Summary
Gedissocieerde hippocampuscelcultuur is een cruciaal experimenteel hulpmiddel in de neurowetenschappen. De overleving en functie van neurale cellen in cultuur wordt verbeterd wanneer koraalskeletten worden gebruikt als matrices, vanwege hun neuroprotectieve en neuromodulerende rollen. Vandaar dat neurale cellen gekweekt op koraalmatrix een hogere duurzaamheid vertonen en daardoor geschikter zijn voor het kweken.
Abstract
Culturen van gedissocieerde hippocampale neuronale en gliacellen zijn een waardevol experimenteel model voor het bestuderen van neurale groei en functie door hoge celisolatie en een gecontroleerde omgeving te bieden. De overleving van hippocampuscellen in vitro komt echter in het gedrang: de meeste cellen sterven af tijdens de eerste week van de kweek. Het is daarom van groot belang om manieren te vinden om de duurzaamheid van neurale cellen in cultuur te vergroten.
Calciumcarbonaat in de vorm van kristallijn aragoniet afgeleid van het skelet van koralen kan worden gebruikt als een superieure, actieve matrix voor neurale culturen. Door gliacellen te voeden, te beschermen en te activeren, verbetert het koraalskelet de overleving en groei van deze cellen in vitro beter dan andere matrices.
Dit protocol beschrijft een methode voor het kweken van hippocampuscellen op een koraalmatrix. Deze matrix wordt gegenereerd door korrels van koraalskeletten te bevestigen aan kweekschalen, kolven en glazen dekplaten. De korrels helpen bij het verbeteren van de omgeving van de cellen door ze te introduceren in een fijne driedimensionale (3D) omgeving om op te groeien en weefselachtige structuren te vormen. De 3D-omgeving die door het koraalskelet wordt geïntroduceerd, kan voor de cellen worden geoptimaliseerd door te slijpen, wat controle mogelijk maakt over de grootte en dichtheid van de korrels (d.w.z. de matrixruwheid), een eigenschap waarvan is gebleken dat deze de activiteit van gliacellen beïnvloedt. Bovendien maakt het gebruik van korrels de observatie en analyse van de culturen gemakkelijker, vooral bij het gebruik van lichtmicroscopie. Daarom bevat het protocol procedures voor het genereren en optimaliseren van de koraalmatrix als een hulpmiddel om het onderhoud en de functionaliteit van neurale cellen in vitro te verbeteren.
Introduction
Culturen van gedissocieerde neurale cellen, in dit geval hippocampuscellen, zijn een waardevol experimenteel model voor het bestuderen van neurale groei en functie door hoge celisolatie en toegankelijkheidte bieden 1,2,3. Dit type cultuur wordt vaak gebruikt in de neurowetenschappen, medicijnontwikkeling en weefselmanipulatie vanwege de grote hoeveelheid informatie die kan worden verzameld, zoals groeisnelheden en levensvatbaarheid, neurotoxiciteit, neurietuitgroei en netwerken, synaptische connectiviteit en plasticiteit, morfologische modificaties, neurietorganisatie en bedrading, enz.1,4,5,6,7.
Ondanks de betekenis van de culturen, worden de gekweekte cellen meestal gedwongen om te groeien op glazen dekplaten in een tweedimensionale monolaag. Deze strikte omgevingsmodificaties verminderen het vermogen van neurale cellen om in de loop van de tijd te overleven aanzienlijk, omdat glazen afdekplaten niet-voedende substraten zijn met een lage hechtsterkte, die een lagere capaciteit vertonen om celgroei te ondersteunen 8,9,10,11.
Omdat gecultiveerde neurale cellen gedwongen worden om te groeien in uitdagende omstandigheden, zou een essentiële aanpak om hun overleving te verbeteren zijn om hun natuurlijke omgeving zoveel mogelijk te imiteren12,13. Dit kan worden bereikt door biomaterialen te gebruiken die als matrices fungeren en de extracellulaire matrix van de cellen nabootsen, waardoor ze een weefselachtige structuur kunnen vormen en kunnen helpen bij hun voeding14.
