Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/60019
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Summary

Vi præsenterer en cirkulær RT-PCR-baseret strategi ved at kombinere cirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatase-behandling og Northern blot. Denne protokol indeholder en normalisering skridt til at minimere indflydelsen af ustabile 5 ' trifosfat, og det er egnet til at diskriminere og kortlægge de primære og forarbejdede udskrifter stabilt akkumuleret i majs mitochondrion.

Abstract

I plante-mitokondrier har nogle Steady-State udskrifter 5 ' trifosfat afledt af transkriptionsinitiering (primære udskrifter), mens de andre indeholder 5 ' monophosphat genereret post-transkriptivt (forarbejdede transkriptioner). At diskriminere mellem de to typer af udskrifter, er flere strategier blevet udviklet, og de fleste af dem er afhængige af tilstedeværelse/fravær af 5 ' trifosfat. Trifosfat i primær 5 ' Termini er imidlertid ustabil, og det hindrer en klar diskrimination af de to typer udskrifter. Vi har udviklet en cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-baseret strategi ved at kombinere cRT-PCR, RNA 5 ' polyfoshpatase-behandling, kvantitativ, for systematisk at differentiere og kort gøre de primære og forarbejdede transskriptioner, der er stabilt akkumuleret i majs mitochondrion. RT-PCR (RT-qPCR) og Northern blot. Som en forbedring omfatter denne strategi et RNA-normaliserings trin for at minimere indflydelsen fra ustabil 5 ' trifosfat.

I denne protokol er det berigede mitokondrielle RNA forbehandlet af RNA 5 ' polyfosfatase, som omdanner 5 ' triphsophad til monophosphat. Efter cirkularisering og reverse transskription, de to cDNAs afledt af 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs er normaliseret med majs 26S modne rRNA, som har en forarbejdet 5 ' ende og er ufølsom over for 5 ' polyfosfatase. Efter normalisering diskrimineres de primære og forarbejdede udskrifter ved at sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter, der er fremstillet af de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkriptionen Termini er bestemt ved kloning og sekvensering af cRT-PCR-produkterne og derefter verificeret af Northern blot.

Ved at bruge denne strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet bestemt. På grund af den komplicerede afskrift mønster af nogle mitokondrie gener, et par Steady-State udskrifter blev ikke differentieret og/eller kortlagt, selv om de blev påvist i en Northern blot. Vi er ikke sikker på, om denne strategi er egnet til at diskriminere og kort de Steady-State udskrifter i andre plante mitokondrier eller i blødninger.

Introduction

I plante mitokondrier akkumuleres mange modne og forløbere RNAs som flere isoformer, og Steady-State udskrifter kan opdeles i to grupper baseret på forskellen på deres 5 ' Ends1,2,3, 4. De primære udskrifter har 5 ' trifosfat ender, som er afledt af transkription indledning. Derimod har de forarbejdede transskriptioner 5 ' monophosphat genereret ved post-transkriptional behandling. Diskrimination og kortlægning af de to typer af udskrifter er vigtigt at optrævle de molekylære mekanismer underliggende transskription og transkriptionen ende modning.

For at skelne mellem de primære og forarbejdede transskriptioner i plante mitokondrier er fire store strategier blevet udviklet. Den første strategi er at pre-behandle mitokondrie RNAs med tobak syre pyrofosfatase (TAP), som konverterer 5 ' trifosfat til monophosphat og gør det muligt for primære udskrifter at være cirkulariseret af RNA-Ligase. Afskriften af TAP-behandlede og ikke-behandlede RNA-prøver sammenlignes derefter ved hurtig forstærkning af cDNA-afslutninger (race) eller cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den anden strategi, er forarbejdede udskrifter først udtømt fra mitokondrie RNAs bruger Terminator 5 '-fosfat-afhængige exonuclease (tex), og de primære udskrifter venstre er derefter kortlagt af primer Extension analyse5,6 . Den tredje strategi er at pre-Cap de primære udskrifter ved hjælp af bundne transferase, og derefter placeringen af triphosphated 5 ' Termini bestemmes af primer udvidelse sammen med ribonuklease eller S1 nuclease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskellig fra dem, afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ' trifosfat, den fjerde strategi kombinerer in vitro transskription, site-instrueret mutagenese, og primer forlængelse analyse til at karakterisere de formodede initiativtagere og bestemme transkriptionen startsteder8,10,11. Ved at bruge disse strategier, mange primære og forarbejdede udskrifter er blevet fastlagt i plante mitokondrier.

Men, flere undersøgelser har rapporteret, at 5 ' trifosfat af primære udskrifter var ustabile, og de var let omdannes til monophosphate for ukendt årsag2,4,12,13. Dette problem hindrer en klar diskrimination af de to typer af udskrifter ved hjælp af teknikker afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ' trifosfat, og tidligere bestræbelser på systematisk at diskriminere mellem de primære og forarbejdede udskrifter i plante mitokondrier mislykkedes2,12.

I denne protokol kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatasebehandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk at skelne mellem de primære og de behandlede udskrifter, som er stabilt akkumuleret i majs (Zea mays) mitokondrion (figur 1). cRT-PCR tillader samtidig kortlægning af 5 ' og 3 ' ekstremiteter af et RNA-molekyle, og det er normalt tilpasset til at kortlægge transkriptionen Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ' polyfosfatase kan fjerne to phosphater fra triphosphated 5 ' Termini, hvilket gør de primære udskrifter tilgængelige for selv ligering af RNA-Ligase. Tidligere undersøgelser viste, at modne 26s rRNA i majs havde forarbejdet 5 ' Terminus, og det var ufølsom over for RNA 5 ' polyfosfatase1,16. For at minimere indflydelsen af ustabil trifosfat i primær 5 ' Termini, normaliseres de 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs af modne 26s rRNA, og de primære og forarbejdede udskrifter differentieres derefter ved at sammenligne cRT-PCR-produkter fremstillet af de to RNA-prøver. Resultaterne af cRT-PCR-kortlægning og-diskrimination verificeres af henholdsvis Northern blot og RT-qPCR. Endelig anvendes alternative primere til at forstærke de udskrifter, der opdages i det nordlige blot, men ikke af cRT-PCR. Ved at bruge denne cRT-PCR-baserede strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet differentieret og kortlagt1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. primer design

