Summary
通过结合循环RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理和北方斑点,提出了基于RT-PCR的循环RT-PCR策略。该协议包括一个标准化步骤,以尽量减少不稳定5'三磷酸酯的影响,它适用于对玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录转录进行鉴别和映射。
Abstract
在植物线粒体中,一些稳态转录本具有从转录启动(主转录)衍生的5'三磷酸盐,而其他含有5'单磷酸盐产生的转录后(处理转录)。为了区分这两种类型的成绩单,已经制定了几种策略,其中大多数取决于存在/缺少5'三磷酸盐。然而,小学5年级的三磷酸盐是不稳定的,它阻碍了对两种类型的抄本的明显区分。为了系统地区分和绘制玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录本,我们开发了基于CRT-PCR(cRT-PCR)的循环RT-PCR(cRT-PCR)策略,将cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、定量RT-PCR (RT-qPCR) 和北方污点。作为改进,该策略包括RNA正常化步骤,以尽量减少不稳定的5'三磷酸盐的影响。
在此协议中,富集线粒体RNA由RNA 5'聚磷酸酶预处理,将5'三磷酸酯转化为单磷酸盐。经过循环和逆转录后,从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA衍生的两种cDNA由玉米26S成熟rRNA归一化,其加工为5'结束,对5'聚磷酸酶不敏感。规范化后,通过比较从处理过的和未经处理的RNA获得的cRT-PCR和RT-qPCR产物,对初级和加工的转录本进行区分。转录端验通过cRT-PCR产物的克隆和测序确定,然后由北方印块验证。
通过采用这一策略,确定了玉米线粒体中大多数稳态记录。由于一些线粒体基因的转录模式复杂,一些稳态转录图没有被区分和/或映射,尽管它们是在北方的污点中检测到的。我们不确定此策略是否适合在其他植物线粒体或石膏中区分和映射稳态记录。
Introduction
在植物线粒体中,许多成熟和前体RNA作为多种等形体积累,稳定状态转录法可以根据其5'末端1、2、3的差异被分成两组。 4.主转录有5'三磷酸盐末端,从转录启动派生。相比之下,经过处理的转录本具有5'单磷酸盐,通过转录后处理产生。两种类型的转录本的鉴别和映射对于解开转录和转录结束成熟的分子机制非常重要。
为了区分植物线粒体的主要转录和加工记录,已经开发了四个主要策略。第一种策略是用烟草酸焦磷酸酶(TAP)预处理线粒体RNA,将5'三磷酸盐转化为单磷酸盐,并使初级转录本通过RNA连带循环。然后通过快速扩增cDNA端(RACE)或圆形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4,比较TAP处理和未处理RNA样本的转录量。在第二种策略中,处理的转录本首先从线粒体RNA中耗尽,使用终结器5'-磷酸盐依赖外糖酶(TEX),然后通过引世扩展分析5,6映射所剩的主要转录本.第三种策略是使用甘蓝转移酶预盖初级转录,然后三磷酸盐5'termini的位置由引基延伸与核糖酸酶或S1核酸酶保护分析7,8确定 ,9.与基于5'三磷酸的存在/不存在的不同,第四种策略结合了体外转录、位点定向诱变和引物延伸分析,以表征启动子并确定转录启动站点8,10,11。通过使用这些策略,许多主要和经过处理的转录本在植物线粒体中已经确定。
然而,一些研究报告说,原发转录的5'三磷酸盐是不稳定的,他们很容易转换为单磷酸盐不明的原因2,4,12,13。这个问题阻碍了对两种类型的成绩单的明确区分,因为使用技术取决于存在/缺少 5' 三磷酸,以及以前在工厂中系统地区分初级记录和加工抄本的努力线粒体失败2,12。
在此协议中,我们将cRT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理、RT-qPCR和北方斑点相结合,系统地区分玉米(ZeaMays)线粒体中稳态积累的初级和加工转录(图1)。cRT-PCR允许同时映射RNA分子的5'和3'的四肢,它通常适应在植物2,12,14,15的图谱抄本术语。RNA 5' 聚磷酸酶可以从三磷酸盐5'特尼中去除两种磷酸盐,这使得主转录本可用于RNA连结酶的自我结扎。先前的研究表明,玉米中成熟的26S rRNA已经加工了5'终点,对RNA5'聚磷酸酶1,16)不敏感。为了将不稳定的三磷酸盐对原发5'特尼的影响降至最低,5'聚磷酸酶处理和未处理RNA通过成熟的26S rRNA进行归一化,然后通过比较来区分原发和加工的转录本。从两个RNA样本中获得的cRT-PCR产物。cRT-PCR映射和鉴别结果分别由北方印子和RT-qPCR验证。最后,使用替代引液来放大在北方污点中检测到的转录本,而不是通过cRT-PCR检测到的。通过这种基于cRT-PCR的策略,对玉米线粒体中大多数稳态转录被区分和映射为1。
