid van 5 ' polyphsophatase-behandeld RNA, maar niet van de niet-behandelde tegenhanger (figuur 4a). De sequentie resultaten toonden aan dat ze identieke 5 ' Termini hadden, terwijl variable 3 ' eindigt. De berekende grootte van de twee transcripten was respectievelijk 2512/2513 en 2833-2835 NT, en ze waren dicht in grootte met de twee grotere bands gedetecteerd in de Northern Blot. Bovendien suggereerden de cRT-PCR-resultaten dat cox2-3 en-4 primair 5 ' Termini hebben.
Om de discriminatie resultaten te bevestigen, zijn vijf naar buiten gerichte primers ontworpen volgens de cRT-PCR-toewijzingsresultaten, d.w.z. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 en qCR3, en de primer paren qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 en qCF2 & qCR3 werden gebruikt voor RT-qPCR-analyse van respectievelijk COX2-1,-2,-3 en-4. De relatieve overvloed van alle vier de RT-qPCR-producten in 5 ' polyphsophatase-behandeld monster waren veel hoger dan die in de niet-behandelde tegenhanger, die de resultaten van cRT-PCR-discriminatie bevestigt.
Samenvattend, het transcript patroon van maïs COX2 gen is ingewikkeld en de CRT-PCR-gebaseerde strategie discrimineert en wijst de meervoudige isovormen van COX2 mRNA effectief toe.
Figuur 1: overzicht van de cRT-PCR-gebaseerde strategie. Illustratie van de belangrijkste stappen van de cRT-PCR-gebaseerde strategie. 5 ' + en 5 '-= de twee RNA-monsters behandeld en niet-behandeld door RNA 5 ' poly hosphatase, respectievelijk. De twee cDNA-monsters die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's worden genormaliseerd door 26S volwassen rRNA in maïs, en de primaire en verwerkte transcripten worden gediscrimineerd door het vergelijken van de cRT-PCR-producten. Voor Gene A heeft het corresponderende RNA een primair 5 ' uiteinde omdat het PCR-product overvloed van 5 ' poly fosfatase-behandeld RNA veel hoger is dan dat van de niet-behandelde tegenhanger; voor Gene B worden de PCR-producten van de twee sets van mitochondriale Rna's op een vergelijkbaar niveau versterkt, wat een verwerkt 5 ' eindpunt van het corresponderende RNA impliceert. De codering regio en UTRs worden vertegenwoordigd door respectievelijk grijs vak en vette lijnen. CRT = primer voor omgekeerde transcriptie; CF1, CF2, CR1 en CR2 = PCR-primers flaneren de 5 '-3 ' kruising van de gecircuariseerde transcriptie; qCF en qCR = divergerende primers voor RT-qPCR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: evaluatie van de mitochondriale RNA-integriteit door agarose gel elektroforese. A) mitochondriale rna's bereid uit 15-DAP maïs pitten. M = moleculaire DNA-marker. (B) mitochondriaal RNA van de kernel na de behandeling met 5 ' poly fosfatase en/of circularisatie door T4 RNA ligase. 5 ' + = mitochondriaal RNA na de behandeling door 5 ' polyphosphatase; T4 & 5 ' + = mitochondriale RNA na de behandeling door 5 ' polyphosphatase en circularisatie door T4 RNA ligase; T4 & 5 '-= mitochondriale RNA na circularisatie alleen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Circularisatie-efficiëntie van nad5 en nad1 MRNA'S geschat door RT-PCRs. (A) en (D) schematisch diagram van respectievelijk nad5 -en nad1 -genen. Ex = Exon. Exonen en intronen worden respectievelijk weergegeven als grijze dozen en gebogen lijnen. De positie van omgekeerde transcriptie primers RT1 en RT2 worden aangeduid met pijlen. Zwarte stippen geven de positie van PCR-primers aan en de voorspelde grootte van de PCR-producten wordt weergegeven. sqF1, sqF2, sqR1 en sqR2 zijn primers voor RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 en qR2 zijn primers voor RT-qPCR. B) en (E) RT-sqpcr-analyse van de circularisatie-efficiëntie van respectievelijk nad5 en nad1 mrna's. M = moleculaire DNA-marker. C) en (F) Rt-qPCR-analyse van de circularisatie-efficiëntie van respectievelijk nad5 en nad1 mrna's. De twee cDNA-samples die zijn omgekeerd getranscribeerd door RT1 en RT2 primers worden genormaliseerd door sqF2 & sqR2 (voor RT-sqPCR) of qF2 & qR2 (voor RT-qPCR) PCR-producten. De circularisatie-efficiëntie van nad5 en nad1 mrna's wordt geschat door het vergelijken van de PCR-producten van sqF1 & sqR1 (voor RT-sqpcr) of qF1 & qR1 (voor Rt-qPCR). circularized/(circuarized + lineair) = qF1 & qR1 over qF2 & qR2 in RT2-reactie/qF1 & qR1 over qF2 & qR2 in RT1-reactie. Waarden zijn gemiddelden en SDs van drie biologische replicaten. Om de potentiële invloed van 5 ′ trifosfaat uit te sluiten, werden de Rna's behandeld met 5 ′-poly fosfatase voorafgaand aan zelf-ligatie. Totaal en Mito = totaal en mitochondriale Rna's, respectievelijk. RT1 en RT2 = cDNAs reverse getranscribeerd door RT1 en RT2 primers, Klik dan hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: mapping van COX2 volwassen mRNA Termini met behulp van de CRT-PCR-omhulde strategie. A) gel scheiding van COX2 cRT-PCR-producten. + en-= cDNAs afgeleid van 5 ′-polyfosfatase-behandelde en niet-behandelde mitochondriale Rna's, respectievelijk. De twee cDNA-samples werden genormaliseerd door versterking van 26S cDNA (26s). Vijf primers worden gebruikt voor cRT-PCR-analyse van circularized COX2 mRNA: CF1, CF2 en CF3 zijn geneste PRIMERS en CF2 en CF3 zijn respectievelijk 69 en 138 BP stroomafwaarts van CF1; CR1 en CR2 zijn geneste primers en CR2 is 1.288 bp stroomopwaarts van CR1. De bands aangeduid met ' 1 ' en ' 2 ' werden versterkt door zowel CF1 & CR1 en CF2 & CR1, terwijl de ' 3 ' en ' 4 ' bands werden versterkt door CF3 & CR2. Alle vier de bands werden gesequenced door klonen. De door asterisken gemarkeerde bands konden niet worden herhaald en ze werden uitgesloten van de resultaten. M = moleculaire DNA-marker. B) Rt-qPCR-analyse van de relatieve overvloed aan circularized COX2 mRNA na 5 ' polyphosphatase-behandeling. De twee cDNA-samples werden gesynthetiseerd door een primer mengsel met 26S-CRT, COX2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, COB-CRT en cox1-CRT bij gelijke verhouding, en de cDNA afgeleid van 26S mature rRNA werd gebruikt voor normalisatie. +/-= COX2 meer dan 26s in behandelde monster/Cox2 meer dan 26s in niet-behandelde monster. Waarden vertegenwoordigen middelen en SD van drie biologische replicaten. De voor RT-qPCR gebruikte primers zijn geïndiceerd. C) analyse van de Northern Blot van COX2 transcripten. 2 μg mitochondriaal RNA werd geladen. De banden corresponderen met verschillende isovormen van COX2 volwassen mRNA zijn gemarkeerd. (D) afschrift Termini van COX2 mRNA afgeleid van cRT-PCR-resultaten. UTRs en open reading frames worden respectievelijk vet lijnen en grijze vakken weergegeven. De posities van 5 ' en 3 ' Termini ten opzichte van AUG (+ 1) en UAA (-1), en de aantallen enkelvoudige klonen die op die posities zijn gesequenced, worden weergegeven. De posities van omgekeerde transcriptie-en PCR-versterkings primers worden respectievelijk gesloten en geopende pijlkoppen weergegeven. Naar buiten gerichte primers die worden gebruikt voor RT-qPCR worden weergegeven als open pleinen en de positie van COX2 sonde is zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: selectie van positieve klonen met COX2-4 wisselplaten door kolonie PCR. A) kolonie PCR om enkelvoudige klonen met COX2-4 inserts te maken. De grootte van COX2-4 insert is ongeveer 1.165 BP, en die van de vector sequenties is 100 BP. De berekende grootte van kolonie PCR-producten is ongeveer 1.265 BP, en die klonen met kleine formaat inserts werden niet gesequentieerd, dat wil zeggen, nummers 11, 14, 22 en 23. B) de resultaten van de sequentiëren van de positieve klonen die zijn vertoond onder a). 