Summary
Диссоциированная культура клеток гиппокампа является ключевым экспериментальным инструментом в нейробиологии. Выживание и функция нервных клеток в культуре улучшаются, когда коралловые скелеты используются в качестве матриц из-за их нейропротекторной и нейромодулирующей роли. Следовательно, нервные клетки, выращенные на коралловом матриксе, демонстрируют более высокую прочность и, следовательно, более пригодны для культивирования.
Abstract
Культуры диссоциированных нейрональных и глиальных клеток гиппокампа являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию клеток и контролируемую среду. Однако выживание клеток гиппокампа in vitro находится под угрозой: большинство клеток умирают в течение первой недели культивирования. Поэтому большое значение имеет определение путей повышения долговечности нервных клеток в культуре.
Карбонат кальция в форме кристаллического арагонита, полученного из скелета кораллов, может быть использован в качестве превосходной, активной матрицы для нейронных культур. Питая, защищая и активируя глиальные клетки, коралловый скелет улучшает выживание и рост этих клеток in vitro лучше, чем другие матрицы.
Этот протокол описывает метод культивирования клеток гиппокампа на коралловой матрице. Эта матрица генерируется путем прикрепления зерен коралловых скелетов к культуральным чашкам, колбам и стеклянным покровным стеклам. Зерна помогают улучшить среду клеток, вводя их в тонкую трехмерную (3D) среду для роста и формирования тканеподобных структур. 3D-среда, введенная коралловым скелетом, может быть оптимизирована для клеток путем измельчения, что позволяет контролировать размер и плотность зерен (т.е. шероховатость матрицы), свойство, которое, как было установлено, влияет на активность глиальных клеток. Кроме того, использование зерен облегчает наблюдение и анализ культур, особенно при использовании световой микроскопии. Следовательно, протокол включает процедуры генерации и оптимизации коралловой матрицы в качестве инструмента для улучшения поддержания и функциональности нервных клеток in vitro.
Introduction
Культуры диссоциированных нервных клеток, в данном случае клеток гиппокампа, являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию и доступность клеток 1,2,3. Этот тип культуры часто используется в неврологии, разработке лекарств и тканевой инженерии из-за большого количества информации, которая может быть собрана, такой как скорость роста и жизнеспособности, нейротоксичность, рост нейритов и создание сетей, синаптическая связь и пластичность, морфологические модификации, организация и проводка нейритов и т. д.1,4,5,6,7.
Несмотря на значимость культур, культивируемые клетки обычно вынуждены расти на стеклянных покровных стеклах в двумерном монослое. Эти строгие изменения окружающей среды значительно снижают способность нервных клеток выживать с течением времени, поскольку стеклянные покровные стекла являются непитательными субстратами с низкой адгезионной прочностью, демонстрирующими меньшую способность поддерживать рост клеток 8,9,10,11.
Поскольку культивируемые нервные клетки вынуждены расти в сложных условиях, важным подходом к повышению их выживаемости было бы максимально возможное имитирование их естественной средыобитания 12,13. Это может быть достигнуто с помощью биоматериалов, которые будут действовать как матрицы и имитировать внеклеточный матрикс клеток, позволяя им формировать тканеподобную структуру и помогать в их питании14.
Использование биоматериалов является перспективным подходом в улучшении клеточных культур, поскольку они действуют как биосовместимые каркасы, обеспечивая механическую стабильность и усиливая различные свойства клеток, включая адгезию, выживаемость, пролиферацию, миграцию, морфогенез и дифференцировку15,16,17. Для улучшения состояния клеток in vitro используется несколько видов биоматериалов. Среди них есть биополимеры, или биологические компоненты, которые обычно входят в состав внеклеточного матрикса клеток. Эти биоматериалы в основном используются в виде полимеризованных покрывающих агентов или гидрогелей18,19,20. С одной стороны, упомянутые выше матрицы дают клеткам знакомую 3D-среду для роста, стимулируют их адгезию к тарелке и дают им механическую поддержку21,22. С другой стороны, их полимеризованная форма и удержание клеток в гидрогелях нарушают доступ клеток к питательным компонентам, присутствующим в питательных средах, а также затрудняют наблюдение за клетками микроскопическими методами23.