Het gebruik van biomaterialen is een veelbelovende benadering bij het verbeteren van celculturen, omdat ze fungeren als biocompatibele steigers, mechanische stabiliteit bieden en een verscheidenheid aan celeigenschappen verbeteren, waaronder adhesie, overleving, proliferatie, migratie, morfogenese en differentiatie15,16,17. Verschillende soorten biomaterialen worden gebruikt om de conditie van de cellen in vitro te verbeteren. Onder hen zijn biopolymeren, of biologische componenten die meestal deel uitmaken van de extracellulaire matrix van de cellen. Deze biomaterialen worden meestal gebruikt als een vorm van gepolymeriseerde coatingmiddelen of hydrogels18,19,20. Aan de ene kant geven de hierboven genoemde matrices de cellen een vertrouwde 3D-omgeving om in te groeien, stimuleren ze hun hechting aan de schotel en geven ze mechanische ondersteuning21,22. Aan de andere kant verstoort hun gepolymeriseerde vorm en de opsluiting van de cellen in hydrogels de toegang van de cellen tot verzorgende componenten die aanwezig zijn in de groeimedia en maakt het ook de follow-up van de cellen door microscopische methoden moeilijker23.
Koraal exoskeletten zijn biologische matrices van mariene oorsprong. Ze zijn gemaakt van calciumcarbonaat, hebben mechanische stabiliteit en zijn biologisch afbreekbaar. Eerdere studies met het koraalskelet als matrix voor het kweken van neurale cellen in cultuur hebben een veel grotere hechting aangetoond, vergeleken met glazen coverslips24,25. Bovendien toonden neurale cellen gekweekt op koraalskelet hun vermogen om het calcium op te nemen waaruit het skelet is samengesteld, dat de neurale cellen beschermt in omstandigheden van tekort aan voedingsstoffen26. Bovendien is het koraalskelet een ondersteunende en verzorgende matrix die de overleving van neurale cellen verhoogt, de vorming van neurale netwerken stimuleert, de snelheid van synaptische connectiviteit verhoogt en de vorming van weefselachtige structuren mogelijk maakt27,28. Recente studies hebben ook aangetoond dat de oppervlaktetopografie van de koraalskeletmatrix een cruciale rol speelt bij de distributie en activering van gliacellen 8,29. Ook is koraalskelet effectief als matrix voor het kweken van andere celtypen, zoals osteocyten30,31, hepatocyten en cardiomyocyten in cultuur (ongepubliceerde gegevens).
Daarom is koraalskelet een veelbelovende matrix voor het kweken van cellen in vitro. Het protocol dat hieronder wordt beschreven, beschrijft dus de techniek van het kweken van neurale cellen op koraalskelet voor het produceren van stabielere en welvarendere neurale culturen dan die welke worden bereikt door bestaande methoden. Dit protocol kan ook nuttig zijn voor de teelt van cardiomyocyten, hepatocyten en andere celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren in dit protocol is goedgekeurd door de National Animal Care and Use Committee.
OPMERKING: Calciumkoolzuurhoudende koraalskeletten moeten worden gebruikt in de kristallijne vorm van aragoniet. De koraalsoorten die tot nu toe zijn getest voor neurale culturen zijn Porites Lutea, Stylophora Pistillata en Trachyphyllia Geoffroyi. De skeletten kunnen in hun geheel of gemalen worden gekocht.
1. Het schoonmaken van de koraalskeletstukken
LET OP: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een chemische kap bij kamertemperatuur, omdat de hieronder beschreven oplossingen gevaarlijk zijn en brandwonden en irritaties kunnen veroorzaken.
- Gebruik een hamer om het koraalskelet te breken en verdeel het in fragmenten van 0,5-2 cm. Om organische en niet-organische residuen op te lossen, weekt u de koraalskeletfragmenten gedurende 10 minuten in 10% natriumhypochlorietoplossing en wast u vervolgens eenmaal met dubbel gedestilleerd water (DDW).
- Om de resterende organische resten te verwijderen, weekt u de fragmenten gedurende 5 minuten in een 1M NaOH-oplossing en wast u deze eenmaal met DDW. Ga verder met het verwijderen van de organische afzettingen door de fragmenten gedurende 10 minuten in 30% H 2 O2-oplossing te weken en was de fragmenten vervolgens 3x met DDW.
- Verwijder zoveel mogelijk overtollige DDW en laat de koraalfragmenten in de kap drogen (1-8 uur).
2. Reinigen van de glazen coverslips
- Breng de glazen afdekplaten over in een glazen petrischaal van 100 mm. Voeg 10 ml 95% ethanol toe gedurende 15 minuten.
- Verwijder de ethanol en was met DDW 3x, wacht 10 minuten tussen elke wasbeurt. Plaats de schotel op een voorverwarmde verwarmingsplaat van 80 °C totdat de DDW verdampt. Roer de afdekstroken tijdens het drogen een paar keer voorzichtig in de plaat om te voorkomen dat ze aan elkaar blijven plakken.