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Protocol
1. 底漆设计
- 根据引物设计的一般规则,使用PCR引物设计软件(材料表)设计逆转录(RT)基因专用引物。
注:RT 引录对目标转录本非常具体,它们通常固定在编码序列的 5' 部分(成熟的 mRNA 和前体 RNA),或预计的 5' 端 (18S 和 26S rRNA)的下游 ±500–600 nt。 - 设计发散引基对,通过cRT-PCR放大循环转录。
注:成对发散引引在循环转录本的5'-3'结侧侧,它们的位置因分析的目标转录本而异(图S1)。有些成绩单有很长的 UtR;例如,nad2-1 5' UTR 和rps4-1 3' UTR 分别为 1,985 和 1,826/1,834 nt,分别为1。如果两个引录都固定在编码区域上,则很难放大目标脚本。相比之下,一些 RR 是短的;例如,nad2 -1 和 nad4-1 的 3' TR 分别为 34/35 和 29–31 nt,分别为1。如果配对引注位于远离编码序列的位置,PCR 将失败。通常,为每个目标转录本设计了两对发散底漆,而可能需要多对来映射成绩单模式复杂和/或 RR 很长的脚本。 - 设计收敛底漆对,为北方斑点制备RNA探针。
注:成对引基位于目标基因的编码区域,PCR 产品的大小应在 100 到 1,000 bp 之间。每个正向引力应包含一个限制性酶位点,以尽量减少结果探针中的载体序列。
2.从玉米开发内核制备粗米松
- 用高压灭菌器消毒虫子、砂浆、玻璃漏斗、管子和吸头,并在烤箱中干燥。
- 在 4°C 或冰上执行所有程序,并预冷却所有溶液。
- 准备100 mL的萃取缓冲液(EB),由0.3M蔗糖、5mM四磷酸钠、10mM KH2PO 4、2mM EDTA、1%[w/v] 聚苯丙酮40、1%[w/v]牛血清白蛋白、5 mM L-半胱氨酸和20mM抗坏血酸组成。使用 KOH 调节至 pH 7.3,并通过过滤进行消毒。
- 准备 100 mL 的洗涤缓冲液 (WB),包括 0.3 M 蔗糖、1 mM EGTA 和 10 mM MOPS(3-(N-变形)丙烷硫酸。使用 NaOH 调节至 pH 7.2,并通过过滤进行灭菌。
注:建议使用DEPC处理的去离子化H2 O制备EB和WB。 - 在授粉后11~20天收集20g开发内核(DAP)至放置在冰上的50mL管,然后将内核转移到预冷却砂浆中。
注:使用 EB 的 100 mL 与 20 g 玉米内核的比率。 - 在每个砂浆中加入10~20mL的冰冷的EB,并完全研磨内核。
- 添加更多EB,并通过两层过滤布过滤地面组织(材料表)。
- 将滤液在 8,000 x g下离心 10 分钟,然后丢弃颗粒。
- 将上清液转移到新管中,并在 20,000 x g下离心 10 分钟。
- 倒入上清液,并在 6 mL WB 中重新悬浮颗粒。
- 将悬浮液与5个1.5 mL无RNase管分离,并在14,000 x g下离心5分钟。
- 丢弃上清液,将线粒颗粒冻结在液氮中,并储存在-80°C。
3. 线粒体RNA的提取
- 根据制造商的说明,用商业试剂(材料表)提取线粒体RNA。
警告:此试剂含有苯酚和瓜尼丁等子黄素。在烟罩中使用,并戴上实验室外套和手套。 - 在DEPC处理的脱离子H2 O中溶解分离的线粒体RNA,用分光光度计(材料表)估计RNA的浓度和纯度。
注:一般来说,从20克15-DAP玉米核获得±250 μg线粒体RNA。 - 制备一种由1xTAE缓冲液(40mMTris,20mM醋酸,1mM EDTA)、1.5%角胶(材料表)和1x核染色染料(材料表)组成的角胶凝胶。
- 加入适当的体积10倍加载缓冲液(0.5%溴酚蓝,0.5%二甲二醇FF和50%甘油),并在1.5%琼脂凝胶上加载线粒体RNA/加载缓冲液混合物。
- 在 5⁄6 V/cm 下运行凝胶,在 5⁄6 V/cm 下运行 20⁄25 分钟,并通过使用凝胶文档系统(材料表)对凝胶进行成像来评估线粒体 RNA 完整性。
注:玉米线粒体26S和18S rRNA分别存在两个不同的带(分别为±3,510和1,970 nt)是完整线粒体RNA的可接受标准。为了排除可能的降解,在循环RNA制备的多个步骤中应研究RNA完整性(图2)。
4. RNA 5'聚磷酸酶处理
- 设置RNA 5' 聚磷酸酶 (表和材料) 处理 (表 1), 并在 37°C 孵育 30-60 分钟.