Коралловые экзоскелеты представляют собой биологические матрицы морского происхождения. Они изготовлены из карбоната кальция, обладают механической стабильностью и являются биоразлагаемыми. Предыдущие исследования с использованием кораллового скелета в качестве матрицы для выращивания нервных клеток в культуре показали гораздо большую адгезию по сравнению со стеклянными покровными стеклами24,25. Кроме того, нервные клетки, выращенные на скелете коралла, продемонстрировали свою способность поглощать кальций, из которого состоит скелет, который защищает нервные клетки в условиях дефицита питательных веществ26. Кроме того, коралловый скелет является поддерживающей и питающей матрицей, которая увеличивает выживаемость нервных клеток, стимулирует образование нейронных сетей, повышает скорость синаптической связи и позволяет формировать тканеподобные структуры27,28. Недавние исследования также показали, что топография поверхности матрицы кораллового скелета играет решающую роль в распределении и активации глиальных клеток 8,29. Кроме того, коралловый скелет эффективен в качестве матрицы для культивирования других типов клеток, таких как остеоциты30,31, гепатоциты и кардиомиоциты в культуре (неопубликованные данные).
Таким образом, скелет коралла является перспективной матрицей для культивирования клеток in vitro. Таким образом, протокол, подробно описанный ниже, описывает технику культивирования нервных клеток на коралловом скелете для получения более стабильных и процветающих нейронных культур, чем те, которые достигаются существующими методами. Этот протокол также может быть полезен для культивирования кардиомиоцитов, гепатоцитов и других типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных в этом протоколе было одобрено Национальным комитетом по уходу за животными и их использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скелеты кораллов, покрытые карбонатом кальция, следует использовать в кристаллической форме арагонита. Типы кораллов, протестированные до сих пор для нейронных культур, - это Porites Lutea, Stylophora pistillata и Trachyphyllia Geoffroyi. Скелеты можно приобрести целиком или наземно.
1. Очистка частей кораллового скелета
ВНИМАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять в химическом шкафу при комнатной температуре, поскольку описанные ниже растворы опасны и могут вызвать ожоги и раздражение.
- С помощью молотка разбейте скелет коралла и разделите его на фрагменты по 0,5–2 см. Чтобы растворить органические и неорганические остатки, замочите фрагменты скелета коралла в 10% растворе гипохлорита натрия на 10 мин, затем один раз промойте двойной дистиллированной водой (DDW).
- Чтобы удалить оставшиеся органические остатки, замочите фрагменты в растворе NaOH 1M на 5 минут, затем один раз промойте DDW. Продолжайте удаление органических отложений, замачивая фрагменты в 30% растворе H 2 O2в течение 10 минут, затем промойте фрагменты 3 раза DDW.
- Удалите как можно больше излишков DDW и оставьте фрагменты кораллов в капюшоне для высыхания (1–8 часов).
2. Очистка покровных стекол
- Переложите стеклянные покровные стекла в стеклянную чашку Петри диаметром 100 мм. Добавьте 10 мл 95% этанола в течение 15 мин.
- Удалите этанол и промойте DDW 3x, ожидая 10 минут между каждой стиркой. Поставьте блюдо на предварительно разогретую нагревательную пластину с температурой 80 °C, пока DDW не испарится. Аккуратно перемешайте покровные стекла на тарелке несколько раз во время сушки, чтобы они не прилипали друг к другу.
- Автоклавируйте покровные стекла.
3. Подготовка коралловых скелетных зерен
- Измельчите фрагменты кораллового скелета с помощью ступки и пестика (ручная шлифовка) до полного разрушения. В результате получается смесь зерен размером от 20 мкм до 200 мкм.