- Autoclaaf de coverslips.
3. Bereiding van koraalskeletkorrels
- Maal de koraalskeletfragmenten met behulp van een vijzel en stamper (handmatig slijpen) tot volledige afbraak. Het resultaat is een mengsel van korrels met afmetingen variërend van 20 μm-200 μm.
- Als alternatief kunt u de koraalskeletfragmenten slijpen met behulp van een elektrische slijpmachine met een snelheid van 1.000 tpm gedurende 30 s (bladlengte = 6 cm; breedte = 0,5 cm-1,0 cm). De resulterende korrelgrootte is vergelijkbaar met het groottebereik dat wordt geproduceerd door het handmatig malen.
4. Zuivering van korrels van een bepaald groottebereik
OPMERKING: Als controle over de grootte van de korrels in een matrix gewenst is, gebruik dan de volgende op filtratie gebaseerde korrelzuiveringsprocedure.
- Breng de korrels over op een handmatige of elektrische 40 μm filtergaaszeef.
- Verdeel de korrels in twee specifieke bereiken door de korrels door de zeef te zeven (bij gebruik van een elektrische zeef worden de volgende voorwaarden aanbevolen: schudden = 600 amplitude/min, stuiteren = 6/s). Deze procedure produceert twee groepen korrelgroottes, een <40 μm en de tweede >40 μm.
OPMERKING: De twee maten kunnen worden bepaald met behulp van zeven van verschillende mazen. Als een beperkter bereik gewenst is, zeef dan elke groep uit stap 4.2 opnieuw door zeven met verschillende mazen. - Autoclaaf de korrels.
5. Bereiding van met koraalkorrels bedekte schalen of coverslips
- Voor het coaten van kolven, borden of petrischalen
OPMERKING: De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.- Voeg de koraalskeletkorrels toe aan een 20 μg/ml poly-D-lysine (PDL) oplossing opgelost in de oplossing van Hanks. De aanbevolen concentratie is 5 mg/10 mg korrels per 1 ml PDL-oplossing.
- Giet de oplossing in kolven en schalen (ongeveer 2 ml/25 cm2) en incubeer een nacht bij 4 °C. De korrels zinken en hechten zich aan de bodem.
- Was de volgende dag de kolven en vaat een keer met steriele DDW. Laat de kolven en schalen drogen in de kap.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om vers gecoate kolven en schalen te gebruiken. De gecoate kolven en schalen kunnen tot een week na het coaten worden gebruikt als ze bij 4 °C worden bewaard. De effectiviteit van de matrix kan echter in het gedrang komen.
- Coating glazen coverslips (12 mm diameter, 0,17 mm dikte)
- Voeg koraalskeletkorrels toe aan DDW in elke gewenste concentratie. De gemeenschappelijke dichtheden die worden gebruikt voor neurale cellen zijn 5 mg / ml en 10 mg / ml. Giet 40 μL van de graanoplossing op het midden van de dekplaat (figuur 4).
- Plaats de afdekstroken op een tot 80 °C voorverwarmde verwarmingsplaat en wacht op volledige verdamping (meestal 15 min). Onder deze omstandigheden hechten de korrels zich aan de deklaag. Autoclaaf de gecoate coverslips. Bewaren in steriele omstandigheden.
- Plaats een dag voor de kweek de coverslips op het deksel van een steriele plaat met 24 putten. Voeg 100 μL 20 μg/ml PDL-oplossing toe aan elke coverslip. Gebruik de punt om ervoor te zorgen dat de vloeistof het hele korrelgebied en de rest van het dekslipoppervlak bedekt.
- Bedek het deksel met de onderkant van de plaat. Wikkel de zijkanten van de borden in met paraffinefolie. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- De volgende dag een keer wassen met DDW en drogen in de kap.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om vers gecoate coverslips te gebruiken.
6. Teelt van hippocampale gedissocieerde cellen op met koraalskelet bedekte glazen dekplaten
OPMERKING: De methode voor hippocampale gedissocieerde celkweek is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde procedures24,27. De bereiding van de cultuur wordt beschreven voor vier rattenpups. De verwachte opbrengst van elke hippocampus is 1-1,5 x 106 cellen.
- Setup
- Maak een lege petrischaal van 60 mm. Giet 2 ml minimaal essentieel medium (MEM) in een petrischaal van 60 mm en leg op ijs.