  1. Design gen-specifikke primere for reverse transskription (RT) ved hjælp af PCR primer design software (tabel over materialer) baseret på de generelle regler for primer design17.
    Bemærk: RT primere er meget specifikke for målet udskrifter, og de er generelt forankret på 5 ' del af kodning sekvenser (modne mRNAs og forløber RNAs), eller ~ 500-600 NT nedstrøms for den forventede 5 ' ende (18s og 26s rrnas).
  2. Design par af divergerende primere at forstærke cirkulariserede udskrifter af cRT-PCR.
    Bemærk: de parrede divergerende primere flanke 5 '-3 ' krydset af cirkulariserede udskrifter, og deres positioner varierer blandt de måludskrifterne analyseret (figur S1). Nogle udskrifter har lange UTRs; for eksempel er nad2-1 5 ' UTR og rps4-1 3 ' UTR 1.985 og 1826/1834 NT, henholdsvis1. Hvis begge primere er forankret på kodnings området, vil det være svært at forstærke måludskrifterne. Derimod er nogle UTRs korte; for eksempel er de 3 ' UTRs af nad2-1 og nad4-1 34/35 og 29 – 31 NT, henholdsvis1. Hvis de parrede primere er placeret langt væk fra kodnings sekvenserne, vil PCR mislykkes. Generelt er to par divergerende primere designet til hvert mål udskrifter, mens flere par kan være nødvendigt at kort føre dem, hvis transkriptionsmønstre er komplicerede og/eller utrs er meget lange.
  3. Design par konvergerende primere til at forberede RNA-sonder til Northern blot.
    Bemærk: De parrede primere er placeret på kodnings området for målgenet, og PCR-produktets størrelse skal være i intervallet 100 til 1.000 BP. Hver Forward primer skal indeholde et Begrænsnings enzym websted for at minimere vektor sekvenser i de resulterende sonder.

2. fremstilling af rå Mitochondrion fra majs, som udvikler kerner

  1. Steriliser pestler, morterer, glas tragte, rør, og tips ved autoklave, og tør dem i ovnen.
  2. Udfør alle procedurer ved 4 °C eller på is, og pre-cool alle løsninger.
  3. Forbered 100 ml ekstraktions buffer (EB), sammensat af 0,3 M saccharose, 5 mm Tetranatrium pyrophosphat, 10 mm KH2po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] kvægserum albumin, 5 mm L-Cystein, og 20 mm ascorbinsyre. Juster til pH 7,3 med KOH og Steriliser ved filtrering.
  4. Der fremstilles 100 mL vaskebuffer (WB) bestående af 0,3 M saccharose, 1 mM EGTA og 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propansulfonsyre). Justér til pH 7,2 med NaOH og Steriliser ved filtrering.
    Bemærk: Det foreslås at forberede EB og WB ved hjælp af DEPC-behandlet deioniseret H2O.
  5. Saml 20 g udvikle kerner på 11 – 20 dage efter bestøvning (DAP) til et 50-mL rør placeret på is, og derefter overføre kerner til forkølet morterer.
    Bemærk: Brug et forhold på 100 mL EB til 20 g majskerner.
  6. Tilsæt 10 – 20 mL iskold EB til hver mørtel, og Grind kernerne helt.
  7. Tilføj flere EB, og filtrere jorden væv gennem to lag af filter klud (tabel over materialer).
  8. Filtratet centrifugeres ved 8.000 x g i 10 minutter, og pellet kasseres.
  9. Supernatanten overføres til et nyt rør, og den centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter.
  10. Hæld supernatanten af, og opstop pellet i 6 mL WB.
  11. Aliquot suspensionen til fem 1,5 mL RNase-fri rør, og centrifugeres ved 14.000 x g i 5 min.
  12. Supernatanten kasseres, fryse mitokondrie pellet i flydende nitrogen, og opbevares ved-80 °C.

3. ekstraktion af mitokondrie RNA

  1. Udpak mitokondrie RNA med et kommercielt reagens (tabel over materialer) i henhold til fabrikens anvisninger.
    Forsigtig: Dette reagens indeholder phenol og guanidin isothiocyanat. Arbejd med det i en røg hætte, og bære Lab frakke og handsker.
  2. Det isolerede mitokondrie RNA opløses i DEPC-behandlet deioniseret H2O og estimerer RNA-koncentration og renhed med et spektrofotometer (tabel over materialer).
    Bemærk: Generelt, ~ 250 μg mitokondrie RNA er opnået fra 20 g 15-DAP majskerner.
  3. Forbered en agrose gel bestående af 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre, 1mM EDTA), 1,5% agopstået (tabel over materialer), og 1x nuklear farvning farvestof (tabel over materialer).
  4. Tilsæt en passende volumen på 10x loading buffer (0,5% bromphenolblåt blå, 0,5% xylen cyanol FF, og 50% glycerol), og indlæse mitokondrie RNA/lastning buffer blanding på 1,5% agopstået gel.
  5. Kør gelen i 1x TAE buffer ved 5 – 6 V/cm i 20 – 25 min, og Evaluer mitokondrie RNA integritet ved at afbilde gelen med et gel dokumentationssystem (tabel over materialer).
    Bemærk: Tilstedeværelsen af to særskilte bands (~ 3.510 og ~ 1.970 NT for majs mitokondrie 26s og 18s rrnas, henholdsvis) er en acceptabel standard for intakt mitokondrie RNA. For at udelukke eventuel nedbrydning bør RNA-integriteten undersøges under de mange trin af cirkulariseret RNA-præparat (figur 2).

4. RNA 5 ' Polyfosfatasebehandling

  1. Indstil RNA 5 ' polyfosfatase (tabel og materiale) behandling (tabel 1), og Inkuber ved 37 °c i 30 – 60 min.
  2. Genopret det 5 ' polyfosfatasebehandlede RNA med et RNA-rensnings sæt (tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
  3. Gentag trin 3,3 til 3,5.