- В качестве альтернативы можно измельчить фрагменты кораллового скелета с помощью электрического шлифовального станка со скоростью 1000 об/мин в течение 30 с (длина лезвия = 6 см; ширина = 0,5–1,0 см). Результирующий размер зерна аналогичен размерному диапазону, полученному при ручном измельчении.
4. Очистка зерен определенного размерного ряда
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется контроль над размером зерен в матрице, используйте следующую процедуру очистки зерна на основе фильтрации.
- Перенесите зерна на ручной или электрический сетчатый фильтр размером 40 мкм.
- Разделите зерна на два конкретных диапазона, просеивая зерна через сетчатое фильтр (при использовании электрического ситечка рекомендуются следующие условия: встряхивание = 600 амплитуд / мин, подпрыгивание = 6 / с). В результате этой процедуры получаются две группы размеров зерна: одна <40 мкм, а вторая >40 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два размера могут быть определены с помощью сетчатых фильтров с различными ячейками. Если требуется более ограниченный диапазон, то повторно просейте каждую группу, начиная с шага 4.2, через сетчатые фильтры с различными сетками. - Автоклавируйте зерна.
5. Приготовление посуды с коралловым зернистым покрытием или покровных стекол
- Для покрытия колб, тарелок или чашек Петри
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять в стерильных условиях.- Добавьте зерна кораллового скелета в раствор поли-D-лизина (PDL) 20 мкг / мл, растворенный в растворе Хэнкса. Рекомендуемая концентрация составляет 5 мг/10 мг зерен на 1 мл раствора PDL.
- Раствор разлить по колбам и посуде (примерно 2 мл/25 см2 ) и выдержать в течение ночи при температуре 4 °C. Зерна опускаются и прикрепляются ко дну.
- На следующий день вымойте колбы и посуду один раз стерильным DDW. Дайте колбам и посуде высохнуть в вытяжке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать фляги и посуду со свежей оболочкой. Колбы и посуду с покрытием можно использовать в течение недели после нанесения покрытия, если они хранятся при температуре 4 °C. Однако эффективность матрицы может быть поставлена под угрозу.
- Покрытие стеклянных покровов (диаметр 12 мм, толщина 0,17 мм)
- Добавьте зерна кораллового скелета в DDW в любой желаемой концентрации. Общие плотности, используемые для нервных клеток, составляют 5 мг / мл и 10 мг / мл. Налейте 40 мкл зернового раствора на центр покровного стекла (рис. 4).
- Поместите покровные стекла на нагревательную плиту, предварительно разогретую до 80 °C, и дождитесь полного испарения (обычно 15 минут). В этих условиях зерна прилипают к покровному стеколю. Автоклав покровные стекла с покрытием. Хранить в стерильных условиях.
- За сутки до культивирования поместите покровные стекла на крышку стерильной 24-луночной пластины. Добавьте 100 мкл 20 мкг/мл раствора PDL к каждому покровному стеклу. Используйте наконечник, чтобы убедиться, что жидкость покрывает всю зерновую область и остальную поверхность покровного стекла.
- Накройте крышкой нижнюю часть тарелки. Оберните боковые стороны тарелок парафиновой пленкой. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
- На следующий день один раз постирайте с DDW и высушите в вытяжке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать свежепокрытые покровные стекла.
6. Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа на стеклянных покровных стеклах кораллового скелета с зернистым покрытием
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод культивирования диссоциированных клеток гиппокампа был модифицирован по сравнению с ранее опубликованными процедурами24,27. Описана подготовка культуры для четырех детенышей крысы. Ожидаемый выход из каждого гиппокампа составляет 1–1,5 х 106 клеток.
- Настройка
- Приготовьте пустую 60-миллиметровую чашку Петри. Налейте 2 мл минимально необходимой среды (MEM) в чашку Петри диаметром 60 мм и положите на лед.
- Налейте 2 мл МЭМ в посуду диаметром 35 мм и поставьте в инкубатор при температуре 37 °C, 5–10%CO2. Налейте 2 мл MEM в пробирку объемом 15 мл и держите ее при температуре 4 ° C.