- Giet 2 ml MEM in een schaal van 35 mm en plaats deze in een incubator bij 37 °C, 5-10% CO2. Giet 2 ml MEM in een buis van 15 ml en houd deze op 4 °C.
- Giet 1 ml First Day Medium in een buis van 15 ml en plaats deze in een couveuse bij 37 °C, 5-10% CO2.
OPMERKING: De samenstelling van het medium van de eerste dag wordt beschreven in de materiaaltabel. - Ontdooi 200 μL van een 2,5% trypsine-oplossing en incubeer bij 37 °C.
- Bereid drie glazen Pasteur-pipetten met koppen met een diameter van 0,5 mm, 0,75 mm en 1,0 mm met behulp van een vlam.
- Bereid voldoende chirurgische hulpmiddelen voor: een grote schaar, twee kleine scharen, een groot pincet, vier kleine pincetten en een scalpel.
- Zet een stereomicroscoop in de kap.
- Offer met een grote schaar 0-3 dagen oude Sprague Dawley rattenjongen door hun hoofd van hun lichaam te scheiden in een lege petrischaal van 60 mm (stap 6.1.1). Gooi de lichamen weg.
- Pak het hoofd op door het met een groot pincet uit de mond te houden. Knip de huid die de schedel bedekt met een kleine schaar.
- Ga met een schone schaar onder de schedel (aan de zijkant van het cerebellum) naar binnen en knip de schedel naar rechts en naar links om de verwijdering mogelijk te maken. Trek met een klein pincet de schedel van de hersenen af.
- Scheid met een schoon pincet de hersenen van het hoofd en doe het in een petrischaaltje van 60 mm met 2 ml koude MEM (zie stap 6.1.2).
- Ontleed met twee kleine pincetten de hippocampi onder een stereomicroscoop. Breng de hippocampi over in de bereide schaal van 35 mm (vanaf stap 6.1.2) met MEM.
OPMERKING: Stap 6.3-6.6 moet voor elke pup worden herhaald. - Snijd de hippocampi in plakjes van ongeveer 1 mm met behulp van het scalpel. Voeg 200 μL van de trypsine-oplossing toe (verdund tot een eindconcentratie van 0,25%). Meng voorzichtig en incubeer bij 37 °C, 5-10% CO2 gedurende 30 min.
- Voeg na incubatie 2 ml koude MEM (stap 6.1.2) toe aan de schaal om de trypsine te deactiveren. Breng het trypsineweefsel over in een buis van 15 ml met 1 ml First Day Medium voorverwarmd tot 37 °C (stap 6.1.3) met behulp van de glazen Pasteurpipet met de grootste diameter (stap 6.1.5).
OPMERKING: De beste verhouding tussen medium en weefsel (v:v) voor verdere verwerking van het weefsel is 1 ml / 8 hippocampi. Vermijd zoveel mogelijk het overbrengen van het medium met het weefsel. - Trituleer het weefsel door het 10-15 keer door de glazen pipet met de grootste diameter te laten gaan. Herhaal dit proces vervolgens met behulp van de glazen pipet met de gemiddelde diameter. Ga door met tritureren met de pipet met de kleinste diameter. Vermijd borrelen om celdood te verminderen.
- Laat de resterende weefselstukken 2-5 minuten zinken en breng het supernatant vervolgens over in een andere buis van 15 ml. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
OPMERKING: De voorkeursceldichtheid is 200.000-400.000 cellen / ml. Gebruik First Day Medium om te verdunnen of centrifugeren bij 470 x g om de cellen te concentreren. - Zaai 100 μL cellen op elke glazen dekplaat. Zorg er tijdens het zaaien voor dat je de hele coverslip bedekt met cellen. Incubeer bij 37 °C, 5-10% CO2.
- Voeg de volgende dag 500 μL neuronaal groeimedium toe aan de putjes.
OPMERKING: De samenstelling van het neuronale groeimedium wordt beschreven in de materiaaltabel. - Breng elke coverslip voorzichtig over naar de juiste put met een pincet terwijl u de First Day Medium verwijdert door de coverslip te kantelen. Zuig de resterende media uit het deksel.