5 '/3 ' eindigt = de 5 ' en 3 ' uiteinden ten opzichte van AUG (+ 1) en UAA (-1), respectievelijk. De sequentie resultaten van de nummers 12 en 20 werden uitgesloten omdat ze veel kleiner waren dan de andere. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Component | Volume voor een reactie van 50 μL (μL) | Eindconcentratie |
| 10x RNA 5 ' poly fosfatase buffer | 5 | 1x |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 0,75 | 0,6 U/μL |
| Mitochondriaal RNA | X | 0,2 μg/μL |
| RNA 5 ' poly fosfatase (20 U/μL) | 2,5 | 1 U/μL |
| DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O | tot 50 μL | - |
Tabel 1: reactie componenten van RNA 5 ' polyphosphatase Treatment.
| Component | Volume voor een reactie van 20 μL (μL) | Eindconcentratie |
| 10x T4 RNA ligase I buffer | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 μM |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15 |
| RNA-remmer (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| 5 ' poly fosfatase-behandeld of niet-behandeld mitochondriaal RNA | X | 0,1 ~ 0,2 μg/μL |
| T4 RNA ligase I (30 e/μL) | 0,4 | 0,6 U/μL |
| DEPC behandeld met gedeïoniseerd H2O | tot 20 μL | - |
Tabel 2: reactie componenten van mitochondriale RNA circularisatie.
| Component | Volume van 10 μL vóór mengsel (μL) |
| Primer mengsel (1 μM totaal)a | 2 |
| dNTP mengsel (10 mM elk) | 1 |
| Circularized 5 ' polyphosphatase-behandeld of niet-behandeld mitochondriaal RNAb | X |
| DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O | tot 10 μL |
Tabel 3: pre-mengsel voor omgekeerde transcriptie reactie. een heel Het primer mengsel bevat een gelijke verhouding van 26S-CRT en tot 7 andere RT-primers, en de uiteindelijke concentratie is 1 μM. btwee voor mengsels worden naast elkaar bereid en bevatten dezelfde hoeveelheid (200 ng) circularized 5 ' polyphosphatase-behandeld of niet-behandelde mitochondriale RNA.
| Component | Volume voor een reactiesysteem van 20 μL (μL) | Eindconcentratie |
| Sjabloon RNA/primer/dNTP * | 10 | - |
| 5x RTase buffer | 4 | 1x |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| DEPC behandeld met gedeïoniseerd H2O | tot 20 μL | - |
Tabel 4: reactie componenten van omgekeerde transcriptie. * De voor mengsels van template RNA/primer/dNTP voorbereid bij stap 6,3.
| Component | Volume voor een reactiesysteem van 20 μL (μL) | Eindconcentratie |
| Gedeïoniseerd H2O | 7 | - |
| 2x reactiebuffer | 10 | 1x |
| dNTP mengsel (10 mM elk) | 0,4 | 0,2 mM per stuk |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| 26S-CR1 (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Templates cDNA afgeleid van circularized 5 ' polyphosphatase-behandeld of niet-behandelde Rna's * | 0,6 | - |
| DNA-polymerase (1 U/μL) | 0,4 | 0,02 U/μL |
Tabel 5: reactie componenten voor PCR-amplificatie van 26S cDNA. * In eerste instantie wordt het gelijke volume van de template cDNAs (0,6 μL) gebruikt voor normalisering. Verander zo nodig de hoeveelheden sjabloon Cdna's om te zorgen voor dezelfde overvloed aan 26S PCR-producten tussen de twee PCR-reacties.