- Налейте 1 мл First Day Medium в пробирку объемом 15 мл и поместите ее в инкубатор при температуре 37 °C, 5-10% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав Среды первого дня описан в Таблице материалов. - Разморозьте 200 мкл 2,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C.
- Подготовьте три стеклянные пипетки Пастера с головками диаметром 0,5 мм, 0,75 мм и 1,0 мм с помощью пламени.
- Подготовьте соответствующие хирургические инструменты: одни большие ножницы, два маленьких ножницы, один большой пинцет, четыре маленьких пинцета и один скальпель.
- Подготовьте стереомикроскоп в вытяжке.
- Используя большие ножницы, принесите в жертву 0–3-дневных детенышей крысы Sprague Dawley, отделив их головы от тела в пустую 60-миллиметровую чашку Петри (шаг 6.1.1). Утилизируйте тела.
- Поднимите головку, вынеся ее изо рта большим пинцетом. Срежьте кожей, покрывающую череп, маленькими ножницами.
- Чистыми ножницами войдите под череп (со стороны мозжечка) и разрежьте череп справа и слева, чтобы его можно было удалить. С помощью небольшого пинцета отделите череп от мозга.
- Чистым пинцетом отделите мозг от головы и поместите его в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 2 мл холодного MEM (см. шаг 6.1.2).
- С помощью двух маленьких пинцетов препарируйте гиппокамп под стереомикроскопом. Переложите гиппокамп в подготовленную 35-миллиметровую посуду (из шага 6.1.2), содержащую МЭМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6.3–6.6 следует повторять для каждого щенка. - Разрежьте гиппокамп примерно на 1 мм с помощью скальпеля. Добавляют 200 мкл раствора трипсина (разбавленного до конечной концентрации 0,25%). Аккуратно перемешать и инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2 в течение 30 мин.
- После инкубации добавьте 2 мл холодного МЭМ (этап 6.1.2) в чашку, чтобы дезактивировать трипсин. Перенесите трипсинизированную ткань в пробирку объемом 15 мл, содержащую 1 мл среды первого дня, предварительно нагретой до 37 °C (этап 6.1.3), с помощью стеклянной пипетки Пастера с наибольшим диаметром (этап 6.1.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшее соотношение среды и ткани (v: v) для дальнейшей обработки ткани составляет 1 мл / 8 гиппокамп. По возможности избегайте переноса среды с тканью. - Тритуруйте ткань, пропустив ее через стеклянную пипетку наибольшего диаметра 10–15 раз. Затем повторите этот процесс с помощью стеклянной пипетки со средним диаметром. Продолжайте растирание пипеткой наименьшего диаметра. Избегайте пузырей, чтобы уменьшить гибель клеток.
- Дайте оставшимся кусочкам ткани впитаться в течение 2–5 минут, затем перенесите надосадочную жидкость в другую пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная плотность клеток составляет 200 000–400 000 клеток/мл. Используйте First Day Medium для разбавления или центрифугирования в 470 x g для концентрации клеток. - Затравите 100 мкл клеток на каждое стекло. Во время посева обязательно покройте все покровное стекло ячейками. Инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2.
- На следующий день добавьте в лунки 500 мкл питательной среды для нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав питательной среды для нейронов описан в таблице материалов. - Аккуратно переложите каждое покровное стекло в соответствующее углубление с помощью пинцета, снимая средство первого дня, наклоняя покровное стекло. Отсосите оставшуюся среду от крышки.
- Инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2. Избегайте замены среды во время инкубации. Культуры можно выдерживать в этих условиях до 1 месяца. Основной проблемой является влажность. Поэтому следите за тем, чтобы инкубатор был максимально увлажнен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы подготовить матрицу кораллового скелета, весь коралловый скелет (рис. 1А) был разбит на фрагменты размером 0,5–2 см с помощью молотка (рис. 1В) и тщательно очищен от органических остатков в три этапа (шаг 1 в протоколе) с использованием 10% раствора гипохлорита, 1М раствора NaOH и 30% раствора H 2 O2(рис. 1C). Фрагменты кораллов были хорошо очищены, когда цвет скелета изменился с коричневого (рис. 1D) на белый (рис. 1E). Затем очищенные детали (рис. 2А) шлифовали либо с помощью ступки и пестика (рис. 2Б), либо с помощью электрического шлифовального станка (рис. 2В). Обе процедуры дали схожие результаты: смесь зерен размером от 20 мкм до 200 мкм (рис. 2D-G).
Одним из преимуществ зернистой матрицы по сравнению с растворимыми субстратами является то, что некоторые из ее структурных и физических свойств могут быть изменены, что делает ее более количественной. В этой матрице зерен кораллового скелета были изменены два свойства зерновой смеси: размер зерна и плотность зерна. Чтобы уменьшить разнообразие размеров 20–200 мкм, создаваемое описанной выше процедурой измельчения, был выбран подход просеивания с использованием фильтрующей сетки 40 мкм. С помощью ручных (рис. 3 A–D) или электрических (рис. 3E) сетчатых фильтров были получены два типа зерновых смесей: один с размерами зерен от 40 мкм до 200 мкм (рис. 3 F, H) и второй с размером 40 мкм или менее (рис. 3G, I). Плотность зерен, покрывающих покровные стекла и посуду, определялась простым нанесением различных количеств зерен и прикреплением их к покровным стеклам с помощью тепла (рис. 4C) или к колбам и посуде под действием силы тяжести (рис. 4H). Таким образом, были получены матрицы низкой (рис. 4 D, F, I) и высокой плотности (рис. 4E, G, J).
На рисунке 5 показаны результаты культивирования клеток гиппокампа на покровных стеклах, покрытых зернами кораллового скелета размером <40 мкм (10 мг/мл). Фазово-контрастные микрофотографии показывают, что клетки образовывали сложные нейронные сети в отсутствие (рис. 5А) и присутствии (рис. 5Б) матрицы. Окрашивание ядер клеток (рис. 5C, D) показало, что через 14 дней после посева плотность клеток на матрице была выше, чем на покровных стеклах без покрытия. Окрашивание микротрубочками, ассоциированным с белком 2 (MAP2), показало, что на матрице сформировалась сложная нейронная и дендритная сеть (рис. 5F) по сравнению с контролем (рис. 5E). Кроме того, глиальные клетки, выращенные на матрице кораллового скелета, визуализированной с помощью глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), претерпели значительные морфологические изменения. Они приобрели более острый вид с более длинными отростками, чем глиальные клетки, выращенные на контрольном субстрате, где они казались более круглыми и плоскими (рис. 5G, H).
Рисунок 1: Очистка кораллового скелета. (А) Скелет коралла Stylophora pistillata. (B) Разбитые фрагменты скелета перед очисткой. (C) Фрагменты из (B) после обработки раствором гипохлорита, гидроксидом натрия и перекисью водорода. (D) Увеличение неочищенного фрагмента, показанного в пункте (B). (E) Увеличение очищенного фрагмента, показанного в подпункте (C). Шкала: А = 20 мм; B,C = 10 мм; D,E = 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Шлифовка скелета коралла. А) Очищенные фрагменты скелета коралла. (B) Ступка и пестик, используемые для ручного измельчения. Красная стрелка указывает на получившиеся зерна. (C) Шлифовальный станок. Красная стрелка указывает на получившиеся зерна. (D) Зерна после ручного помола. (E) Зерна после механического измельчения. f) Расширение подпункта (D). g) Расширение подпункта (E). Шкала: А = 15 мм; D,E = 3 мм; F,G = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Контроль за размером зерна. (А-Д) Процедура ручного процеживания. (A) Использование сетчатого фильтра 40 мкм. (B) Ситечко с непроцеженными молотыми зернами, помещенными в пробирку объемом 50 мл и процеженными с помощью вихря. (C) Процеженные зерна размером <40 мкм на дне пробирки объемом 50 мл. (D) Зерна с минимальным размером, аналогичным размеру сетки (>40 мкм, желтая стрелка). (E) Механический сетчатый фильтр, используемый для отцеживания зерен размером <40 мкм из смеси зерен размером 20–200 мкм. (F) Демонстрация различных размеров зерна после измельчения перед процеживанием. (G) Демонстрация процеженных зерен <40 мкм. (H) Увеличение (F). i) Расширение подпункта (G). Шкала: F,G = 900 мкм; H,I = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Управление плотностью матрицы. (A) Центрифужная пробирка объемом 1,5 мл с зернами размером <40 мкм, разбавленными до 10 мг/мл DDW для покровных стекол, PDL для других блюд. (B) Стеклянное покровное стекло с 40 мкл раствора 10 мг/мл. (C) Покровные стекла с 40 мкл раствора 10 мг/мл, высушенные на горячей плите, предварительно нагретой до 80°С, что позволяет зернам прилипать к покровному стеклу. (D) Покровное стекло с покрытием с концентрацией зерна 5 мг/мл после испарения DDW. (E) Покровное стекло с покрытием с концентрацией зерна 10 мг/мл после испарения DDW. f) Расширение подпункта (D). g) Расширение подпункта (E). (H) Раствор 10 мг/мл в колбе Т-25, 60-миллиметровая пластина. (I) Покрытая оболочкой колба с зернами в концентрации 5 мг/мл. j) покрытая оболочкой с зернами в концентрации 10 мг/мл. Шкала: B, D, E, I, J = 3 мм; F,G = 600 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Культивирование нервных клеток гиппокампа на матрице кораллового скелета. На изображениях показаны клетки, извлеченные из гиппокампа детеныша крысы в возрасте от 0 до 3 дней, выращенные в культуре в течение 14 дней и окрашенные GFAP (красные глиальные клетки), MAP2 (зеленые, нейрональные сомы и дендриты), DAPI (синие, ядра клеток). (А) Фазово-контрастное изображение ячеек при отсутствии матрицы. (B) Фазово-контрастное изображение клеток, выращенных на матрице кораллового скелета. (C) Клетки, выращенные без матрицы, окрашенной DAPI. (D) Клетки, выращенные на матрице кораллового скелета, окрашенные DAPI. (E) Клетки, выращенные в отсутствие матрицы, окрашенной для MAP2. (F) Клетки, выращенные на матрице кораллового скелета, окрашенные для MAP2. (G) Клетки, выращенные без матрикса, окрашенного на GFAP. (H) Клетки, выращенные на матрице кораллового скелета, окрашенные для GFAP. (I) Объединенное изображение (C),(E),(G). (J) Объединенное изображение (D),(F),(H). Масштаб = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методика, представленная здесь, описывает способ улучшения поддержания и функциональности нервных клеток в культуре. Это достигается путем присоединения клеток к матрице из коралловых скелетных зерен, которая питает клетки и способствует их росту и активности. Использование этого метода увеличивает способность модели нейронной культуры имитировать среду клеток в головном мозге.
Введение матрицы в качестве культурального субстрата имеет ряд преимуществ по сравнению с другими субстратами, используемыми в классических методах культивирования нервных клеток. Во-первых, это увеличивает адгезию клеток. Комбинация кораллового скелета и PDL создает более сильную адгезию, чем стекло и PDL (не показано). Было показано, что такое увеличение адгезивности имеет важное значение для выживания адгезивных неплавающих клеток в культуре32. Во-вторых, кристаллы карбоната кальция в зернах скелета коралла являются источником ионов кальция, которые фактически поглощаются клетками. Весьма вероятно, что это является причиной повышенной прочности и повышенной плотности (рис. 5C,D) нервных клеток, демонстрируемых на матрице кораллового скелета, по сравнению с уровнем их выживаемости при ее отсутствии26.