- Incubeer bij 37 °C, 5-10% CO2. Vermijd het vervangen van het medium tijdens de incubatie. Culturen kunnen onder deze omstandigheden tot 1 maand worden onderhouden. De grootste zorg is de luchtvochtigheid. Zorg er daarom voor dat de couveuse maximaal bevochtigd blijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de koraalskeletmatrix voor te bereiden, werd het hele koraalskelet (figuur 1A) met een hamer in fragmenten van 0,5-2 cm gebroken en grondig gereinigd van organische residuen door middel van drie stappen (stap 1 in het protocol) met behulp van 10% hypochlorietoplossing, 1M NaOH-oplossing en 30% H 2 O2-oplossing (figuur 1C). Koraalfragmenten werden goed schoongemaakt toen de skeletkleur veranderde van bruin (figuur 1D) naar wit (figuur 1E). Vervolgens werden de gereinigde stukken (figuur 2A) gemalen met behulp van een vijzel en stamper (figuur 2B) of een elektrische slijpmachine (figuur 2C). Beide procedures leverden vergelijkbare resultaten op: een mengsel van korrels variërend tussen 20 μm-200 μm groot (figuur 2D-G).
Een van de voordelen van korrelige matrix ten opzichte van oplosbare substraten is dat verschillende van zijn structurele en fysische eigenschappen kunnen worden gewijzigd, waardoor het meer kwantitatief wordt. In deze koraalskeletkorrelmatrix werden twee van de eigenschappen van het graanmengsel gemanipuleerd: korrelgrootte en korreldichtheid. Om de groottediversiteit van 20 μm-200 μm die door de bovenstaande maalprocedure wordt gegenereerd, te verminderen, is gekozen voor een zeefbenadering met een filtergaas van 40 μm. Met behulp van handmatige (figuur 3 A-D) of elektrische (figuur 3E) zeven werden twee soorten graanmengsels geproduceerd: een met korrels variërend van 40 μm-200 μm groot (figuur 3 F, H) en de tweede met een grootte van 40 μm of minder (figuur 3G, I). De dichtheid van de korrels die de dekplaten en schalen bedekten, werd eenvoudig bepaald door verschillende hoeveelheden korrels aan te brengen en deze door hitte aan de dekplaten te bevestigen (figuur 4C) of aan kolven en schalen door zwaartekracht (figuur 4H). Op deze manier werden matrices van lage (figuur 4 D,F,I) en hoge dichtheden (figuur 4E,G,J) geproduceerd.
Figuur 5 toont het resultaat van de kweek van hippocampuscellen op dekplaten bedekt met <40 μm (10 mg / ml) koraalskeletkorrels. Fasecontrastmicrografieën laten zien dat de cellen complexe neurale netwerken vormden in de afwezigheid (figuur 5A) en aanwezigheid (figuur 5B) van de matrix. Celkernkleuring (figuur 5C,D) gaf aan dat 14 dagen na het zaaien de celdichtheid hoger was op de matrix dan op de ongecoate coverslips. Kleuring met microtubule associated protein 2 (MAP2) toonde aan dat zich op de matrix een complex neuronaal en dendritisch netwerk vormde (figuur 5F) in vergelijking met de controle (figuur 5E). Bovendien ondergingen gliacellen gekweekt op de koraalskeletmatrix gevisualiseerd met behulp van het gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) significante morfologische veranderingen. Ze kregen een spikier uiterlijk met langere processen dan de gliacellen die op het controlesubstraat werden gekweekt, waar ze ronder en platter leken (figuur 5G,H).
Figuur 1: Het koraalskelet reinigen. (A) Het skelet van het koraal Stylophora pistillata. (B) Afgebroken fragmenten van het skelet voorafgaand aan reiniging. (C) De fragmenten van (B) na behandeling met hypochlorietoplossing, natriumhydroxide en waterstofperoxide. (D) Vergroting van het onder B) afgebeelde ongereinigde fragment. (E) Vergroting van het gereinigde fragment weergegeven onder (C). Schaal: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het koraalskelet slijpen. (A) Gereinigde koraalskeletfragmenten. (B) Vijzel en stamper gebruikt voor handmatig slijpen. Rode pijl wijst naar de resulterende korrels. (C) Slijpmachine. Rode pijl wijst naar de resulterende korrels. (D) Korrels na handmatig malen. (E) Korrels na mechanisch malen. f) Uitbreiding van (D). g) Uitbreiding van (E). Schaal: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Controle over de korrelgrootte. (A-D) Handmatige overbelastingsprocedure. (A) Met behulp van een zeef van 40 μm. (B) Zeef met ongerekte gemalen korrels geplaatst in een buis van 50 ml en gezeefd met behulp van een