- 根据制造商的说明,使用RNA纯化试剂盒(材料表)回收5'聚磷酸酶处理的RNA。
- 重复步骤 3.3 到 3.5。
5. RNA循环
- 使用相同量的5'聚磷酸酶处理和未经处理的线粒体RNA(表2),在16°C孵育两种反应12-16小时。
- 使用步骤 4.2 中相同的套件恢复两组自连结 RNA。
注:应该注意的是,只有一小部分线粒体RNA会自结,而回收的RNA将是线性和循环转录的混合物。 - 重复步骤 3.3 到 3.5。
6. 反向转录
- 从相同数量的5'聚磷酸酶处理和未经处理的RNA(200 ng)中合成两组cDNA。
- 通过添加 26S-CRT 的相等比率和最多 7 个其他 RT 引物来制备引物混合物。
注:引体混合物的最终浓度应为1μM。 - 通过结合表3中列出的试剂制备两种预混合物,在65°C孵育5分钟,然后在冰上冷却2分钟。
- 组装两个RT反应系统(表4),并在42°C孵育50分钟。
- 在70°C加热两种RT反应5分钟,然后在冰上冷却。
7. 规范化
- 通过添加从5'聚磷酸酶处理或未经处理的RNA衍生的相同体积的模板cDNA,在5'-3'的圆形26S rRNA(即26S-CF1和-CR1)的5'-3'结侧,以发散的引物(表5)等,准备两种PCR反应。
- 在表6中描述的条件下,在热循环器(材料表)中运行两种反应。
- 制备一种由1x TAE缓冲液、1.0%角胶和1x核染色染料组成的角胶凝胶。
- 在两种PCR产品中各加入2μL 10x加载缓冲液(0.5%溴酚蓝、0.5%二甲二醇FF和50%甘油),并将其加载到凝胶上。
- 以 5⁄6 V/cm 的 1x TAE 缓冲液运行凝胶 30-40 分钟,并使用步骤 3.5 相同的凝胶文档系统进行成像。
- 使用计算机软件(材料表,图4A)比较两种PCR产品的丰度,并在必要时通过更改模板cDNA的数量来优化规范化。
8. PCR 放大
- 通过添加适当体积的标准化 cDNA 和一对在目标转录本的 5'-3' 结侧翼发发引物,准备 PCR 反应对(表 7)。
注:用于PCR扩增目标转录本的模板cDNA量由26S rRNA规范化结果确定。 - 根据表8中描述的程序执行PCR反应。
- 重复步骤 7.3 到 7.5。
- 更改为嵌套发散引注,并通过重复步骤 8.1 和 8.2 验证第一轮 PCR 结果。
- 重复步骤 7.3 到 7.5。
- 使用凝胶DNA恢复试剂盒(材料表)恢复可在两轮PCR扩增中重复的突出带。
9. 确定笔录特尼
- 使用标准技术将凝胶纯化的PCR产品克隆成钝端载体(材料表)。
- 执行菌落 PCR 以选择包含目标插入的阳性克隆,并将其进行商业顺序排列。
注:包含可变大小的插入物的正克隆通常从单个恢复的波段检测,因为植物线粒体中的许多稳态转录本具有异构性 5' 和/或 3' 结束1,12。 - 使用国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部对齐搜索工具(BLAST),将测序数据与玉米线粒体基因组对齐。选择有机体"玉米(分类:4577)",并搜索数据库"核苷酸收集(nr/nt)"。
- 找到循环抄录的5'-3'结点,并确定5'和3'成绩单的终点位置。
- 计算目标成绩单的大小。
10. 通过RNA凝胶布洛杂交验证cRT-PCR映射结果
注:RNA凝胶体杂交是通过使用商业试剂盒(材料表)进行的,该试剂包含用于用二角性金(DIG)和T7RNA聚合酶转录RNA的试剂,杂交和免疫学检测。有关详细信息,请参阅本工具包中提供的协议。确保整个过程只使用无RNase设备。
- 放大用于制备RNA探针的DNA片段,并将其克隆到与步骤9.1相同的载体,该载体包含插入位点上游的T7启动子17bp。
- 使用适当的限制性酶对构造进行线性化,通过DNA纯化试剂盒(材料表)恢复线性质粒,并将其溶解在DEPC处理的去离子化H2O中。
- 根据制造商的说明,通过商业套件(材料表)使用 DIG-11-UTP 标记 RNA 探针。
- 使用 DEPC 处理的去离子 H2O 调节至 pH 7.0,通过过滤进行灭菌,制备 500 mL 的 10x MOPS 缓冲液(0.2M MOPS、50 mM 醋酸钠和 10 mM EDTA)。
- 在步骤3.1~3.3中制备的线粒体RNA中加入2~3卷的加载缓冲液(50%形式酰胺、6.2%甲醛、1x MOPS、10%甘油和0.1%溴酚蓝)。
- 在65°C下变性RNA样品/加载缓冲混合物10分钟,然后在冰上冷却1分钟。
- 制备变性琼脂糖凝胶(2%甲醛、1.2%琼脂糖和1x MOPS),并将RNA样品/加载缓冲混合物加载到凝胶中(每口1⁄2微克线粒体RNA)。
- 以 3⁄4 V/cm 的 3⁄4 V/cm 运行凝胶,工作约 4 小时。
- 准备 2 L 的 20x SSC(3 M 纳Cl,0.3 M 柠酸钠,pH 7.0)。用0.1%的DEPC过夜,并通过高压灭菌器消毒。
- 在 20x SSC 中冲洗凝胶两次(每次 15 分钟),并通过毛细管转移到尼龙膜(材料表),使用 20x SSC 进行 10-16 小时处理。