| Stap | Temperatuur | Tijd | Cyclusnummer |
| Initiële denaturatie | 95 °C | 3 min. | 1 cyclus |
| Denaturatie | 95 °C | 15 sec | 22 – 25 cycli |
| Primer gloeien | 56 °C | 15 sec | |
| Extensie | 72 °C | 30 sec | |
| Final extensie | 72 °C | 5 min. | 1 cyclus |
| Houden | 4 °C | ∞ | - |
Tabel 6: PCR-condities om te versterken 26s cDNA voor normalisatie.
| Component | Volume voor een reactiesysteem van 20 μL (μL) | Eindconcentratie |
| Gedeïoniseerd H2O | tot 20 μL | - |
| 2x reactiebuffer | 10 | 1x |
| dNTP mengsel (10 mM elk) | 0,4 | 0,2 mM per stuk |
| Afwijkende primer-voorwaarts (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Divergente primer-achteruit (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Template cDNA afgeleid van de circularized 5 ' polyphosphatase-behandelde of niet-behandelde Rna's * | X | - |
| DNA-polymerase (1 U/μL) | 0,4 | 0,02 U/μL |
Tabel 7: reactie componenten voor PCR-versterking van de circularized target transcripten. * Het volume van de template cDNAs gebruikt in deze reacties wordt bepaald door de 26s rRNA normalisatie resultaten.
| Stap | Temperatuur | Tijd | Cyclusnummer |
| Initiële denaturatie | 95 °C | 3 min. | 1 cyclus |
| Denaturatie | 95 °C | 15 sec | 22-40 cycli c |
| Primer gloeien a | 50-65 °C | 15 sec | |
| Extenstion b | 72 °C | 0.5-1 min | |
| Finatl extensie | 72 °C | 5 min. | 1 cyclus |
| Houden | 4 °C | ∞ | - |
Tabel 8: PCR-voorwaarden om de doel transcripten te versterken. een heel Het exacte gloeien is afhankelijk van de smelttemperatuur van de PCR-primers. b De rek tijd is afhankelijk van de lengte van het te worden versterkt doel. Aanbevolen tijd is 1 minuut per 1 KB van het PCR-fragment. c Over het algemeen zijn 30 ~ 35 cycli voldoende om een adequate hoeveelheid PCR-product te produceren. Voor lage overvloedige transcripten, Verhoog het aantal cycli tot 40 cycli.
Afbeelding S1: positie van primers voor representatieve maïs mitochondriale transcripten. CRT = omgekeerde transcriptie primer; CF1, CF2, CR1 en CR2 = afwijkende primers voor PCR-versterking; qCF en qCR = divergerende primers voor RT-qPCR. De transcriptie Termini van maïs nad2-1, rps4-1 en nad4-1 zijn eerder vastgesteld (Zhang et al., 20191). Posities van 5 '-en 3 '-uiteinden ten opzichte van AUG (+ 1) en de laatste nucleotide van halte codon (-1) worden weergegeven. De coderings gebieden en UTRs worden respectievelijk aangeduid als grijze dozen en vetgedrukte lijnen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2: principe om de efficiëntie van circularisatie van nad5 mRNA in maïs te schatten. In een zelf-ligatie reactie wordt slechts een fractie van mitochondriale Rna's gecircuariseerd. Voor het berekenen van de verhouding van circularized nad5 mRNA, twee genen-specifieke primers worden gebruikt voor het synthetiseren van de eerste streng cDNAs, dat wil zeggen, nad5-RT1 en-RT2. In de nad5-RT2 reverse transcriptie (RT)-reactie worden de PCR-producten versterkt door SqF2 & sqR2 (voor RT-sqpcr) en QF2 & qR2 (voor Rt-qPCR) afgeleid van zowel lineaire als circularized nad5, terwijl de sqF1 & sqR1 (voor RT-Sqpcr) en qF1 & qR1 (voor RT-qPCR) PCR-producten zijn afgeleid van alleen circularized nad5 ; in nad5-RT1-reactie konden alle vier de PCR-primers beide vormen van nad5versterken. Om de ratio van circularized nad5 mRNA te berekenen, worden de twee reacties genormaliseerd door SqF2 & SqR2 of QF2 & qR2 PCR-producten. Door de overvloed van sqF1 & sqR1 of qF1 & qR1 PCR-producten tussen de twee RT-reacties te vergelijken, wordt de circularisatie-efficiëntie van nad5 mRNA ruwweg geschat. ex = Exon. Exonen en intronen worden