vortex. (C) Gespannen <40 μm korrels aan de onderkant van de 50 ml buis. (D) Korrels met een minimale grootte die vergelijkbaar is met die van de maas (>40 μm, gele pijl). (E) Mechanische zeef die wordt gebruikt om <40 μm korrels te persen uit een mengsel van korrels van 20 μm-200 μm groot. (F) Demonstratie van verschillende korrelgroottes na het malen voorafgaand aan het persen. (G) Demonstratie van gespannen korrels <40 μm. (H) Vergroting van (F). i) Uitbreiding van (G). Schaal: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Controle van de dichtheid van de matrix. (A) Een centrifugebuis van 1,5 ml met korrels van <40 μm verdund tot 10 mg/ml met DDW voor coverslips, PDL voor andere gerechten. (B) Glazen dekplaat met 40 μL van 10 mg/ml oplossing. C) Afdekplaten met 40 μL of 10 mg/ml oplossing drogen op een hete plaat voorverwarmd tot 80 °C, zodat de korrels zich aan de dekplaat kunnen hechten. (D) Gecoate dekplaat met een korrelconcentratie van 5 mg/ml na DDW-verdamping. (E) Gecoate dekplaat met een korrelconcentratie van 10 mg/ml na DDW-verdamping. f) Uitbreiding van (D). g) Uitbreiding van (E). H) Een oplossing van 10 mg/ml in een erlenmeyer T-25, plaat van 60 mm. (I) Gecoate kolf met korrels in een concentratie van 5 mg/ml. J) Gecoate kolf met korrels in een concentratie van 10 mg/ml. Schaal: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cultivatie van hippocampale neurale cellen op de koraalskeletmatrix. Afbeeldingen tonen cellen geëxtraheerd uit 0-3 dagen oude rattenpup hippocampi die gedurende 14 dagen in cultuur zijn gegroeid en gekleurd met GFAP (rood, gliacellen), MAP2 (groen, neuronale soma's en dendrieten), DAPI (blauw, celkernen). (A) Fasecontrastbeeld van cellen in afwezigheid van de matrix. (B) Fasecontrastbeeld van cellen gekweekt op de koraalskeletmatrix. (C) Cellen gekweekt zonder matrix gekleurd met DAPI. (D) Cellen gekweekt op de koraalskeletmatrix gekleurd met DAPI. (E) Cellen gekweekt in afwezigheid van de matrix gekleurd voor MAP2. (F) Cellen gekweekt op de koraalskeletmatrix gekleurd voor MAP2. (G) Cellen gekweekt zonder matrix gekleurd voor GFAP. (H) Cellen gekweekt op de koraalskeletmatrix gekleurd voor GFAP. (I) Samengevoegde afbeelding van (C), (E), (G). (J) Samengevoegde afbeelding van (D), (F), (H). Schaal = 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde techniek beschrijft een manier om het onderhoud en de functionaliteit van neurale cellen in cultuur te verbeteren. Dit wordt bereikt door de cellen te hechten aan een matrix gemaakt van koraalskeletkorrels die de cellen voedt en hun groei en activiteit bevordert. Het gebruik van deze techniek verhoogt de capaciteit van het neurale cultuurmodel om de omgeving van de cellen in de hersenen na te bootsen.
De introductie van de matrix als cultuursubstraat heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere substraten die worden gebruikt in klassieke neurale celkweekmethoden. Ten eerste verhoogt het de celtrouw. De combinatie van koraalskelet en PDL genereert een sterkere kleefkracht dan glas en PDL (niet getoond). Een dergelijke toename van de kleefkracht is essentieel gebleken voor de overleving van aanhangende niet-zwevende cellen in cultuur32. Ten tweede zijn de calciumkoolzuurhoudende kristallen van de koraalskeletkorrels een bron van calciumionen die daadwerkelijk door de cellen worden opgenomen. Het is zeer waarschijnlijk dat dit de reden is voor verbeterde duurzaamheid en verhoogde dichtheid (figuur 5C, D) van neurale cellen die worden tentoongesteld op de koraalskeletmatrix, vergeleken met hun overlevingsniveau in afwezigheid26.
Een derde voordeel ligt in het feit dat de koraalskeletmatrix eigenlijk niet-vlak is, in tegenstelling tot de glazen dekplaat. De korrels zijn 3D-gestructureerd met een complexe, gebogen oppervlaktearchitectuur. Deze structurele eigenschappen variëren wanneer men bedenkt dat de cellen te maken hebben met korrelpopulaties van verschillende morfologieën, afmetingen en dichtheden. Zo'n ruwe en niet-vlakke kweekstof bootst het milieu van de cellen in vivo beter na dan de klassieke platte dekplaat. We hebben inderdaad aangetoond dat de ruwheid, grootte en morfologie van het koraalskelet de celverdeling, overleving en activiteit beïnvloedt 8,26,29.