- 在120°C烘烤30分钟,将RNA固定在膜上。
- 根据制造商的说明,使用商业试剂盒(材料表)进行RNA杂交和免疫学检测。
11. 对初级和加工5'目的的歧视
- 通过比较从标准化的5'聚磷酸酶处理和未经处理的RNA中获得的cRT-PCR产物,区分原发和加工的5'端。
注:在初级记录本中,5'聚磷酸酶处理RNA的PCR产物的丰度远远高于未经处理的对口产品(图1,"基因A"和图4A)。然而,对于加工的转录本,PCR产品的可比水平将从两组线粒体RNA中放大(图1,"GeneB")。 - 根据cRT-PCR映射结果设计RT-qPCR引基。
- 通过 RT-qPCR 验证 cRT-PCR 鉴别结果。
注:从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA中提取的两个cDNA样本由26S成熟rRNA的RT-qPCR产物归一化。
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Representative Results
线粒体RNA循环效率估计
在以前的研究中,总和线粒体RNA都用于cRT-PCR映射线粒体转录在阿拉伯拉多普西斯(阿拉伯拉多普西斯)的线粒体转录终点,两种类型的RNA给出了类似的映射结果12。最初,我们还使用总RNA在玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射。经过多次试验,我们发现目标记录很难被检测出来。作为改进,我们丰富了玉米开发内核中的线粒体RNA,使循环靶转录本在一轮PCR中得以扩增成为可能。
为了解释富集后目标转录本的易扩增,我们通过在代表性线粒体基因nad5上执行RT-PCRs来估计RNA循环效率(图3和图S2)。玉米nad5基因含有两个转子和两个cis-拼接内子. 在总和线粒体RNA自结合后,使用nad5-RT1和-RT2引体独立合成第一股cDNA。两个引录可以反向转录线性和圆形nad5 mRNA (图 S2)。四对收敛底漆用于PCR放大:用于半定量RT-PCR(RT-sqPCR)的sqF1和sqF2&sqR2,以及用于RT-qPCR的qF1&qR1和qF2&qR2。对于由nad5-RT1转录的cDNA,所有四对引录都检测到圆形和线性nad5成熟mRNA;对于nad5-RT2逆转录反应,sqF2&sqR2和qF2&qR2调查了两种形式的mRNA,而sqF1&sqR1和qF1&qR1 PCR产品仅来自循环nad5。 基于此分析,我们使用 sqF2&sqR2(用于 RT-sqPCR)和 qF2&qR2(对于 RT-qPCR)PCR 产品来规范化 nad5-RT1 和 -RT2 逆转录反应,并通过比较估计循环nad5的比例sqF1&sqR1(用于RT-sqPCR)或qF1&qR1(用于RT-qPCR)PCR产品。在自结之前,RNA通过RNA 5'聚磷酸酶预处理,使RNA连带酶提供所有转录本进行循环处理。RT-sqPCR分析表明,使用总RNA时,na5 mRNA的很小一部分被循环化,但当使用富集线粒体RNA时,该比例显著增加(图3B)。RT-qPCR结果显示,自结合nad5 mRNA在浓缩后从3.7%增加到32%(图3C)。对nad1的分析也给出了类似的结果,nad1 mRNA的循环效率从0.7%提高到30%(图3D-F)。
通过这些分析,约30%的玉米线粒体RNA在改进后自结,循环效率的提高解释了cRT-PCR对靶转录图的易检测。
玉米的测定考克斯2使用基于cRT-PCR的策略的mRNA术语
我们以cox2基因为例,利用基于cRT-PCR的策略介绍了玉米线粒体转录图的映射和鉴别(图4)。
在绘制cox2 mRNA的开头,在基因编码区域设计了三个向外的引源CF1、CF2和CR1(图4D)。CF1 和 CF2 是嵌套引基,CF2 是 CF1 下游的 69 bp。CF1&CR1引基对使用步骤6.1~6.5合成的模板cDNA并在步骤7.1~7.6处归一化,放大了两个突出的带,并且通过嵌套引子CF2&CR1(图4A)重复放大结果。此外,这两个带被强放大从5'多噬酶处理RNA,而他们很难检测在未处理的对应物,这表明他们对RNA 5'多噬酶敏感,有原发性5'的终点。
两个候选带被命名为cox2-1和-2,它们从胶凝成中独立恢复并克隆成载体。 殖民地PCR结果表明,正克隆包含具有可变大小的插入物,这意味着转录本的异构5'和/或3'的终点(图5)。阳性克隆进行商业测序,测序数据与步骤9.3中描述的玉米线粒体基因组一致。
测序和对齐结果显示,两个转录在3'端相同,但长度为5'TDR(图4D)。cox2-1 和 -2 的 5' 端分别在 992-1,030 和 1,276-1,283 nt 的 AUG 上游丰富,而其 3' 端是 39 nt 下游的停止科顿.从cRT-PCR结果推断,cox2-1和-2的计算尺寸分别为1,804*1,832和2,088*2,095 nt。