Третье преимущество заключается в том, что матрица кораллового скелета на самом деле не плоская, в отличие от стеклянного покровного стекла. Зерна имеют 3D-структуру со сложной изогнутой архитектурой поверхности. Эти структурные свойства варьируются, если учесть, что клетки сталкиваются с популяциями зерен различной морфологии, размеров и плотности. Такое грубое и неплоское культуральное вещество лучше имитирует среду клеток in vivo, чем классическое плоское покровное стекло. Действительно, мы показали, что шероховатость, размер и морфология кораллового скелета влияют на распределение, выживание и активность клеток 8,26,29.
Более того, 3D-конфигурация, которую матрица кораллового скелета предоставляет клеткам в качестве микроокружения, в значительной степени отличается от обычных гидрогелевых матриц, используемых для 3D-роста in vitro. При использовании гидрогелей, таких как коллаген и гиалуроновая кислота, клетки встраиваются в гель23. Гель напоминает внеклеточный матрикс с точки зрения заполнения пространства, жесткости и других атрибутов, но из-за вязкости гелей эти культуры требуют сложных систем питания, чтобы клетки хорошо питались21,22. Напротив, 3D-зерна кораллового скелета позволяют клеткам занимать их поверхность, которая полностью открыта для питательной среды. Кроме того, в отличие от гидрогелевых культур, клетки на матрице кораллового скелета легко контролируются с помощью фазовой и флуоресцентной микроскопии.
Эта методика имеет ряд ограничений. Несмотря на перечисленные выше преимущества, коралловый скелет является биоматериалом и не может быть изготовлен, а собран из мертвых кораллов, что приводит к ограничению поставок матрицы, хотя некоторые из них доступны на коммерческой основе. Кроме того, использование скелетов нескольких видов кораллов может привести к изменениям в свойствах культуры. С другой стороны, тот факт, что все кристаллы кораллового скелета состоят из одного вещества, арагонита, и что размер зерен можно контролировать, устраняет большую часть химического и структурного разнообразия матриц. Зерна всех протестированных биоматериалов достаточно велики, чтобы заставить клетки расти в трех измерениях. Клетки взбираются на зерна8, растут, прикрепляясь к кончикам кристаллов33 и перекрещиваясь между зернами27. В качестве альтернативы геологический арагонит, состоящий из ископаемых отложений и синтетического карбоната кальция, коммерчески доступен и может использоваться в качестве матрицы. Тем не менее, он может демонстрировать более низкую адгезию к стеклянным покровным стеклам.
В связи с использованием нескольких видов кораллов важно отметить, что некоторые исследования показали признаки биоминерализации кораллов, что может привести к наличию разнообразных органических отложений среди кристаллов карбоната кальция. Они не могут быть удалены с помощью процесса очистки, описанного в этом протоколе33,34. Этот факт имеет решающее значение при идентификации биоматериала для биологических применений. В случае этого исследования ранее было выполнено несколько этапов для того, чтобы обеспечить максимально возможную однородность лесов. Во-первых, три типа кораллов были протестированы на матрицы: Porites Lutea, Stylophora Pistillata и Trachyphyllia Geoffroyi. Не было никаких существенных изменений с точки зрения роста и выживания нервных клеток на этих коралловых скелетах. Этот результат может указывать на то, что различные органические отложения в скелете не оказывают существенного влияния в данном случае. Во-вторых, инфракрасная спектроскопия чистого кораллового скелета с преобразованием Фурье показала отсутствие органических остатков29.