5. RNA-Cirkularisering

  1. Forbered to kredsløbs reaktioner ved hjælp af de samme mængder af 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede mitokondrielle RNAs (tabel 2), og inkuberer begge reaktioner ved 16 °c i 12 – 16 timer.
  2. Gendan de to sæt selv ligerede RNAs med det samme sæt som i trin 4,2.
    Bemærk: Det skal bemærkes, at kun en brøkdel af mitokondrie RNA vil være selv-ligated, og den gendannede RNA vil være en blanding af lineære og cirkulariserede udskrifter.
  3. Gentag trin 3,3 til 3,5.

6. omvendt transskription

  1. Syntetisere to sæt cDNAs fra de samme mængder cirkulariseret 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs (200 ng).
  2. Forbered en primer blanding ved at tilføje et ligeligt forhold på 26S-CRT og op til 7 andre RT primere.
    Bemærk: Den endelige koncentration af primer-blandingen skal være 1 μM.
  3. Forbered to præ-blandinger ved at kombinere de reagenser, der er anført i tabel 3, inkuberes ved 65 °c i 5 min, og derefter chill på is i 2 min.
  4. Saml to RT-reaktionssystemer (tabel 4), og inkubatér dem ved 42 °c i 50 min.
  5. Opvarm begge RT-reaktioner ved 70 °C i 5 minutter, og chill dem derefter på is.

7. normalisering

  1. Forbered to PCR-reaktioner ved at tilføje det samme volumen af Template cdnas afledt af 5 ' polyfosfatase-behandlede eller ikke-behandlede RNAs, divergerende primere flanker 5 '-3 ' krydset af cirkulariseret 26s rRNA (dvs. 26s-CF1 og-CR1), etc. (tabel 5).
  2. Kør de to reaktioner i en termisk variator (tabel over materialer) under de betingelser, der er beskrevet i tabel 6.
  3. Forbered en agrose gel bestående af 1x TAE buffer, 1,0% agopstået, og 1x nuklear farvning farvestof.
  4. Tilsæt 2 μl 10x indlæsnings buffer (0,5% bromphenolblåt blå, 0,5% xylen cyanol FF og 50% glycerol) til hvert af de to PCR-produkter, og læg dem på gelen.
  5. Kør gelen i 1x TAE buffer ved 5 – 6 V/cm for 30 – 40 min, og billede den ved hjælp af det samme gel dokumentationssystem som trin 3,5.
  6. Sammenlign de to PCR-produkters overflod ved hjælp af computer software (tabel over materialer, figur 4a), og Optimer normaliseringen ved om nødvendigt at ændre beløbene for skabelon-cdnas.

8. PCR-forstærkning

  1. Forbered par af PCR-reaktioner ved at tilføje passende volumen af de normaliserede cdnas og et par divergerende primere ledsage 5 '-3 ' krydset af Target udskrifter (tabel 7).
    Bemærk: Mængden af skabelon-cDNAs, der bruges til PCR-forstærkning af måltransskriptioner, bestemmes af 26S rRNA-normaliserings resultaterne.
  2. Udføre PCR-reaktionerne i henhold til det program, der er beskrevet i tabel 8.
  3. Gentag trin 7,3 til 7,5.
  4. Skift til indlejrede divergerende Primers, og Bekræft de første runde PCR-resultater ved at gentage trin 8,1 og 8,2.
  5. Gentag trin 7,3 til 7,5.
  6. Gendan de fremtrædende bands, der kan gentages i to runder af PCR amplifikation ved hjælp af en gel DNA Recovery Kit (tabel over materialer).

9. bestemmelse af transkriptionen Termini

  1. Klon de gel-rensede PCR-produkter i en stump-ende vektor (tabel over materialer) ved hjælp af standardteknikker.
  2. Udfør koloni PCR for at vælge positive kloner, der indeholder målskær, og sekvens dem kommercielt.
    Bemærk: Positive kloner, der indeholder skær med variabel størrelse, registreres normalt fra et enkelt genvundet bånd, fordi mange Steady-State-udskrifter i plante-mitokondrier har heterogene 5 ' og/eller 3 ' ender1,12.
  3. Juster sekvensering data med majs mitokondrie genom ved hjælp af grundlæggende lokale justering søgeværktøj (BLAST) af National Center for Biotechnology information (NCBI). Vælg organismen "majs (taxid: 4577)", og Søg database "nucleotide Collection (nr/NT)".
  4. Find 5 '-3 ' krydset af cirkulariseret afskrift, og bestem positionerne for 5 ' og 3 ' transkriptionen Termini.
  5. Beregn størrelsen på måludskrifter.

10. verifikation af cRT-PCR mapping resultater af RNA gel blot hybridisering

Bemærk: RNA gel blot hybridisering udføres ved hjælp af en kommerciel Kit (tabel over materialer), som indeholder reagenser til transskription-mærkning af RNA med digoxigenin (dig) og T7 RNA polymerase, hybridisering, og immunologisk påvisning. Der henvises til protokollerne i dette sæt for yderligere oplysninger. Sørg for, at kun RNase-frit udstyr anvendes til hele proceduren.

  1. Amplificere det DNA-fragment, der bruges til at tilberede RNA-sonde, og klone det til samme vektor som i trin 9,1, som indeholder T7 Promoter 17 BP opstrøms for indsætnings stedet.
  2. Line Isere konstruktionen ved hjælp af korrekt restriktion enzym, genvinde lineariseret plasmid ved en DNA rensning Kit (tabel over materialer), og opløse det i depc-behandlet deioniseret H2O.
  3. Mærk RNA-sonder med DIG-11-UTP af et kommercielt Kit (tabel over materialer) i henhold til producentens anvisninger.
  4. Forbered 500 mL 10x MOPS buffer (0,2 M MOPS, 50 mM natriumacetat og 10 mM EDTA) ved hjælp af DEPC-behandlet deioniseret H2O. Justér til pH 7,0 ved NaOH, og Steriliser ved filtrering.
  5. Tilsæt 2 – 3 volumener af loading buffer (50% formamid, 6,2% formaldehyd, 1x Mops, 10% glycerol, og 0,1% bromphenolblåt blå) til mitokondrie RNA udarbejdet i trin 3.1-3.3.
  6. Denature RNA prøve/lastning buffer blandingen ved 65 °C i 10 min, og derefter chill på is i 1 min.
  7. Forbered en denatureret agrose gel (2% formaldehyd, 1,2% agopstået og 1x MOPS), og Indlæs RNA-prøve/indlæsnings buffer blandingen til gelen (1 – 2 μg mitokondriel RNA pr. brønd).
  8. Kør gelen i 1x MOPS ved 3 – 4 V/cm for ~ 4 h.
  9. Forbered 2 L af 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat, pH 7,0). Behandl det med 0,1% DEPC natten over, og Steriliser ved autoklave.
  10. Skyl gelen to gange i 20x SSC (15 min hver gang), og Overfør gel RNA til en nylon membran (tabel over materialer) ved kapillær overførsel med 20X SSC for 10 – 16 timer.
  11. Fastgør RNA til membran ved at bage ved 120 °C i 30 minutter.
  12. Udfør RNA-hybridisering og immunologisk detektion med et kommercielt Kit (tabel over materialer) i henhold til producentens instruktion.