为了验证cRT-PCR的映射结果,利用从cox2基因编码区域获得的探针进行RNA凝胶印菌,并检测出两个大小与cox2-1和-2相似的大带(图4C)。此外 , 在北部斑点中检测到两个大约 2 , 500 和 2 , 800 nt 的段 , 但它们没有被 cRT - PCR 放大。两个较大的波段分别被命名为cox2-3和-4。 为了绘制它们图,设计了另外两个面向外部的引脚器(即 CR2 和 CF3),锚定在cox2-2 的 5' 和 3' TR 上,它们的位置接近cox2-3 和 -4 的预期转录端。使用引物对CF3&CR2,两个主要带从从5'多噬酶处理RNA衍生的cDNA中强烈扩增,而不是来自未经处理的对应物(图4A)。测序结果表明,它们具有相同的5'termini,而变量3'结束。两个转录本的计算大小分别为2,512/2,513和2,833–2,835 nt,它们的大小与在北方斑点中检测到的两个较大的波段非常接近。此外,cRT-PCR结果表明,cox2-3和-4具有初级5'的终点。
为了确认鉴别结果,根据cRT-PCR映射结果设计了5个外向引基,即qCF1、qCF2、qCR1、qCR2和qCR3,并采用引基对qCF1&qCR1、qCF1&qCR2、qCF1&qCR3和qCF2&qCR3分别为cox2-1、-2、-3 和 -4 的 RT-qPCR 分析。5'多噬酶处理样品中所有四种RT-qPCR产品的相对丰度远远高于未处理的对口产品,这证实了cRT-PCR的鉴别结果。
综上所述,玉米cox2基因的转录模式复杂,基于cRT-PCR的策略有效地区分和映射了cox2 mRNA的多重等形。
图1:基于cRT-PCR的策略概述。说明基于cRT-PCR战略的主要步骤。5'+ 和5'- 分别由RNA 5'聚磷酸酶处理和未处理的两个RNA样品。从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA中提取的两个cDNA样本在玉米中通过26S成熟rRNA归一化,通过比较cRT-PCR产物来区分原发和加工的转录本。对于基因A,相应的RNA具有初级5'结束,因为PCR产物丰度来自5'聚磷酸酶处理RNA远远高于未经处理的RNA;对于基因B,两组线粒体RNA中的PCR产物在可比水平上被放大,这意味着相应RNA的加工5'终点。编码区域和 UtR 分别由灰色框和粗体表示。CRT = 逆转录引基;CF1、CF2、CR1 和 CR2 = PCR 引录侧翼为圆形转录本的 5'-3' 结;qCF 和 qCR = RT-qPCR 的发散引基。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:琼脂糖凝胶电泳对线粒体RNA完整性的评价。(A) 线粒体RNA由15-DAP玉米核制备。M = DNA分子标记。(B) 经5'聚磷酸酶处理和/或T4RNA连带循环处理后的内核线粒体RNA。5'+ = 线粒体RNA处理后5'多磷酸酶;T4&5'+ = 线粒体RNA处理后5'聚磷酸酶和循环通过T4RNA连带;T4&5'- = 线粒体RNA仅在循环后。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:由RT-PCR估计的nad5和nad1mRNA的循环效率。 (A) 和 (D) 分别绘制nad5和nad1基因的原理图.Ex = 外向。Exons 和 intron 分别显示为灰色框和曲线。反向转录引基器RT1和RT2的位置用箭头表示。黑点表示 PCR 引漆的位置,并显示了 PCR 产品的预测大小。sqF1、sqF2、sqR1 和 sqR2 是 RT-sqPCR 的引种;qF1、qF2、qR1 和 qR2 是 RT-qPCR 的引基。(B) 和 (E) RT-sqPCR 分别对nad5和nad1 mRNA 的循环效率进行分析.M = DNA分子标记。(C) 和 (F) RT-qPCR 分别分析nad5和nad1 mRNA 的循环效率。RT1 和 RT2 引录的两个 cDNA 样本反向转录通过 sqF2&sqR2(对于 RT-sqPCR)或 qF2&qR2(对于 RT-qPCR)PCR产品进行归一化。nad5和nad1 mRNA 的循环效率是通过比较 sqF1&sqR1(对于 RT-sqPCR)或 qF1&qR1(对于 RT-qPCR)的 PCR 产品来估算的。循环/(圆形+线性)= qF1&qR1 在 RT2 反应中超过 qF2 反应/qF1&qR1 超过 rt1 反应中的 qF2&qR2。值是三个生物复制的平均值和 SD。为了排除5°三磷酸酯的潜在影响,RNA在自结前用5°聚磷酸酶处理。总计和 Mito = 总计和线粒体 RNA,分别。RT1 和 RT2 = cDNA 反向转录由 RT1 和 RT2 引录,请分别单击此处查看此图的较大版本。