respectievelijk weergegeven als grijze dozen en gebogen lijnen. De posities van nad5-RT1 en-RT2 primers worden aangeduid met pijlen. Zwarte stippen geven de posities van PCR-primers aan en de voorspelde grootte van de PCR-producten wordt weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel S1: informatie over de primer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In een eerdere studie werden de totale en mitochondriale Rna's van celsuspensie cultuur van Arabidopsis gebruikt om de mitochondriale transcriptie Termini door CRT-PCR in kaart te krijgen, en vergelijkbare resultaten werden behaald12. Echter, alleen verrijkt mitochondriaal RNA werd gebruikt voor het in kaart te gaan van de mitochondriale transcript Termini in vele andere studies1,2,3,9. We constateerden dat de verrijking van mitochondriaal RNA een belangrijke stap is voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcriptie Termini in maïs. Na deze verrijking, de verhouding van circularized mitochondriale RNA is dramatisch toegenomen van 0,3% – 3.7% tot ~ 30% (Figuur 3 en figuur S2), waardoor de versterking van circularized target transcripten mogelijk in een ronde van PCR.
De circularisatie-efficiëntie van mitochondriaal RNA werd geschat door RT-PCR-analyse op maïs nad1 en nad5, die beide zijn onderverdeeld in onafhankelijke precursoren door CIS-splicing introns. Omdat de potentiële invloed van de aanwezigheid van precursor Rna's en de variatie van RT-efficiëntie niet kon worden uitgesloten, is dit slechts een ruwe schatting van de echte mitochondriale RNA-circularisatie-efficiëntie.
We veranderde de voorwaarden voor zelf-ligatie door het veranderen van de concentratie van mitochondriale RNA en PEG8000, evenals door het verlengen van de incubatietijd, maar deze veranderingen lijken niet te beïnvloeden mitochondriale RNA circularisatie efficiëntie. Hoewel we niet zeker weten of verdere Percoll gradiënt zuivering de circularisatie-efficiëntie zou kunnen verhogen, is de kwaliteit van de ruwe mitochondrion die in sectie 2 is bereid goed genoeg voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in maïs. Aangezien meerdere rondes PCRs vals positieve resultaten kunnen veroorzaken, maakt de versterking van doel transcripten in één ronde PCR de toewijzingsresultaten betrouwbaarder.
Het 5 ' trifosfaat van primaire Transcripten is instabiel en kan om onbekende redenen worden omgezet in 5 ' monofosfaat. Dit probleem belemmert een duidelijke differentiatie tussen de primaire en verwerkte transcripten door gebruik te maken van benaderingen afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat1,2,4. De volwassen vorm van maïs 26S rRNA heeft een monofosfaat 5 ' end, en het is ongevoelig voor RNA 5 ' poly fosfatase. Om de invloed van de instabiele 5 ' trifosfamte minimaliseren, wordt volwassen 26S rRNA gebruikt om de twee RNA-monsters te normaliseren, behandeld en onbehandeld door 5 ' polyphosphatase, en het is een belangrijke stap om de twee soorten transcripten in maïs te differentiëren Mitochondrion. Na normalisatie kunnen de primaire en verwerkte transcripten worden gediscrimineerd door vergelijking van cRT-PCR-en RT-qPCR-resultaten verkregen uit 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde RNA-monsters. De primaire transcripten zijn gevoelig voor 5 ' poly fosfatase, en ze worden sterk versterkt uit het 5 ' polyphosphatase-behandelde monster, maar niet (of op een zeer laag niveau als gevolg van het onstabiele 5 ' trifosfaat) van de niet-behandelde tegenhanger. Daarentegen worden de verwerkte transcripten op vergelijkbare niveaus tussen de twee monsters gedetecteerd.