11. diskrimination af primære og forarbejdede 5 ' mål

  1. At diskriminere de primære og forarbejdede 5 ' ' ender ved at sammenligne cRT-PCR-produkterne opnået fra de normaliserede 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs.
    Bemærk: Til primære udskrifter er den overflod af PCR-produkter fra 5 ' polyfosfatasebehandlet RNA meget højere end fra ikke-behandlet modstykke (figur 1, ' gen A ' og figur 4a). Til forarbejdede udskrifter ville et sammenligneligt niveau af PCR-produkter imidlertid blive forstærket fra de to sæt mitokondrie RNAs (figur 1, ' gen B ').
  2. Design rt-qPCR primere baseret på cRT-PCR-kortlægnings resultaterne.
  3. Kontroller resultaterne af cRT-PCR-diskrimination med RT-qPCR.
    Bemærk: De to cDNA-prøver, der er afledt af 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs, er normaliseret af RT-qPCR-produkterne 26S Mature rRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering af mitokondrie RNA-cirkulariserings effektivitet

I en tidligere undersøgelse, både total og mitokondrie RNAs blev brugt til cRT-PCR kortlægning af mitokondrie transkriptionen Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), og de to typer af RNAs gav lignende kortlægning resultater12. I første omgang brugte vi også total RNAs til cRT-PCR-kortlægning af mitokondrie transkriptionen Termini i majs. Efter mange forsøg fandt vi måltransskriptioner var svære at opdage. Som en forbedring, vi beriget mitokondrie RNA fra majs udvikle kerner, og det gjorde forstærkning af de cirkulariserede mål udskrifter i en runde af PCR muligt.

For at forklare den nemme forstærkning af Target udskrifter efter tilsætning, vi anslået RNA cirkularisering effektivitet ved at udføre RT-PCRs på repræsentative mitokondrie gen nad5 (figur 3 og figur S2). Majs nad5 genet indeholder to Trans-og to CIS-splicing introns. Efter selv-ligering af total og mitokondrie RNAs blev første strand cDNAs selvstændigt syntetiseret ved hjælp af nad5-RT1 og-RT2 primere. De to primere kunne omvendt transskribere både lineære og cirkulariserede nad5 mRNAs (figur S2). Fire par konvergerende primere bruges til PCR-forstærkning: sqF1 & sqR1 og sqF2 & sqR2 til semi-kvantitativ RT-PCR (rt-sqpcr) og qF1 & qR1 og qF2 & qR2 til rt-qPCR. For cdnas transskriberet af nad5-RT1, alle fire par primere detekteret både cirkulariseret og lineær nad5 modne mRNAs; for nad5-RT2 reverse transskription reaktion, SqF2 & SqR2 og QF2 & qR2 undersøgte begge former for mRNA, mens SqF1 & SqR1 og QF1 & qR1 PCR-produkter stammer fra cirkulariseret nad5 kun. På baggrund af denne analyse brugte vi sqF2 & sqR2 (til RT-sqPCR) og qF2 & qR2 (til RT-qPCR) PCR-produkter til at normalisere nad5-RT1 og-RT2 omvendte transskriptions reaktioner og vurderede forholdet mellem cirkulariseret nad5 ved at sammenligne sqF1 & sqR1 (til RT-sqPCR) eller qF1 & qR1 (til RT-qPCR) PCR-produkter. Før selv ligationen blev RNAs forbehandlet af RNA 5 ' polyfosfatase for at gøre alle udskrifter tilgængelige for cirkularisering af RNA-Ligase. RT-sqPCR-Analysen viste en meget lille brøkdel af nad5 mRNA var cirkulariseret, når total RNA blev brugt, men forholdet blev dramatisk forøget, når det berigede mitokondrie RNA blev brugt (figur 3b). RT-qPCR resultater viste, at forholdet mellem selv-ligeret nad5 mRNA steg fra 3,7% til 32% efter tilsætning (figur 3c). Analyse af nad1 gav lignende resultater, og cirkulariserings effektiviteten af nad1 mRNA steg fra 0,7% til 30% (figur 3D-F).

Per disse analyser, omkring 30% majs mitokondrie RNAs var selv-ligated efter forbedringen, og den øgede cirkulariserings effektivitet forklarer den nemme påvisning af målet udskrifter af cRT-PCR.

Bestemmelse af majs COX2 mRNA Termini ved hjælp af cRT-PCR-baseret strategi

Vi brugte COX2 -genet som et eksempel til at introducere kortlægning og diskrimination af majs mitokondrielle udskrifter ved hjælp af den CRT-PCR-baserede strategi (figur 4).

I begyndelsen af kortlægningen COX2 mRNA blev tre udadvendte primere CF1, CF2 og CR1 designet på genkodnings området (figur 4d). CF1 og CF2 var indlejrede Primers, og CF2 var 69 BP nedstrøms for CF1. Ved at bruge skabelonen cdnas syntetiseres i trin 6.1 – 6.5 og normaliseret i trin 7.1 – 7,6, forstærkede CF1 & CR1 primer-parret to fremtrædende bånd, og forstærknings resultaterne blev gentaget af indlejrede primere CF2 & CR1 (figur 4a). Desuden blev de to bands kraftigt forstærket fra det 5 ' polyphsophatase-behandlede RNA, mens de var svære at detektere i det ikke-behandlede modstykke, hvilket tyder på, at de er følsomme over for RNA 5 ' polyphsophatase og har primær 5 ' Termini.