图4:使用cRT-PCR-cased策略绘制cox2成熟mRNA基尼。(A) cox2 cRT-PCR产品的凝胶分离.[ 和 - ] cDNA 分别来自 5° 聚磷酸酶处理和未经处理的线粒体RNA。两个cDNA样本通过26S cDNA(26S)的扩增进行归一化。五种引基用于循环cox2 mRNA的cRT-PCR分析:CF1、CF2和CF3为嵌套引基,CF2和CF3分别为CF1下游69bp和138 bp;CR1 和 CR2 是嵌套底漆,CR2 在 CR1 上游为 1,288 bp。CF1 和 CR1 和 CF2&CR1 放大了"1"和"2"表示的频段,而"3"和"4"波段被 CF3 和 CR2 放大。这四个波段都是通过克隆来测序的。以星号标记的波段不能重复,并且它们被排除在结果之外。M = DNA分子标记。(B) RT-qPCR分析5'多磷酸酶处理后循环cox2 mRNA的相对丰度。两个cDNA样品由含有26S-CRT、cox2-CRT、nad5-CRT、nad6-CRT、nad7-CRT、nad9-CRT、cob-CRT和cox1-CRT的引体混合物合成,从26S成熟rRNA中提取的cDNA用于规范化。#/- = cox2在未处理样品中处理样品/cox2 超过 26S 的未处理样品中超过 26S。 值表示三个生物复制的均值和 SD。指示用于 RT-qPCR 的引水器。(C) cox2成绩单的北方污点分析.加载了2μg线粒体RNA。标记与cox2成熟mRNA的不同异种对应的带。(D) 从cRT-PCR结果推断出cox2 mRNA的转录终点。UTR 和打开的读取帧分别显示为粗体和灰色框。显示相对于 AUG (+1) 和 UAA (-1) 的 5' 和 3' termini 的位置,以及在这些位置排序的单克隆数。反向转录和PCR放大引基器的位置分别显示为闭合和开开箭头。用于RT-qPCR的朝外引基显示为开放方块,cox2探头的位置如图所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:按菌群PCR选择含有cox2-4插入物的阳性克隆。(A) 殖民地 PCR 筛选包含cox2-4插入件的单克隆。cox2-4插入件的大小约为1,165 bp,矢量序列的大小为100 bp。殖民地PCR产品的计算尺寸约为1,265 bp,并且那些含有小尺寸刀片的克隆没有排序,即数字11、14、22和23。(B) 在 (A) 中筛选的阳性克隆的测序结果。5'/3' 端 = 相对于 AUG (+1) 和 UAA (-1) 的 5' 和 3' 端。数字12和20的测序结果被排除在外,因为它们比其他小得多。请点击此处查看此图的较大版本。
| 组件 | 50 μL 反应 (μL) 的体积 | 最终浓度 |
| 10x RNA 5' 聚磷酸酶缓冲液 | 5 | 1x |
| RN酶抑制剂 (40 U/μL) | 0.75 | 0.6 U/μL |
| 线粒体RNA | Ⅹ | 0.2 μg/μL |
| RNA 5' 聚磷酸酶 (20 U/μL) | 2.5 | 1 U/μL |
| DEPC 处理的去离子化 H2O | 到 50 μL | - |
表1:RNA5'聚磷酸酶处理的反应组分。
| 组件 | 20 μL 反应 (μL) 的体积 | 最终浓度 |
| 10x T4 RNA 连结酶 I 缓冲液 | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 μM |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15% |
| RNA抑制剂(40 U/μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| 5' 聚磷酸酶处理或未经处理的线粒体RNA | Ⅹ | 0.1±0.2 μg/μL |
| T4 RNA 连带 I (30 U/μL) | 0.4 | 0.6 U/μL |
| DEPC 处理的去离子化 H2O | 到 20 μL | - |
表2:线粒体RNA循环反应成分。
| 组件 | 10 μL 预混合 (μL) 的体积 |
| 底漆混合物(总 1 μM)a | 2 |
| dNTP 混合物(每个 10 mM) | 1 |
| 循环5'聚磷酸酶处理或未经处理的线粒体RNAb | Ⅹ |
| DEPC 处理的去离子化 H2O | 到 10 μL |
表3:逆转录反应预混合。a引水混合物含有26S-CRT的等比和多达7个其他RT引水剂,最终浓度为1 μM. b两种预混合剂并排制备,并且含有相同量(200 ng)的循环5'聚磷酸酶处理或未经处理的线粒体RNA。
| 组件 | 20 μL 反应系统 (μL) 的体积 | 最终浓度 |
| 模板RNA/引种剂/dNTP* | 10 | - |
| 5x RTase 缓冲液 | 4 | 1x |
| RN酶抑制剂 (40 U/μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| DEPC 处理的去离子化 H2O | 到 20 μL | - |
表4:逆转录反应组。*在步骤6.3中制备的模板RNA/引体/dNTP预混合剂。