In planten, de transcriptie patronen van veel mitochondriale genen zijn nogal ingewikkeld1,2. Bijvoorbeeld, de maïs nad6 en atp6 genen worden uitgedrukt als zowel monocistronen en dicistronen, en nad6, Atp6, en atp6-na6 volwassen mrna's hebben twee, drie, en twee isoforms, respectievelijk. Bovendien is de transcriptie populatie van een mitochondriaal gen eigenlijk een mengsel van precursor, volwassen en afbraak Rna's. PCRs zijn gevoelig voor het versterken van kleine grootte moleculen, en het is moeilijk om alle transcriptie isovormen met behulp van één paar primers te detecteren. Daarom is RNA gel Blot-hybridisatie vereist om de cRT-PCR-toewijzingsresultaten te controleren, en kunnen alternatieve primers nodig zijn om die transcripten te versterken die in Northern Blot zijn gedetecteerd, maar niet door de eerste keer cRT-PCR.
Dit protocol bevat een RT-qPCR-stap om de resultaten van cRT-PCR-discriminatie te controleren. Omdat de meervoudige isovormen van sommige volwassen mrna's zeer dicht in maat1zijn, is het onmogelijk om te bevestigen van alle discriminatie resultaten door Rt-qPCR, en sommige steady-state transcripten werden bepaald door het vergelijken van de cRT-PCR-resultaten tussen de behandelde en niet-behandelde Rna's.
In dit protocol werden de 5 ' en ' 3 ' Termini van de doel transcripten in kaart gebracht door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en wordt het aantal enkelvoudige klonen dat wordt gesequentieerd, beperkt. Als een alternatieve methode kunnen de cRT-PCR-producten worden gesequentieerd door de volgende generatie sequencing, die duizenden moleculen voor één set van stationaire transcripten sequenties en de toewijzingsresultaten nauwkeuriger zouden zijn.
Naast de discriminatie van primair en verwerkt 5 ' Termini door cRT-PCR en Rt-qPCR, kan het monofosfaat 5 ' Termini worden bepaald door identificatie van de omringende RNA secundaire structuren1,12. Het is bekend dat RNA secundaire structuren zoals tRNA en t-element kunnen bemiddelen mitochondriale transcript einde vorming door het regisseren van endonucleolytic decolleté van RNase P en/of RNase Z12,18,19, 20. Daarom moeten die 5 "Termini grenzend aan tRNA of t-element worden afgeleid van de post-transcriptionele verwerking en monophosphaten bevatten.
Door dit protocol te gebruiken, is een groot deel van de steady-state transcripten bepaald in de mitochondriën van de maïs1. Echter, een paar werden niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht voor onbekende reden1. Bovendien vinden we de positie van 5 ' Transcript Termini beter te bevestigen door de analyse van de primer-extensie, hoewel het in dit protocol is opgenomen. Vanwege het gebrek aan experimentele gegevens zijn we er niet zeker van of deze strategie geschikt is voor andere plantensoorten, zoals rijst (Oryza sativa) en Arabidopsis. Naast de mitochondriën van de plant, zowel primaire en verwerkte transcripten zijn stabiel verzameld in plastiden21, en het is onzeker of deze strategie kan worden gebruikt voor het toewijzen en discrimineren de transcripten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects van Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) en het China Agricultural Research systeem (Grant No. AUTO'S-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R.