Bovendien verschilt de 3D-configuratie die een koraalskeletmatrix de cellen als micro-omgeving biedt sterk van de conventionele hydrogelmatrices die worden gebruikt voor 3D-groei in vitro. Bij het gebruik van hydrogels, zoals collageen en hyaluronzuur, zijn de cellen ingebed in de gel23. De gel lijkt op de extracellulaire matrix in termen van ruimtevulling, stijfheid en andere attributen, maar vanwege de viscositeit van de gels vereisen deze culturen gecompliceerde voedingssystemen om de cellen goed gevoed te houden21,22. Daarentegen stellen de 3D-korrels van het koraalskelet de cellen in staat om hun oppervlak te bezetten, dat volledig openstaat voor het kweekmedium. Bovendien zijn, in tegenstelling tot de hydrogelculturen, de cellen op de koraalskeletmatrix gemakkelijk te volgen door middel van fase- en fluorescerende microscopie.
Deze techniek heeft verschillende beperkingen. Ondanks de hierboven genoemde voordelen is koraalskelet een biomateriaal en kan het niet worden vervaardigd maar verzameld uit dode koralen, waardoor het matrixaanbod beperkt is, hoewel sommige commercieel verkrijgbaar zijn. Ook kan het gebruik van skeletten van meerdere koraalsoorten variaties in cultuureigenschappen introduceren. Aan de andere kant, het feit dat koraalskeletkristallen allemaal zijn gemaakt van één stof, aragoniet, en dat de grootte van de korrels kan worden gecontroleerd, elimineert het grootste deel van de chemische en structurele diversiteit tussen de matrices. De korrels van alle geteste biomaterialen zijn groot genoeg om de cellen te dwingen driedimensionaal te groeien. De cellen klimmen op de korrels8, groeien door zich te hechten aan de uiteinden van de kristallen33 en kruisen tussen korrels27. Als alternatief is geologisch aragoniet, gemaakt van fossiele sedimenten en synthetisch calciumcarbonaat, in de handel verkrijgbaar en kan het worden gebruikt als een matrix. Het kan echter een lagere hechting aan de glazen dekplaten vertonen.
Met het oog op het gebruik van meerdere koraalsoorten, is het belangrijk op te merken dat sommige studies bewijs hebben aangetoond van biomineralisatie van koralen, wat kan leiden tot de aanwezigheid van diverse organische afzettingen tussen de calciumcarbonaatkristallen. Deze kunnen niet worden verwijderd met behulp van het reinigingsproces beschreven in dit protocol33,34. Dit feit is van cruciaal belang bij het identificeren van een biomateriaal voor biologische toepassingen. In het geval van dit onderzoek zijn eerder verschillende stappen uitgevoerd om zoveel mogelijk homogeniteit van de steiger te garanderen. Eerst werden drie soorten koralen getest op matrices: Porites Lutea, Stylophora Pistillata en Trachyphyllia Geoffroyi. Er waren geen significante veranderingen in termen van groei en overleving van neurale cellen op deze koraalskeletten. Dit resultaat kan erop wijzen dat verschillende organische afzettingen in het skelet in dit geval geen significante invloed hebben. Ten tweede toonde fourier-transform infraroodspectroscopie van schoon koraalskelet de afwezigheid van organische residuen29.
Er zijn enkele kritieke stappen binnen het protocol waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste, tijdens het handmatig zeven van de korrels, wordt het aanbevolen om de zeef van tijd tot tijd te vervangen, omdat de zeven de neiging hebben om te verstoppen. De elektrische zeef gebruikt meer kracht tijdens het zeven. Het heeft dus niet de neiging om zo gemakkelijk te verstoppen. Ten tweede, tijdens het verspreiden van het PDL-koraalkorrels mengsel op de schalen en coverslips, is het belangrijk om het mengsel regelmatig te pipetteren om het zinken van de korrels te voorkomen. Dat zorgt voor een homogene verspreiding van de oplossing. Het is belangrijk om aandacht te besteden aan het bevestigingsproces van de korrels aan de dekzeilen. Onjuiste verwarmingstemperaturen tijdens het bevestigen van de korrel aan de glazen dekplaat, trillingen en andere factoren kunnen ervoor zorgen dat de korrels voor of na het zaaien van de cel loskomen. Het wordt aanbevolen om dit probleem op te lossen door de temperatuur zorgvuldig te regelen en trillingen te minimaliseren. Bovendien verdient het de voorkeur om de experimenten op een vast tijdstip uit te voeren na het coaten van de kolven en schotels. We raden aan om de gerechten een dag voor de cultuur vers te coaten. Langdurige incubatie van gerechten met het PDL-graanmengsel kan resulteren in diversiteit in de hoeveelheid van de aangehechte granen aan het gerecht.