De to kandidat bands fik navnet COX2-1 og-2, og de blev genvundet uafhængigt af agrose gel og klonet ind i vektorer. Koloni PCR resultater viste, at de positive kloner indeholder skær med variabel størrelse, hvilket indebærer heterogene 5 ' og/eller 3 ' Termini af transskriptioner (figur 5). De positive kloner blev sekvenserede kommercielt, og sekvensering data blev justeret med majs mitokondrie genom som beskrevet i trin 9,3.

Resultaterne af sekvensering og justering viste, at de to udskrifter var identiske med 3 ' ender, men forskellige i længden af 5 ' UTRs (figur 4d). 5 ' enderne af COX2-1 og-2 blev beriget i 992-1030 og 1276-1283 NT opstrøms for henholdsvis Aug, mens deres 3 ' ende var 39 NT nedstrøms for stop codon. Udledt af cRT-PCR-resultaterne var de beregnede størrelser på COX2-1 og-2 henholdsvis 1804 – 1832 og 2088 – 2095 NT.

For at verificere resultaterne af cRT-PCR-kortlægningen blev RNA-gel blot hybridisering udført ved hjælp af sonden afledt af COX2 -genkodnings området, og to store bånd med samme størrelse som COX2-1 og-2 blev påvist (figur 4c). Derudover blev to større bands omkring 2.500 og 2.800 NT detekteret i det nordlige blot, men de blev ikke forstærket af cRT-PCR. De to større bands blev henholdsvis COX2-3 og-4. For at kort sætte dem, blev en anden to udadvendt primere (dvs. CR2 og CF3), forankret på 5 ' og 3 ' UTRs af COX2-2, designet, og deres positioner var tæt på de forventede transskription ender af COX2-3 og-4. Ved hjælp af primer pair CF3 & CR2 blev to store bands kraftigt forstærket fra cDNAs afledt af 5 ' polyphsophatase-behandlet RNA, men ikke fra det ikke-behandlede modstykke (figur 4a). Resultaterne af sekvensering viste, at de havde identiske 5 ' Termini, mens variabel 3 ' slutter. Den beregnede størrelse af de to udskrifter var henholdsvis 2512/2513 og 2833 – 2835 NT, og de var tæt i størrelse med de to større bands detekteret i den nordlige blot. Desuden viste cRT-PCR-resultaterne, at cox2-3 og-4 har primære 5 ' Termini.

For at bekræfte resultaterne af forskelsbehandlingen blev fem udadvendte primere designet i henhold til resultaterne af cRT-PCR-Mapping, dvs. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 og qCR3, og primer Pairs qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 og qCF2 & qCR3 blev brugt til RT-qPCR-analyse af henholdsvis COX2-1,-2,-3 og-4. Den relative overflod af alle fire RT-qPCR-produkter i 5 ' polyphsophatase-behandlet prøve var meget højere end dem i det ikke-behandlede modstykke, hvilket bekræfter cRT-PCR-diskriminations resultaterne.

Sammenfattende er transkriptionen af majs COX2 gen kompliceret, og den CRT-PCR-baserede strategi diskriminerer effektivt og kortlægger de mange isoformer af COX2 mRNA.