| 组件 | 20 μL 反应系统 (μL) 的体积 | 最终浓度 |
| 去离子 H2O | 7 | - |
| 2x反应缓冲液 | 10 | 1x |
| dNTP 混合物(每个 10 mM) | 0.4 | 每个 0.2 mM |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 26S-CR1 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 从圆形 5' 聚磷酸酶处理或未经处理的 RNA 派生的模板 cDNA | | 0.6 | - |
| DNA聚合酶(1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
表5:26S cDNAPCR扩增反应组。*最初,模板cDNA(0.6μL)的同等体积用于规范化。如有必要,更改模板 cDNA 的量,以确保两种 PCR 反应之间的 26S PCR 产物的丰度相同。
| 步 | 温度 | 时间 | 周期编号 |
| 初始变性 | 95 °C | 3分钟 | 1 周期 |
| 变性 | 95 °C | 15 秒 | 22~25个周期 |
| 引性退火 | 56 °C | 15 秒 | |
| 扩展 | 72 °C | 30 秒 | |
| 最终扩展 | 72 °C | 5分钟 | 1 周期 |
| 保持 | 4 °C | ∞ | - |
表6:可放大的PCR条件26ScDNA 规范化。
| 组件 | 20 μL 反应系统 (μL) 的体积 | 最终浓度 |
| 去离子 H2O | 到 20 μL | - |
| 2x反应缓冲液 | 10 | 1x |
| dNTP 混合物(每个 10 mM) | 0.4 | 每个 0.2 mM |
| 发散引向 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 发散底漆-反向 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 从圆形 5' 聚磷酸酶处理或未经处理的 RNA 中衍生的模板 cDNA | | Ⅹ | - |
| DNA聚合酶(1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
表7:循环目标转录本PCR扩增的反应组分。*这些反应中使用的模板cDNA的体积由26S rRNA规范化结果决定。
| 步 | 温度 | 时间 | 周期编号 |
| 初始变性 | 95 °C | 3分钟 | 1 周期 |
| 变性 | 95 °C | 15 秒 | 22-40 周期c |
| 引性退火 | 50-65 °C | 15 秒 | |
| 扩展b | 72 °C | 0.5-1 分钟 | |
| 菲那特扩展 | 72 °C | 5分钟 | 1 周期 |
| 保持 | 4 °C | ∞ | - |
表8:PCR条件,以放大目标成绩单。a精确的退火温带取决于 PCR 引漆的熔融温度。b伸长时间取决于要放大的目标的长度。建议时间是 PCR 片段每 1 kb 1 分钟。c一般来说,30~35个周期足以产生足够数量的PCR产品。对于低丰量成绩单,将循环次数增加到 40 个周期。
图S1:代表性玉米线粒体转录本的引体位置。CRT = 逆转录引基;CF1、CF2、CR1 和 CR2 = PCR 扩增的发散引子;qCF 和 qCR = RT-qPCR 的发散引基。玉米nad2-1、rps4-1和nad4-1的抄本期限已经确定(张等人,2019年1)。 显示相对于 AUG (+1) 和停止千兆位 (-1) 的最后一个核苷酸的 5' 和 3'端的位置。编码区域和 UtR 分别指示为灰色框和粗体行。请点击此处下载此文件。
图S2:玉米中nad5mRNA的循环效率估算原理。在自结扎反应中,只有一小部分线粒体RNA被循环化。为了计算循环nad5 mRNA的比例,使用两个基因特异性引源合成第一股cDNA,即nad5-RT1和-RT2。 在nad5-RT2 逆转录 (RT) 反应中,由 sqF2 和 sqR2(用于 RT-sqPCR)和 qF2&qR2(RT-qPCR)放大的 PCR 产品均来自线性和循环nad5,而 sqF1&sqR1(用于 RT-sqPCR)和 qF1&qR1(对于RT-qPCR)PCR产品仅从圆形nad5派生;在nad5-RT1反应中,所有四对PCR引能可以放大两种形式的nad5。 为了计算循环nad5 mRNA的比例,通过sqF2&sqR2或qF2&qR2PCR产品对两种反应进行归一化。通过比较两种RT反应之间的sqF1或qF1&qR1PCR产物的丰度,粗略估计了nad5 mRNA的循环效率。ex = 外向。Exons 和 intron 分别显示为灰色框和曲线。nad5-RT1 和 -RT2 引水器的位置用箭头表示。黑点表示 PCR 引漆的位置,并显示了 PCR 产品的预测大小。请点击此处下载此文件。