В рамках протокола есть несколько важных шагов, которые следует принять во внимание. Во-первых, при ручном просеивании зерен рекомендуется время от времени заменять ситечко, так как сетчатые фильтры имеют свойство засоряться. Электрический сетчатый фильтр использует большее усилие при просеивании. Таким образом, он не так легко засоряется. Во-вторых, при диспергировании смеси PDL-коралловых зерен на посуде и покровных стеклах важно часто пипетировать смесь, чтобы избежать утопления зерен. Это обеспечит однородную дисперсию раствора. Важно обратить внимание на процесс крепления зерен к покровным стеклам. Неправильная температура нагрева во время крепления зерна к стеклянному покровному стеколу, вибрации и другие факторы могут привести к отслоению зерна до или после посева клеток. Рекомендуется решить эту проблему, тщательно контролируя температуру и минимизируя вибрации. Кроме того, предпочтительно проводить эксперименты в установленное время после покрытия колб и посуды. Мы рекомендуем свеже покрыть посуду за сутки до культуры. Длительная инкубация посуды с PDL-зерновой смесью может привести к разнообразию количества прикрепленных зерен к блюду.
Некоторые модификации метода, описанного выше, возможны в соответствии с потребностями культивируемых клеток. В дополнение к своей способности улучшать рост нервных клеток в культуре, матрицы кораллового скелета поддерживают рост остеоцитов30,31, гепатоцитов и кардиомиоцитов (неопубликованные данные). Для повышения культуральной стойкости других типов клеток рекомендуется проверить наиболее сильную клеточную реакцию на скелеты разных типов кораллов, а также оптимизировать размер и плотность зерен.
Также возможно выращивание нервных клеток непосредственно на зернах, без дополнительного покрытия. Тем не менее, предварительное покрытие зерен PDL, как упоминается в этом протоколе (шаг 5), значительно улучшает адгезию и выживаемость нервных клеток по сравнению с уровнями, полученными со стеклом с покрытием PDL. Также возможно использование других материалов покрытия в соответствии с предпочтениями различных типов ячеек.
Стоит упомянуть, что размер зерен в матрице ограничен. Выше определенного порога, около 200 мкм, становится трудно привязать их к стеклянным покровным стеклам. Поэтому шероховатость поверхности матрицы имеет конечный диапазон. Эксперименты, требующие более крупных зерен или кусочков скелета, не подходят для этой техники. Можно найти альтернативный способ прикрепления более крупных зерен, возможно, с помощью клеев или гелей, но это может скрыть контакт клеток с зернами. Другая возможность заключается в культивировании клеток непосредственно на скелете, без измельчения. Этот метод требует модификации процедуры посева клеток24,27. 3D-структура негрунтового кораллового скелета действительно способствует выживанию нервных клеток, как мы сообщали до26. Однако такая сложная и плотная матрица затрудняет работу микроскопии. Скомпрометированная установка основного скелета сохраняет химические свойства скелета, позволяет проводить анализ 2D-микроскопии и из-за большого размера зерен заставляет клетки расти в 3D8.
Кроме того, избыток коралловых скелетных зерен может быть токсичным. Как упоминалось выше, кальциевый компонент матрицы кораллового скелета поглощается клетками35. Избыток кальция, вызванный высокой плотностью зерна, может быть обременением или даже ингибировать некоторые типы клеток, как в случае нервных клеток36. Следовательно, может потребоваться снижение плотности зерна и оптимизация для каждого типа ячеек. Кроме того, важно помнить, что доступность кораллового скелета может быть ограничена. Кораллы медленно растут в аквариумах и в естественной среде. Их рост еще больше замедляется в результате глобального потепления и закисления океана37. Таким образом, обилие и доступность коралловых скелетов ограничены.
Укрепление диссоциированных нервных клеток при контакте с зернами кораллового скелета в культуре открывает новые возможности для исследований в нейробиологии. Клеточный рост, расширение и разветвление нейритов, а также синаптогенез и синаптическая пластичность могут быть изучены с повышенной интенсивностью и длительной продолжительностью эксперимента.
Кроме того, похоже, что коралловый матрикс вызывает увеличение некоторых клеточных функций глиальных клеток, таких как рост, реактивность и пролиферация. Поэтому возможно, что эти условия также увеличивают астроцитарную способность обогащать диссоциированные среды нейронных культур секретируемыми трофическими факторами, что может быть применимо для регенеративной медицины центральной нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась программой KAMIN Министерства торговли и труда Израиля и компанией Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R.
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