Figure 1
Figur 1: oversigt over den cRT-PCR-baserede strategi. Illustration af de vigtigste trin i den cRT-PCR-baserede strategi. 5 ' + og 5 '-= de to RNA-prøver, som behandles og ikke behandles af henholdsvis RNA 5 ' polyfosfatase. De to cDNA-prøver, der er afledt af 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs, er normaliseret med 26S modent rRNA i majs, og de primære og forarbejdede udskrifter diskrimineres ved at sammenligne cRT-PCR-produkterne. For gen A har det tilsvarende RNA en primær 5 ' ende, fordi PCR-produktets overflod fra 5 ' polyfosfatasebehandlet RNA er meget højere end fra det ikke-behandlede modstykke. for gen B forstærkes PCR-produkterne fra de to sæt mitokondrie RNAs på et sammenligneligt niveau, hvilket indebærer en forarbejdet 5 ' endestation af det tilsvarende RNA. Kodnings området og UTRs repræsenteres af henholdsvis grå boks og fede streger. CRT = primer til baglæns transskription; CF1, CF2, CR1 og CR2 = PCR primere, som flanderede 5 '-3 '-krydset af cirkulariseret transskriptionen; qCF og qCR = divergerende primere for RT-qPCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vurdering af mitokondrie RNA-integritet ved agopstået gel-elektroforese. A) mitokondrie RNAs fremstillet af 15-DAP-majskerner. M = DNA molekyle markør. (B) kerne mitokondrie RNA efter behandling med 5 ' polyfosfatase og/eller cirkularisering af T4 RNA-Ligase. 5 ' + = mitokondrie RNA efter behandling med 5 ' polyfosfatase; T4 & 5 ' + = mitokondrie RNA efter behandling af 5 ' polyfosfatase og cirkularisering af T4 RNA-Ligase; T4 & 5 '-= mitokondrie RNA efter cirkularisering kun. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Cirkulariserings effektivitet af nad5 og nad1 MRNAS anslået af rt-pcrs. (A) og (D) skematisk diagram over henholdsvis nad5 og nad1 gener. Ex = eXoN. Exons og introns vises henholdsvis som grå bokse og buede linjer. Positionen af reverse transskription primere RT1 og RT2 er angivet med pile. Sorte prikker angiver placeringen af PCR-Primers, og PCR-produkternes forventede størrelse vises. sqF1, sqF2, sqR1 og sqR2 er primere for rt-sqpcr; qF1, qF2, qR1 og qR2 er primere for rt-qPCR. (B) og (E) rt-sqpcr analyse af cirkulariserings effektiviteten af henholdsvis nad5 og nad1 mRNAs. M = DNA molekyle markør. (C) og (F) rt-qPCR analyse af cirkulariserings effektiviteten af henholdsvis nad5 og nad1 mRNAs. De to cDNA-prøver, der revers transskriberes af RT1 og RT2 primere, normaliseres af sqF2 & sqR2 (for rt-sqpcr) eller qF2 & qR2 (for rt-qPCR) PCR-produkter. Cirkulariserings effektiviteten af nad5 og nad1 mRNAs anslås ved at sammenligne PCR-produkterne i sqF1 & sqR1 (for rt-sqpcr) eller qF1 & qR1 (for rt-qPCR). cirkulariseret/(cirkulariseret + lineær) = qF1 & qR1 over qF2 & qR2 i RT2 reaktion/qF1 & qR1 over qF2 & qR2 i RT1 reaktion. Værdier er midler og SDs af tre biologiske replikater. For at udelukke den potentielle påvirkning med 5 ′ trifosfat blev RNAs behandlet med 5 ′ polyfosfatase før selv ligationen. Total og Mito = total og mitokondrie RNAs hhv. RT1 og RT2 = cDNAs reverse transskriberet af RT1 og RT2 Primers, henholdsvis Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kortlægning af COX2 moden mRNA Termini ved hjælp af CRT-PCR-cased-strategien. A) gel-adskillelse af COX2 cRT-PCR-produkter. + og-= cDNAs afledt af henholdsvis 5 ′ polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede mitokondrielle RNAs. De to cDNA-prøver blev normaliseret ved forstærkning af 26S cDNA (26s). Fem primere bruges til cRT-PCR analyse af cirkulariseret COX2 mRNA: CF1, CF2, og CF3 er indlejrede primere, og CF2 og CF3 er 69 og 138 BP nedstrøms for CF1, hhv. CR1 og CR2 er indlejrede Primers, og CR2 er 1.288 BP opstrøms for CR1. De bånd, der er angivet med» 1 «og» 2 «, blev forstærket af både CF1 & CR1 og CF2 & CR1, mens» 3 «-og» 4 «-båndene blev forstærket af CF3 & CR2. Alle fire bands blev sekvenserede af kloning. De bånd, der er markeret med asterisker, kunne ikke gentages, og de blev udelukket fra resultaterne. M = DNA molekyle markør. B) rt-qPCR-analyse af den relative overflod af cirkulariseret COX2 mRNA efter 5 ' polyfosfatasebehandling. De to cDNA prøver blev syntetiseret af en primer blanding indeholdende 26S-CRT, COX2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, COB-CRT, og COX1-CRT på lige fod, og cDNA afledt af 26S moden rRNA blev brugt til normalisering. +/-= COX2 over 26s i behandlet prøve/Cox2 over 26s i ikke-behandlet prøve. Værdier repræsenterer midler og SD af tre biologiske replikater. De primere, der anvendes til RT-qPCR, er indikeret. C) nordlige blot analyse af COX2 udskrifter. 2 μg mitokondriel RNA blev indlæst. De bånd, der svarer til forskellige isoformer af COX2 moden mRNA, er markeret. (D) transkriptionen Termini af COX2 mRNA udledt af cRT-PCR-resultater. UTRs og åbne læse rammer vises som henholdsvis fede streger og grå bokse. Positionerne på 5 ' og 3 ' Termini i forhold til AUG (+ 1) og UAA (-1), og antallet af enkelt kloner sekvenserede på disse positioner er vist. Positionerne for reverse transkriptionen og PCR amplifikationprimere vises henholdsvis som lukkede og åbne pilehoveder. Udadvendte primere, der anvendes til RT-qPCR, vises som åbne kvadrater, og positionen af COX2 Probe er som angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: udvælgelse af positive kloner indeholdende COX2-4 skær af koloni PCR. A) koloni PCR til at screene enkelt kloner, der indeholder COX2-4 skær. Størrelsen af COX2-4 INSERT er omkring 1.165 BP, og at af vektor sekvenser er 100 BP. Den beregnede størrelse af koloni PCR-produkter er ca. 1.265 BP, og de kloner, der indeholder små skær, var ikke sekvenserede, d.v.s. numrene 11, 14, 22 og 23. B) sekvensering af resultaterne af de positive kloner, der er screenet i litra a). 5 '/3 ' ender = henholdsvis 5 ' og 3 ' ender i forhold til AUG (+ 1) og UAA (-1). Rækkefølgen af resultaterne af tal 12 og 20 blev udelukket, fordi de var meget mindre end de andre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Komponent Volumen for 50 μL reaktion (μL) Endelig koncentration
10x RNA 5 ' polyfosfatasebuffer 5 1x
Rnasehæmmer (40 U/μL) 0,75 0,6 U/μL
Mitokondriel RNA X 0,2 μg/μL
RNA 5 ' polyfosfatase (20 e/μL) 2,5 1 e/μL
DEPC-behandlet deioniseret H2O til 50 μL -

Tabel 1: reaktions komponenter i RNA 5 ' polyfosfatasebehandling.

Komponent Volumen for 20 μL reaktion (μL) Endelig koncentration
10x T4 RNA-ubiquitinligase I-buffer 2 1x
dATP (1 mM) 1 50 μM
PEG8000 (50%) 6 15
RNA-hæmmer (40 U/μL) 0,5 1 e/μL
5 ' polyfosfatase-behandlet eller ikke-behandlet mitokondriel RNA X 0,1 ~ 0,2 μg/μL
T4-RNA-ubiquitinligase I (30 e/μL) 0,4 0,6 U/μL
DEPC-behandlet deioniseret H2O til 20 μL -

Tabel 2: reaktions komponenter af mitokondriel RNA-cirkularisering.

Komponent Volumen for 10 μL præ-blanding (μL)
Primer-blanding (1 μM i alt) 2
dNTP-blanding (10 mM hver) 1
Cirkulariseret 5 ' polyfosfatase-behandlet eller ikke-behandlet mitokondriel RNAb X
DEPC-behandlet deioniseret H2O til 10 μL

Tabel 3: forblanding til reverse transkriptionsreaktion. en stor Primer-blandingen indeholder et ligeligt forhold på 26S-CRT og op til 7 andre RT-primere, og den endelige koncentration er 1 μM. bto præ-blandinger tilberedes side om side, og de indeholder samme mængde (200 ng) af cirkulariseret 5 ' polyfosfatase-behandlet eller ikke-behandlet mitokondriel RNA.