表 S1:入门信息。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在先前的研究中,利用阿拉伯多普西细胞悬浮培养的组蛋白和线粒体RNA,用cRT-PCR绘制线粒体转录终点,结果相似,获得12.然而,在许多其他研究中,只有富集线粒体RNA被用于绘制线粒体转录终点尼的图谱。研究发现,线粒体RNA的富集是玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射的重要一步。在此扩增后,循环线粒体RNA的比例从0.3%~3.7%大幅提升至+30%(图3和图S2),使得循环靶转录本在一轮PCR中得以扩增成为可能。
通过对玉米nad1和nad5的RT-PCR分析,估计了线粒体RNA的循环效率,这两种核子粒体RNA的循环效率均按cis-splonintrons分为独立前体。由于不能排除前体RNA存在的潜在影响以及RT效率的变化,这只是对真实线粒体RNA循环效率的粗略估计。
我们通过改变线粒体RNA和PEG8000的浓度以及延长孵育时间改变了自结状态,但这些变化似乎不会影响线粒体RNA的循环效率。虽然我们不确定进一步的Percoll梯度纯化是否能提高循环效率,但第2节中制备的粗线粒体的质量足以对玉米中线粒体转录的cRT-PCR映射进行绘制。由于多轮 PCR 可能导致误报结果,在一轮 PCR 中放大目标转录本使映射结果更可靠。
原录本的5'三磷酸盐不稳定,由于不明原因可转换为5'单磷酸盐。这个问题阻碍了主要记录和已处理成绩单之间的明确区分,方法是使用方法,这取决于存在/缺少5'三磷酸盐1,2,4。玉米26S rRNA的成熟形式具有单磷酸盐5'端,对RNA5'聚磷酸酶不敏感。为了尽量减少不稳定的5'三聚苯甲酸酯的影响,成熟26S rRNA用于使两个RNA样本正常化,经5'聚磷酸酶处理和未处理,是区分玉米中两种转录本的重要一步线粒体。规范化后,通过比较从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA样品中获得的cRT-PCR和RT-qPCR结果,可以区分初级和加工的转录本。初级转录本对5'聚磷酸酶敏感,它们从5'聚磷酸酶处理样品中强烈放大,但未从未处理的对应物中(或由于不稳定的5'三磷酸磷酸三磷酸酯处于非常低的水平)。。相比之下,处理过的抄本在两个样本之间以可比水平检测。
在植物中,许多线粒体基因的转录模式相当复杂1,2。例如,玉米nad6和atp6基因分别表现为单子和三分子,nad6、atp6和atp6-na6成熟mRNA分别具有2个、3个和2个同种。 此外,一个线粒体基因的转录组实际上是前体、成熟和降解RNA的混合物。PCR 容易放大小尺寸分子,很难使用一对引体检测所有转录等形。因此,需要RNA凝胶印菌来验证cRT-PCR的映射结果,并且可能需要额外的替代引体来放大在北方印块中检测到的转录本,但不是第一次cRT-PCR。
该协议包括用于验证 cRT-PCR 鉴别结果的 RT-qPCR 步骤。由于某些成熟 mRNA 的多个等形在大小1上非常接近,因此无法通过 RT-qPCR 确认所有鉴别结果,并且通过比较处理的 cRT-PCR 结果来确定一些稳态记录和未经处理的RNA。
在此协议中,通过克隆和测序cRT-PCR产物,绘制了目标转录本的5'和3'的终点,并限制了要测序的单克隆数量。作为替代方法,cRT-PCR产品可以通过下一代测序进行测序,该测序对数千个分子进行一组稳态转录序列,映射结果将更为准确。
除了通过cRT-PCR和RT-qPCR对原发和加工的5'termini进行鉴别外,单磷酸盐5'termini可以通过识别周围的RNA二次结构1,12来确定。众所周知,RNA二级结构,如tRNA和t元素,可以通过指示RNase P和/或RNase Z 12、18、19的内皮裂解,来介导线粒体转录端的形成。 20.因此,与tRNA或t元素相邻的5'termini应从转录后处理中得出,并含有单磷酸盐。
通过使用这个协议,在玉米线粒体1中已经确定了大部分稳态转录。但是,由于未知的原因1,少数未进行区分和/或映射。此外,我们认为5'抄本术语的位置最好通过引推扩展分析来确认,尽管它包含在该协议中。由于缺乏实验数据,我们不确定这种策略是否适合其他植物物种,如水稻(奥里萨水稻)和阿拉伯兰多普西。除了植物线粒体外,原发和加工的转录本都稳稳地积累在plastid21中,目前还不能确定这种策略能否用于映射和区分底形文字记录。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(授权号31600250,Y.Z.)、广州市科技项目(批号201804020015,H.N.)和中国农业研究系统(批号No.S.)的支持。CARS-04-PS09,H.N.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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