Sommige aanpassingen van de hierboven beschreven techniek zijn mogelijk volgens de behoeften van de gekweekte cellen. Naast het vermogen om de groei van neurale cellen in cultuur te verbeteren, ondersteunen koraalskeletmatrices de groei van osteocyten30,31, hepatocyten en cardiomyocyten (ongepubliceerde gegevens). Om de duurzaamheid van de cultuur van andere celtypen te vergroten, wordt het aanbevolen om te controleren op de sterkste celreactie op skeletten van verschillende koraaltypen, evenals het optimaliseren van de grootte en dichtheid van de korrels.
Het is ook mogelijk om neurale cellen direct op de korrels te laten groeien, zonder extra coating. De voorcoating van de korrels met PDL, zoals vermeld in dit protocol (stap 5), verbetert echter sterk de hechting en overleving van de neurale cellen, boven de niveaus die worden verkregen met PDL-gecoat glas. Het is ook mogelijk om andere coatingmaterialen te gebruiken volgens de voorkeur van verschillende celtypen.
Het is vermeldenswaard dat de grootte van de korrels in de matrix beperkt is. Boven een bepaalde drempel, ongeveer 200 μm, wordt het moeilijk om ze aan de glazen afdekplaten te binden. Daarom heeft de ruwheid van het matrixoppervlak een eindig bereik. Experimenten waarbij grotere korrels of stukken skelet nodig zijn, zijn niet geschikt voor deze techniek. Men kan een alternatieve manier vinden om grotere korrels te hechten, misschien met behulp van lijmen of gels, maar dit kan het celcontact met de korrels verdoezelen. Een andere mogelijkheid is om de cellen direct op het skelet te kweken, zonder te malen. Deze methode vereist een wijziging van de celzaaiprocedure24,27. De 3D-structuur van het niet-gemalen koraalskelet draagt bij aan de overleving van neurale cellen, zoals we eerder meldden26. Zo'n complexe en dichte matrix maakt microscopie echter moeilijk. De gecompromitteerde opstelling van het grondskelet behoudt de chemische eigenschappen van het skelet, maakt 2D-microscopie-analyse mogelijk en dwingt de cellen vanwege de grote omvang van de korrels om in 3D8 te groeien.
Verder kan een teveel aan koraalskeletkorrels giftig zijn. Zoals hierboven vermeld, wordt de calciumcomponent van de koraalskeletmatrix geabsorbeerd door de cellen35. Calciumoverschot veroorzaakt door hoge korreldichtheid kan een last of zelfs remmend zijn voor sommige celtypen, zoals in het geval van neurale cellen36. Daarom kan een vermindering van de korreldichtheid nodig zijn en geoptimaliseerd voor elk celtype. Bovendien is het belangrijk om te onthouden dat de beschikbaarheid van koraalskeletten beperkt kan zijn. Koralen groeien langzaam in aquaria en in hun natuurlijke omgeving. Hun groei wordt verder belemmerd als gevolg van de opwarming van de aarde en de verzuring van de oceanen37. De redundantie en beschikbaarheid van koraalskeletten zijn dus beperkt.
De versterking van de gedissocieerde neurale cellen bij contact met koraalskeletkorrels in cultuur opent nieuwe wegen voor onderzoek in de neurobiologie. Cellulaire groei, neuritische extensie en vertakking, evenals synaptogenese en synaptische plasticiteit, kunnen worden bestudeerd met verhoogde intensiteit en verlengde experimentele duur.
Ook lijkt het erop dat de koraalmatrix een toename veroorzaakt van sommige cellulaire functies van de gliacellen, zoals groei, reactiviteit en proliferatie. Het is daarom mogelijk dat deze aandoeningen ook de astrocytische capaciteit verhogen om de gedissocieerde neurale cultuurmedia te verrijken met uitgescheiden trofische factoren, iets dat van toepassing kan zijn op regeneratieve geneeskunde van het centrale zenuwstelsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het KAMIN-programma van het Israëlische ministerie van Handel en Arbeid en door Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R.
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