Komponent Volumen for 20 μL reaktionssystem (μL) Endelig koncentration
Skabelon RNA/primer/dNTP * 10 -
5x RTase buffer 4 1x
Rnasehæmmer (40 U/μL) 0,5 1 e/μL
RTase (200 U/μL) 1 10 e/μL
DEPC-behandlet deioniseret H2O til 20 μL -

Tabel 4: reaktions komponenter i omvendt transkriptionen. * Skabelonen RNA/primer/dNTP præ-blandinger tilberedt i trin 6,3.

Komponent Volumen for 20 μL reaktionssystem (μL) Endelig koncentration
Deioniseret H2O 7 -
2x reaktionsbuffer 10 1x
dNTP-blanding (10 mM hver) 0,4 0,2 mM hver
26S-CF1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
26S-CR1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
Skabeloner cDNA afledt af cirkulariseret 5 ' polyfosfatase-behandlede eller ikke-behandlede RNAs * 0,6 -
DNA-Polymerase (1 e/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabel 5: reaktions komponenter til PCR amplifikation af 26S cDNA. * I første omgang, samme volumen af skabelon cDNAs (0,6 μL) anvendes til normalisering. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre mængden af skabelon-cDNAs for at sikre den samme overflod af 26S PCR-produkter mellem de to PCR-reaktioner.

Trin Temperatur Tid Cyklus nummer
Indledende denaturering 95 °C 3 min 1 cyklus
Denaturering 95 °C 15 sek 22 – 25 cyklusser
Primer udglødning 56 °C 15 sek
Udvidelse 72 °C 30 sek
Endelig udvidelse 72 °C 5 min 1 cyklus
Holde 4 °C ∞ -

Tabel 6: PCR-betingelser for at forstærke 26s cDNA til normalisering.

Komponent Volumen for 20-μL reaktionssystem (μL) Endelig koncentration
Deioniseret H2O til 20 μL -
2x reaktionsbuffer 10 1x
dNTP-blanding (10 mM hver) 0,4 0,2 mM hver
Divergerende primer-fremad (10 μM) 0,8 0,4 mM
Afvigende primer-bagside (10 μM) 0,8 0,4 mM
Skabelon cDNA afledt af cirkulariseret 5 ' polyfosfatase-behandlede eller ikke-behandlede RNAs * X -
DNA-Polymerase (1 e/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabel 7: reaktions komponenter til PCR amplifikation af de cirkulariserede måludskrifter. * Mængden af skabelon cDNAs, der anvendes i disse reaktioner, bestemmes af 26s rRNA-normaliserings resultater.

Trin Temperatur Tid Cyklus nummer
Indledende denaturering 95 °C 3 min 1 cyklus
Denaturering 95 °C 15 sek 22-40 cyklusser c
Primer udglødning a 50-65 °C 15 sek
Extenstion b 72 °C 0,5-1 minutters
Finatl filendelse 72 °C 5 min 1 cyklus
Holde 4 °C ∞ -

Tabel 8: PCR-betingelser for at forstærke måludskrifterne. en stor Eksakte udglødning afhænger af den smeltetemperatur, som PCR-primerne har. b Forlængelse tid afhænger af længden af målet, der skal forstærkes. Den anbefalede tid er 1 min. pr. 1 kb af PCR-fragmentet. c Generelt, 30 ~ 35 cyklusser er nok til at producere en tilstrækkelig mængde PCR produkt. For lav rigelige udskrifter, øge antallet af cyklusser op til 40 cyklusser.

Figur S1: primere position for repræsentative transskriptioner af majs mitokondrie. CRT = reverse transkription primer; CF1, CF2, CR1 og CR2 = divergerende primere for PCR amplifikation; qCF og qCR = divergerende primere for RT-qPCR. Transkriptionen Termini af majs nad2-1, rps4-1, og nad4-1 er blevet fastlagt tidligere (Zhang et al., 20191). Positioner af 5 '-og 3 '-ender i forhold til AUG (+ 1) og den sidste nucleotid af stop codon (-1) er vist. Kodnings områderne og UTRs er angivet som henholdsvis grå bokse og fede streger. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figur S2: princip for at estimere cirkulariserings effektiviteten af nad5 mRNA i majs. I en selv-ligation reaktion, kun en brøkdel af mitokondrie RNAs er cirkulariseret. For at beregne forholdet mellem cirkulariseret nad5 mRNA, to gen-specifikke primere bruges til at syntetisere den første strand cdnas, dvs nad5-RT1 og-RT2. I nad5-RT2 reverse TRANSSKRIPTION (RT)-reaktionen er PCR-produkterne forstærket af SqF2 & sqR2 (til rt-sqpcr) og QF2 & qR2 (til rt-qPCR) er afledt af både lineære og cirkulariserede Nad5, mens sqF1 & sqR1 (for rt-Sqpcr) og qF1 & qR1 (til RT-qPCR) er PCR-produkter kun afledt af cirkulariseret nad5 ; i nad5-RT1 reaktion, alle fire par PCR primere kunne forstærke begge former for nad5. For at beregne forholdet mellem cirkulariseret nad5 mRNA er de to reaktioner normaliseret ved SqF2 & SqR2 eller QF2 & qR2 PCR-produkter. Ved at sammenligne den overflod af sqF1 & sqR1 eller qF1 & qR1 PCR-produkter mellem de to RT-reaktioner, er cirkulariserings effektiviteten af nad5 mRNA groft anslået. ex = eXoN. Exons og introns vises henholdsvis som grå bokse og buede linjer. Positionerne for nad5-RT1 og-RT2 primere er angivet med pile. Sorte prikker indikerer placeringen af PCR-Primers, og den forventede størrelse af PCR-produkterne vises. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tabel S1: primer-oplysninger. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I en tidligere undersøgelse, samlede og mitokondrie RNAs fra cellesuspension kultur Arabidopsis blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini af CRT-PCR, og lignende resultater blev opnået12. Men, kun beriget mitokondrie RNA blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini i mange andre undersøgelser1,2,3,9. Vi fandt, at tilsætning af mitokondrie RNA er et vigtigt skridt for cRT-PCR kortlægning af mitokondrie transkriptionen Termini i majs. Efter denne berigelse, forholdet mellem cirkulariseret mitokondrie RNA er dramatisk steget fra 0,3% – 3,7% til ~ 30% (figur 3 og figur S2), hvilket gør amplifikation af cirkulariseret Target udskrifter muligt i en runde af PCR.

Den cirkulariserings effektivitet af mitokondrie RNA blev anslået ved RT-PCR analyse på majs nad1 og nad5, som begge er opdelt i uafhængige prækursorer ved CIS-splicing introns. Fordi den potentielle indflydelse fra tilstedeværelsen af forløber RNAs samt variation af RT effektivitet ikke kunne udelukkes, dette er kun en grov vurdering af den virkelige mitokondrie RNA cirkularisering effektivitet.

Vi ændrede selvlignings forholdene ved at ændre koncentrationen af mitokondrie RNA og PEG8000, samt ved at forlænge inkubationstiden, men disse ændringer synes ikke at påvirke mitokondrie RNA-cirkulariserings effektivitet. Selv om vi ikke er sikre på, om yderligere Percoll gradient rensning kunne øge cirkularisering effektivitet, kvaliteten af rå mitokondrion forberedt i afsnit 2 er god nok til cRT-PCR kortlægning af mitokondrie transkriptionen Termini i majs. Da flere runder af PCRs kan give falske positive resultater, gør forstærknings resultatet af måludskrifter i én runde PCR det mere pålideligt at tilknytte resultaterne.

5 ' trifosfat af primære udskrifter er ustabil, og det kan konverteres til 5 ' monophosphat af ukendte årsager. Dette problem hindrer en klar differentiering mellem de primære og forarbejdede udskrifter ved hjælp af tilgange afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ' trifosfat1,2,4. Den modne form af majs 26S rRNA har en monophosphated 5 ' ende, og det er ufølsom over for RNA 5 ' polyfosfatase. For at minimere indflydelsen af den ustabile 5 ' triphospahte, moden 26S rRNA bruges til at normalisere de to RNA prøver, behandlet og ubehandlet af 5 ' polyfosfatase, og det er vist sig at være et vigtigt skridt til at differentiere de to typer af udskrifter i majs betyder. Efter normalisering kunne de primære og forarbejdede udskrifter blive diskrimineret ved at sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-resultater opnået fra 5 ' polyfosfatasebehandlede og ikke-behandlede RNA-prøver. De primære udskrifter er følsomme over for 5 ' polyfosfatase, og de forstærkes kraftigt af den 5 ' polyfosfatase-behandlede prøve, men ikke (eller på et meget lavt niveau på grund af den ustabile 5 ' trifosfat) fra det ikke-behandlede modstykke. Derimod påvises de forarbejdede udskrifter på sammenlignelige niveauer mellem de to prøver.

I planter, transkriptionen af mange mitokondrie gener er temmelig kompliceret1,2. For eksempel udtrykkes majs nad6 og atp6 gener som både monocistrons og dicistrons, og nad6, Atp6og atp6-na6 modne mRNAs har henholdsvis to, tre og to isoformer. Desuden er transkriptionen af et mitokondriel-gen faktisk en blanding af forløber, moden og nedbrydning af RNAs. PCRs er tilbøjelige til at forstærke små molekyler, og det er svært at detektere alle transskriptions isoformer ved hjælp af et par primere. Derfor er RNA gel blot hybridisering kræves for at kontrollere cRT-PCR mapping resultater, og alternative primere kan være nødvendigt at forstærke disse udskrifter detekteret i det nordlige blot, men ikke ved første gang CRT-PCR.

Denne protokol indeholder et RT-qPCR-trin for at verificere resultaterne af cRT-PCR-diskrimination. Fordi de mange isoformer af nogle modne mRNAs er meget tæt i størrelse1, er det umuligt at bekræfte alle de forskelsbehandling resultater af rt-qPCR, og nogle Steady-State udskrifter blev bestemt ved at sammenligne CRT-PCR resultater mellem de behandlede og ikke-behandlede RNAs.

I denne protokol blev 5 ' og 3 ' Termini af måludskrifterne kortlagt ved kloning og sekvensering af cRT-PCR-produkterne, og det begrænser antallet af enkelt kloner, der skal sorteres. Som en alternativ metode kunne cRT-PCR-produkterne sorteres efter næste generations sekvensering, som sekvenser tusindvis af molekyler til et sæt af Steady-State udskrifter, og kortlægnings resultaterne ville være mere nøjagtige.

Ud over forskelsbehandlingen af primær og forarbejdet 5 ' Termini med cRT-PCR og RT-qPCR kunne monophosphat 5 ' Termini bestemmes ved identifikation af de omgivende RNA-sekundære strukturer1,12. Det er velkendt, at RNA sekundære strukturer såsom tRNA og t-element kunne mægle mitokondrie transskription ende dannelse ved at dirigere endonucleolytic spaltning af RNase P og/eller RNase Z12,18,19, 20. Derfor bør disse 5 ' Termini, der støder op til tRNA eller t-element, udledes af post-transkriptional behandling og indeholder monophosphater.

Ved at bruge denne protokol, en stor del af Steady-State udskrifter er blevet bestemt i majs mitokondrier1. Men nogle få var ikke differentieret og/eller kortlagt for ukendt årsag1. Desuden mener vi, at positionen af 5 ' afskrift Termini er bedre at blive bekræftet af primer forlængelse analyse, selv om det er inkluderet i denne protokol. På grund af manglen på eksperimentelle data, er vi ikke sikker på, om denne strategi er egnet til andre plantearter, såsom ris (Oryza sativa) og Arabidopsis. Udover plante mitokondrier er både primære og forarbejdede udskrifter stabilt akkumuleret i plastids21, og det er usikkert, om denne strategi kan bruges til at kort og diskriminere plastid udskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den nationale Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 31600250, Y.Z.), videnskab og teknologiprojekter i Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.), og det kinesiske Landbrugsforsknings system (Grant No. BILER-04-PS09, H.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Tags

Genetik cirkulær RT-PCR Northern blot kvantitativ RT-PCR RNA 5 ' polyfosfatasebehandling RNA normalisering primære og forarbejdede transskriptioner majs mitokondrion
Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng,… More

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter