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Bioengineering

Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Ariel University

Summary

A cultura de células dissociadas do hipocampo é uma ferramenta experimental fundamental em neurociência. A sobrevivência e a função das células neurais em cultura são aumentadas quando esqueletos coralinos são usados como matrizes, devido ao seu papel neuroprotetor e neuromodulador. Assim, as células neurais cultivadas em matriz coralina apresentam maior durabilidade e, portanto, são mais adequadas para o cultivo.

Abstract

Culturas de células neuronais e gliais do hipocampo dissociadas são um modelo experimental valioso para estudar o crescimento e a função neural, proporcionando alto isolamento celular e um ambiente controlado. No entanto, a sobrevivência das células do hipocampo in vitro está comprometida: a maioria das células morre durante a primeira semana de cultivo. Portanto, é de grande importância identificar maneiras de aumentar a durabilidade das células neurais em cultura.

O carbonato de cálcio na forma de aragonita cristalina derivada do esqueleto de corais pode ser usado como uma matriz ativa superior para culturas neurais. Ao nutrir, proteger e ativar as células gliais, o esqueleto do coral aumenta a sobrevivência e o crescimento dessas células in vitro melhor do que outras matrizes.

Este protocolo descreve um método para cultivar células hipocampais em uma matriz coralina. Essa matriz é gerada pela fixação de grãos de esqueletos de corais em pratos de cultura, frascos e lamínulas de vidro. Os grãos ajudam a melhorar o ambiente das células, introduzindo-as em um ambiente tridimensional fino (3D) para crescer e formar estruturas semelhantes a tecidos. O ambiente 3D introduzido pelo esqueleto do coral pode ser otimizado para as células por moagem, o que permite o controle sobre o tamanho e a densidade dos grãos (ou seja, a rugosidade da matriz), uma propriedade que foi encontrada para influenciar a atividade das células gliais. Além disso, o uso de grãos facilita a observação e análise das culturas, principalmente quando se utiliza microscopia de luz. Assim, o protocolo inclui procedimentos para geração e otimização da matriz coralina como ferramenta para melhorar a manutenção e funcionalidade das células neurais in vitro.

Introduction

Culturas de células neurais dissociadas, neste caso células hipocampais, são um valioso modelo experimental para o estudo do crescimento e função neural, proporcionando alto isolamento celular e acessibilidade 1,2,3. Esse tipo de cultura é frequentemente utilizado em neurociências, desenvolvimento de fármacos e engenharia de tecidos devido à grande quantidade de informações que podem ser coletadas, tais como taxas de crescimento e viabilidade, neurotoxicidade, crescimento e rede de neuritos, conectividade e plasticidade sináptica, modificações morfológicas, organização e fiação de neuritos, etc.1,4,5,6,7.

Apesar da importância das culturas, as células cultivadas são geralmente forçadas a crescer sobre lamínulas de vidro em uma monocamada bidimensional. Essas modificações ambientais estritas diminuem significativamente a capacidade de sobrevivência das células neurais ao longo do tempo, pois as lamínulas de vidro são substratos não nutritivos com baixa força de adesão, exibindo menor capacidade de suportar o crescimento celular 8,9,10,11.

Como as células neurais cultivadas são forçadas a crescer em condições desafiadoras, uma abordagem essencial para aumentar sua sobrevivência seria imitar ao máximo seu ambiente natural12,13. Isso poderia ser obtido com o uso de biomateriais que atuarão como matrizes e mimetizarão a matriz extracelular das células, permitindo que elas formem uma estrutura semelhante a um tecido e auxiliem na sua nutrição14.

O uso de biomateriais é uma abordagem promissora no aprimoramento de culturas celulares, pois atuam como arcabouços biocompatíveis, proporcionando estabilidade mecânica e melhorando uma variedade de propriedades celulares, incluindo adesão, sobrevivência, proliferação, migração, morfogênese e diferenciação15,16,17. Vários tipos de biomateriais são utilizados para melhorar as condições das células in vitro. Entre eles estão os biopolímeros, ou componentes biológicos que geralmente fazem parte da matriz extracelular das células. Esses biomateriais são utilizados principalmente como forma de agentes polimerizados de revestimento ou hidrogéis18,19,20. Por um lado, as matrizes citadas acima conferem às células um ambiente 3D familiar para crescer, estimulam sua adesão ao prato e lhes dão suporte mecânico21,22. Por outro lado, sua forma polimerizada e o confinamento das células dentro de hidrogéis perturbam o acesso das células aos componentes nutritivos presentes nos meios de crescimento e também dificultam o acompanhamento das células por métodos microscópicos23.

Exoesqueletos de corais são matrizes biológicas de origem marinha. Eles são feitos de carbonato de cálcio, têm estabilidade mecânica e são biodegradáveis. Estudos prévios utilizando o esqueleto de coral como matriz para o crescimento de células neurais em cultura mostraram adesão muito maior, em comparação com lamínulas de vidro24,25. Além disso, células neurais cultivadas no esqueleto do coral demonstraram sua capacidade de ingerir o cálcio do esqueleto composto, o que protege as células neurais em condições de privação de nutrientes26. Além disso, o esqueleto do coral é uma matriz de suporte e nutrição que aumenta a sobrevivência das células neurais, estimula a formação de redes neurais, eleva a taxa de conectividade sináptica e possibilita a formação de estruturas semelhantes a tecidos27,28. Estudos recentes também têm demonstrado que a topografia superficial da matriz do esqueleto coral desempenha um papel crucial na distribuição e ativação das célulasgliais8,29. Além disso, o esqueleto de coral é eficaz como matriz para o cultivo de outros tipos celulares, como osteócitos30,31, hepatócitos e cardiomiócitos em cultura (dados não publicados).

Assim, o esqueleto de corais é uma matriz promissora para o cultivo de células in vitro. Assim, o protocolo detalhado a seguir descreve a técnica de cultivo de células neurais no esqueleto de corais para a produção de culturas neurais mais estáveis e prósperas do que aquelas alcançadas pelos métodos existentes. Esse protocolo também pode ser útil para o cultivo de cardiomiócitos, hepatócitos e outros tipos celulares.

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Protocol

O uso de animais neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais.

NOTA: Esqueletos de corais carbonatados com cálcio devem ser usados na forma cristalina de aragonita. Os tipos de corais testados até agora para culturas neurais são Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Os esqueletos podem ser comprados inteiros ou terrestres.

1. Limpeza das peças do esqueleto do coral

CUIDADO: As seguintes etapas devem ser realizadas em uma coifa química à temperatura ambiente, pois as soluções descritas abaixo são perigosas e podem causar queimaduras e irritações.

  1. Use um martelo para quebrar o esqueleto do coral e dividi-lo em fragmentos de 0,5 a 2 cm. Para dissolver resíduos orgânicos e não orgânicos, mergulhe os fragmentos do esqueleto do coral em solução de hipoclorito de sódio a 10% por 10 minutos e, em seguida, lave uma vez com água bidestilada (DDW).
  2. Para remover os resíduos orgânicos restantes, mergulhe os fragmentos em uma solução de NaOH 1M por 5 minutos e, em seguida, lave uma vez com DDW. Continue com a remoção dos depósitos orgânicos mergulhando os fragmentos em solução de 30% H 2 O2por 10 min, em seguida, lave os fragmentos 3x com DDW.
  3. Remova o máximo de DDW em excesso possível e deixe os fragmentos de coral no capô secar (1 a 8 h).

2. Limpeza das tampas de vidro

  1. Transfira as lamínulas de vidro para uma placa de Petri de vidro de 100 mm. Adicionar 10 mL de etanol 95% por 15 min.
  2. Retire o etanol e lave com DDW 3x, aguardando 10 min entre cada lavagem. Coloque o prato numa placa de aquecimento pré-aquecida a 80 °C até evaporar o DDW. Mexa suavemente as tampas dentro do prato várias vezes durante a secagem para evitar que grudem umas nas outras.
  3. Autoclave as lamínulas.

3. Preparação de grãos de esqueleto de coral

  1. Triture os fragmentos do esqueleto do coral usando uma argamassa e pilão (moagem manual) até a completa quebra. O resultado é uma mistura de grãos com tamanhos que variam de 20 μm a 200 μm.
  2. Alternativamente, triture os fragmentos do esqueleto do coral usando uma máquina de moagem elétrica a uma velocidade de 1.000 rpm por 30 s (comprimento da lâmina = 6 cm; largura = 0,5 cm – 1,0 cm). O tamanho de grão resultante é semelhante à faixa de tamanho produzida pela moagem manual.

4. Purificação de grãos de uma faixa de tamanho específica

NOTA: Se o controle sobre o tamanho dos grãos em uma matriz for desejado, use o seguinte procedimento de purificação de grãos baseado em filtração.

  1. Transfira os grãos para um filtro de malha filtrante manual ou elétrico de 40 μm.
  2. Divida os grãos em duas faixas específicas, peneirando os grãos através do filtro (se estiver usando um filtro elétrico, as seguintes condições são recomendadas: agitação = 600 amplitudes/min, salto = 6/s). Este procedimento produz dois grupos de tamanhos de grãos, um <40 μm e o segundo >40 μm.
    NOTA: Os dois tamanhos podem ser determinados usando filtros de malhas variadas. Se um intervalo mais restrito for desejado, então peneire novamente cada grupo da etapa 4.2 através de filtros com malhas diferentes.
  3. Autoclave os grãos.

5. Preparação de pratos ou lamínulas revestidas com grãos de coral

  1. Para revestimento de frascos, placas ou placas de Petri
    NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em condições estéreis.
    1. Adicionar os grãos do esqueleto do coral em uma solução de poli-D-lisina (PDL) de 20 μg/mL dissolvida em solução de Hanks. A concentração recomendada é de 5 mg/10 mg de grãos por 1 mL de solução de PDL.
    2. Deite a solução em frascos e pratos (aproximadamente 2 ml/25 cm2) e incube durante a noite a 4 °C. Os grãos afundam e se prendem ao fundo.
    3. No dia seguinte, lave os frascos e pratos uma vez com DDW estéril. Deixe os frascos e pratos secarem no capô.
      NOTA: É preferível usar frascos e pratos recém-revestidos. Os frascos e pratos revestidos podem ser utilizados até uma semana após o revestimento, se conservados a 4 °C. No entanto, a eficácia da matriz pode estar comprometida.
  2. Revestimento de lamínulas de vidro (12 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura)
    1. Adicione grãos de esqueleto de coral ao DDW em qualquer concentração desejada. As densidades comuns usadas para células neurais são 5 mg/mL e 10 mg/mL. Despeje 40 μL da solução de grão sobre o centro da lamínula (Figura 4).
    2. Coloque as lamínulas numa placa de aquecimento pré-aquecida a 80 °C e aguarde a evaporação completa (normalmente 15 min). Nessas condições, os grãos aderem à lamínula. Autoclave as lamínulas revestidas. Armazenar em condições estéreis.
    3. Um dia antes da cultura, coloque as tampas na tampa de uma placa estéril de 24 poços. Adicionar 100 μL de 20 μg/ml de solução de PDL a cada lamínula. Use a ponta para garantir que o líquido cubra toda a região do grão e o restante da superfície da tampa.
    4. Cubra a tampa com o fundo da placa. Embrulhe as laterais das placas com filme de parafina. Incubar durante a noite a 4 °C.
    5. No dia seguinte, lave uma vez com DDW e seque no capô.
      NOTA: É preferível usar lamínulas recém-revestidas.

6. Cultivo de células dissociadas do hipocampo em lamínulas de vidro revestidas com grãos de esqueleto de coral

OBS: O método para cultura de células dissociadas do hipocampo foi modificado a partir de procedimentos previamentepublicados24,27. O preparo da cultura é descrito para quatro filhotes de ratos. O rendimento esperado de cada hipocampo é de 1–1,5 x 106 células.

  1. Configuração
    1. Prepare uma placa de Petri de 60 mm vazia. Despeje 2 mL de meio essencial mínimo (MEM) em uma placa de Petri de 60 mm e coloque gelo.
    2. Despeje 2 mL de MEM em uma placa de 35 mm e coloque-o em uma incubadora a 37 °C, 5–10% CO2. Deite 2 ml de MEM num tubo de 15 ml e mantenha-o a 4 °C.
    3. Despeje 1 mL de meio de primeiro dia em um tubo de 15 mL e coloque-o em uma incubadora a 37 °C, 5-10% CO2.
      NOTA: A composição do Meio do Primeiro Dia está descrita na Tabela de Materiais.
    4. Descongelar 200 μL de uma solução de tripsina a 2,5% e incubar a 37 °C.
    5. Prepare três pipetas de vidro Pasteur com cabeças de 0,5 mm, 0,75 mm e 1,0 mm de diâmetro usando uma chama.
    6. Prepare ferramentas cirúrgicas adequadas: uma tesoura grande, duas tesouras pequenas, um tweezer grande, quatro pinças pequenas e um bisturi.
    7. Prepare um estereomicroscópio no capô.
  2. Usando uma tesoura grande, sacrifique filhotes de ratos Sprague Dawley de 0 a 3 dias separando suas cabeças de seus corpos em uma placa de Petri vazia de 60 mm (passo 6.1.1). Descarte os corpos.
  3. Pegue a cabeça segurando-a da boca com um grande tweezer. Corte a pele que cobre o crânio com uma pequena tesoura.
  4. Com uma tesoura limpa, entre por baixo do crânio (do lado do cerebelo) e corte o crânio à direita e à esquerda para permitir sua remoção. Usando um pequeno tweezer, descasque o crânio do cérebro.
  5. Com um tweezer limpo, separe o cérebro da cabeça e coloque-o numa placa de Petri de 60 mm contendo 2 ml de MEM frio (ver passo 6.1.2).
  6. Usando duas pinças pequenas, disseque os hipocampos sob um estereomicroscópio. Transferir os hipocampos para o prato preparado de 35 mm (a partir do passo 6.1.2) contendo MEM.
    NOTA: As etapas 6.3–6.6 devem ser repetidas para cada filhote.
  7. Cortar os hipocampos em fatias de aproximadamente 1 mm com o bisturi. Adicionar 200 μL da solução de tripsina (diluída até uma concentração final de 0,25%). Misture delicadamente e incube a 37 °C, 5–10% CO2 durante 30 min.
  8. Após a incubação, adicionar 2 ml de MEM frio (passo 6.1.2) à placa para desativar a tripsina. Transferir o tecido tripsinizado para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio do primeiro dia pré-aquecido a 37 °C (passo 6.1.3) utilizando a pipeta de vidro Pasteur de maior diâmetro (passo 6.1.5).
    NOTA: A melhor relação meio/tecido (v:v) para processamento posterior do tecido é de 1 mL/8 hipocampos. Evite ao máximo transferir o meio com o tecido.
  9. Triture o tecido passando-o através da pipeta de vidro de maior diâmetro 10 a 15 vezes. Em seguida, repita esse processo usando a pipeta de vidro com o diâmetro médio. Continue triturando com a pipeta de menor diâmetro. Evite borbulhar para reduzir a morte celular.
  10. Deixe os pedaços de tecido restantes afundarem por 2 a 5 minutos e, em seguida, transfira o sobrenadante para outro tubo de 15 mL. Conte as células usando um hemocitômetro.
    NOTA: A densidade celular preferencial é de 200.000 a 400.000 células/mL. Use o meio do primeiro dia para diluir ou centrifugação a 470 x g para concentrar as células.
  11. Semear 100 μL de células em cada lamínula de vidro. Durante a semeadura, certifique-se de cobrir toda a tampa com células. Incubar a 37 °C, 5–10% CO2.
  12. No dia seguinte, adicione 500 μL de Meio de Crescimento Neuronal aos poços.
    NOTA: A composição do meio de crescimento neuronal está descrita na Tabela de Materiais.
  13. Transfira suavemente cada lamínula para o poço apropriado usando uma pinça enquanto remove o meio do primeiro dia, inclinando a lamínula. Sucção do meio restante da tampa.
  14. Incubar a 37 °C, 5–10% CO2. Evite substituir o meio durante toda a incubação. As culturas podem ser mantidas nessas condições até 1 mês. A maior preocupação é a umidade. Portanto, certifique-se de manter a incubadora ao máximo umidificada.

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Representative Results

Para preparar a matriz do esqueleto do coral, todo o esqueleto do coral (Figura 1A) foi quebrado em fragmentos de 0,5 a 2 cm com martelo (Figura 1B) e completamente limpo dos resíduos orgânicos em três etapas (etapa 1 do protocolo) com solução de hipoclorito a 10%, solução de NaOH 1M e solução de H 2 O2 a 30% (Figura 1C). Os fragmentos de corais foram bem limpos quando a cor do esqueleto mudou de marrom (Figura 1D) para branco (Figura 1E). Em seguida, as peças limpas (Figura 2A) foram trituradas com argamassa e pilão (Figura 2B) ou retificadora elétrica (Figura 2C). Ambos os procedimentos produziram resultados semelhantes: uma mistura de grãos variando entre 20 μm e 200 μm de tamanho (Figura 2D-G).

Uma das vantagens da matriz granulada sobre substratos solúveis é que várias de suas propriedades estruturais e físicas podem ser modificadas, tornando-a mais quantitativa. Nesta matriz de grãos do esqueleto de coral, duas das propriedades da mistura de grãos foram manipuladas: tamanho e densidade de grãos. Para reduzir a diversidade de tamanho de 20 μm a 200 μm gerada pelo procedimento de moagem acima, uma abordagem de peneiramento usando uma malha filtrante de 40 μm foi escolhida. Utilizando filtros manuais (Figura 3 A–D) ou elétricos (Figura 3E), foram produzidos dois tipos de misturas de grãos: um com grãos variando de 40 μm a 200 μm (Figura 3 F,H) e o segundo com tamanho igual ou inferior a 40 μm (Figura 3G,I). A densidade dos grãos que revestiam as lamínulas e placas foi determinada simplesmente aplicando-se quantidades variáveis de grãos e fixando-os às lamínulas pelo calor (Figura 4C) ou aos frascos e placas por gravidade (Figura 4H). Dessa forma, matrizes de baixa (Figura 4 D,F,I) e altas densidades (Figura 4E,G,J) foram produzidas.

A Figura 5 demonstra o resultado do cultivo de células hipocampais em lamínulas revestidas com grãos de esqueleto de coral de <40 μm (10 mg/mL). Micrografias de contraste de fase mostram que as células formaram redes neurais complexas na ausência (Figura 5A) e presença (Figura 5B) da matriz. A coloração dos núcleos celulares (Figura 5C,D) indicou que, 14 dias após a semeadura, a densidade celular foi maior na matriz do que nas lamínulas não revestidas. A coloração com proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2) mostrou que uma complexa rede neuronal e dendrítica se formou na matriz (Figura 5F) em comparação com o controle (Figura 5E). Além disso, as células gliais cultivadas na matriz do esqueleto coral visualizadas pela proteína glial fibrilar ácida (GFAP) sofreram alterações morfológicas significativas. Adquiriram uma aparência mais picante com processos mais longos do que as células gliais cultivadas no substrato controle, onde apareceram mais arredondadas e planas (Figura 5G,H).

Figure 1
Figura 1: Limpeza do esqueleto do coral. (A) O esqueleto do coral Stylophora pistillata. (B) Fragmentos quebrados do esqueleto antes da limpeza. (C) Os fragmentos de (B) após tratamento com solução de hipoclorito, hidróxido de sódio e peróxido de hidrogênio. (D) Ampliação do fragmento não limpo mostrado em (B). (E) Ampliação do fragmento limpo mostrado em (C). Escala: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Trituração do esqueleto do coral. (A) Fragmentos de esqueleto de coral limpos. (B) Argamassa e pilão utilizados para moagem manual. A seta vermelha aponta para os grãos resultantes. (C) Retífica. A seta vermelha aponta para os grãos resultantes. (D) Grãos após moagem manual. (E) Grãos após moagem mecânica. f) Alargamento da alínea d). g) Alargamento da alínea e). Escala: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Controle sobre o tamanho de grão. (A-D) Procedimento de esforço manual. (A) Usando filtro de 40 μm. (B) Coador com grãos moídos não coados colocados em um tubo de 50 mL e coado usando um vórtice. (C) Grãos coados de <40 μm no fundo do tubo de 50 mL. (D) Grãos com tamanho mínimo semelhante ao da malha (>40 μm, seta amarela). (E) Filtro mecânico usado para coar grãos de <40 μm a partir de uma mistura de grãos de 20 μm a 200 μm de tamanho. (F) Demonstração de diversos tamanhos de grãos após a moagem antes do coamento. (G) Demonstração de grãos coados <40 μm. (H) Ampliação de (F). i) Alargamento da alínea g). Escala: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Controle da densidade da matriz. (A) Um tubo de centrífuga de 1,5 mL com grãos de <40 μm diluídos a 10 mg/mL com DDW para lamínulas, PDL para outras pratos. (B) Tampa de vidro com 40 μL de solução de 10 mg/mL. (C) Lamínulas com secagem de 40 μL de solução de 10 mg/mL em placa quente pré-aquecida a 80 °C, permitindo a aderência dos grãos à lamínula. (D) Revestimento com concentração de grãos de 5 mg/mL após evaporação do DDW. (E) Revestimento com concentração de grãos de 10 mg/mL após evaporação do DDW. f) Alargamento da alínea d). g) Alargamento da alínea e). (H) Solução de 10 mg/mL em balão T-25, placa de 60 mm. (I) Balão revestido com grãos na concentração de 5 mg/mL. (J) Balão revestido com grãos na concentração de 10 mg/mL. Escala: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Cultivo de células neurais hipocampais na matriz do esqueleto do coral. As imagens mostram células extraídas de hipocampos de 0 a 3 dias de idade de filhotes de ratos cultivadas em cultura por 14 dias e coradas com GFAP (vermelho, células gliais), MAP2 (verde, somas neuronais e dendritos), DAPI (azul, núcleos celulares). (A) Imagem de contraste de fase das células na ausência da matriz. (B) Imagem de contraste de fase de células cultivadas na matriz do esqueleto de coral. (C) Células cultivadas sem matriz coradas com DAPI. (D) Células cultivadas na matriz do esqueleto do coral coradas com DAPI. (E) Células crescidas na ausência da matriz corada para MAP2. (F) Células cultivadas na matriz do esqueleto do coral coradas para MAP2. (G) Células cultivadas sem matriz coradas para GFAP. (H) Células cultivadas na matriz do esqueleto do coral coradas para GFAP. (I) Imagem mesclada de (C),(E),(G). (J) Imagem mesclada de (D),(F),(H). Escala = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica aqui apresentada descreve uma maneira de melhorar a manutenção e funcionalidade de células neurais em cultura. Isto é conseguido através da adesão das células a uma matriz feita de grãos de esqueleto de coral que nutre as células e promove o seu crescimento e atividade. O uso dessa técnica aumenta a capacidade do modelo de cultura neural de imitar o ambiente das células no cérebro.

A introdução da matriz como substrato de cultura apresenta diversas vantagens sobre outros substratos utilizados nos métodos clássicos de cultura de células neurais. Primeiro, aumenta a adesão celular. A combinação de esqueleto de coral e PDL gera uma adesividade mais forte do que vidro e PDL (não mostrado). Este aumento da adesividade tem se mostrado essencial para a sobrevivência de células aderentes não flutuantes emcultura32. Em segundo lugar, os cristais carbonatados de cálcio dos grãos do esqueleto do coral são uma fonte de íons de cálcio que são realmente absorvidos pelas células. É altamente provável que esta seja a razão para maior durabilidade e aumento da densidade (Figura 5C,D) das células neurais exibidas na matriz do esqueleto do coral, em comparação com seu nível de sobrevivência na sua ausência26.

Uma terceira vantagem reside no fato de que a matriz do esqueleto do coral é, na verdade, não plana, ao contrário da cobertura de vidro. Os grãos são estruturados em 3D com uma arquitetura de superfície complexa e curva. Essas propriedades estruturais variam quando se considera que as células enfrentam populações de grãos de morfologias, dimensões e densidades variadas. Essa substância de cultura áspera e não planar imita melhor o ambiente das células in vivo do que a clássica lamínula plana. De fato, mostramos que a rugosidade, o tamanho e a morfologia do esqueleto coral afetam a distribuição, a sobrevivência e a atividade das células8,26,29.

Além disso, a configuração 3D que uma matriz de esqueleto de coral fornece às células como um microambiente difere principalmente das matrizes de hidrogel convencionais usadas para o crescimento 3D in vitro. Com o uso de hidrogéis, como colágeno e ácido hialurônico, as células ficam embutidas no gel23. O gel assemelha-se à matriz extracelular em termos de preenchimento espacial, rigidez e outros atributos, mas devido à viscosidade dos géis, essas culturas demandam sistemas de alimentação complicados para manter as células bem nutridas21,22. Por outro lado, os grãos 3D do esqueleto do coral permitem que as células ocupem sua superfície, que é completamente aberta ao meio de cultura. Além disso, em contraste com as culturas de hidrogel, as células na matriz do esqueleto do coral são prontamente monitoradas através de microscopia de fase e fluorescente.

Esta técnica tem várias limitações. Apesar das vantagens listadas acima, o esqueleto de corais é um biomaterial e não pode ser fabricado, mas coletado de corais mortos, causando limitações no suprimento de matrizes, embora algumas estejam disponíveis comercialmente. Além disso, o uso de esqueletos de múltiplas espécies de corais pode introduzir variações nas propriedades de cultura. Por outro lado, o fato de que os cristais do esqueleto dos corais são todos feitos de uma substância, a aragonita, e que o tamanho dos grãos pode ser controlado, elimina a maior parte da diversidade química e estrutural entre as matrizes. Os grãos de todos os biomateriais testados são grandes o suficiente para forçar as células a crescer tridimensionalmente. As células sobem nos grãos8, crescem fixando-se às pontas dos cristais33 e cruzam entre os grãos27. Alternativamente, a aragonita geológica, feita de sedimentos fósseis e carbonato de cálcio sintético, está comercialmente disponível e pode ser usada como matriz. No entanto, pode apresentar menor aderência às lamínulas de vidro.

Tendo em vista a utilização de múltiplas espécies de corais, é importante ressaltar que alguns estudos têm mostrado evidências de biomineralização dos corais, o que pode levar à presença de diversos depósitos orgânicos entre os cristais de carbonato de cálcio. Estes não podem ser removidos pelo processo de limpeza descrito neste protocolo33,34. Este fato é de fundamental importância na identificação de um biomaterial para aplicações biológicas. No caso deste estudo, várias etapas foram realizadas previamente, a fim de garantir o máximo de homogeneidade possível do arcabouço. Primeiramente, três tipos de corais foram testados quanto às matrizes: Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Não houve mudanças significativas em termos de crescimento e sobrevivência de células neurais nesses esqueletos de coral. Este resultado pode indicar que diferentes depósitos orgânicos dentro do esqueleto não são de uma influência significativa neste caso. Em segundo lugar, a espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier do esqueleto limpo dos corais mostrou a ausência de resíduos orgânicos29.

Existem algumas etapas críticas dentro do protocolo que devem ser levadas em consideração. Primeiro, ao peneirar manualmente os grãos, recomenda-se substituir o filtro de tempos em tempos, pois os coadores tendem a entupir. O filtro elétrico usa maior força durante o peneiramento. Assim, não tende a entupir tão facilmente. Em segundo lugar, ao dispersar a mistura de grãos PDL-coral nos pratos e lamínulas, é importante pipetar frequentemente a mistura para evitar o afundamento dos grãos. Isso garantirá uma dispersão homogênea da solução. É importante prestar atenção ao processo de fixação dos grãos às lamínulas. Temperaturas de aquecimento incorretas durante a fixação do grão à tampa de vidro, vibrações e outros fatores podem fazer com que os grãos se desprenda antes ou depois da semeadura celular. Recomenda-se resolver este problema controlando cuidadosamente a temperatura e minimizando as vibrações. Além disso, é preferível realizar os experimentos em um horário determinado após o revestimento dos frascos e pratos. Recomendamos revestir os pratos na hora um dia antes da cultura. A incubação prolongada dos pratos com a mistura PDL-grãos pode resultar em diversidade na quantidade de grãos anexados ao prato.

Algumas modificações da técnica descrita acima são possíveis de acordo com as necessidades das células cultivadas. Além de sua capacidade de melhorar o crescimento de células neurais em cultura, matrizes de esqueleto de coral suportam o crescimento de osteócitos30,31, hepatócitos e cardiomiócitos (dados não publicados). Para aumentar a durabilidade da cultura de outros tipos celulares, recomenda-se verificar a reação celular mais forte a esqueletos de diferentes tipos de corais, bem como otimizar o tamanho e a densidade dos grãos.

Também é possível cultivar células neurais diretamente nos grãos, sem revestimento adicional. Entretanto, o pré-revestimento dos grãos com PDL, como citado neste protocolo (etapa 5), melhora sobremaneira a adesão e sobrevivência das células neurais, acima dos níveis obtidos com vidro revestido com PDL. Também é possível utilizar outros materiais de revestimento de acordo com a preferência dos diferentes tipos celulares.

Vale ressaltar que o tamanho dos grãos na matriz é limitado. Acima de um certo limiar, cerca de 200 μm, torna-se difícil prendê-los às lamínulas de vidro. Portanto, a rugosidade da superfície da matriz tem uma faixa finita. Experimentos que exigem grãos maiores ou pedaços de esqueleto não são adequados para essa técnica. Pode-se encontrar uma maneira alternativa de fixar grãos maiores, talvez usando colas ou géis, mas isso pode obscurecer o contato da célula com os grãos. Outra possibilidade é cultivar as células diretamente no esqueleto, sem moagem. Este método requer uma modificação do procedimento de semeadura celular24,27. A estrutura 3D do esqueleto de coral não terrestre contribui para a sobrevivência das células neurais, como relatamos anteriormente26. No entanto, uma matriz tão complexa e densa dificulta o trabalho da microscopia. A configuração comprometida do esqueleto terrestre preserva as propriedades químicas do esqueleto, permite a análise de microscopia 2D e, devido ao grande tamanho dos grãos, força as células a crescer em 3D8.

Além disso, um excesso de grãos de esqueleto de coral pode ser tóxico. Como mencionado acima, o componente cálcio da matriz do esqueleto coral é absorvido pelas células35. O excesso de cálcio causado pela alta densidade de grãos pode ser um fardo ou mesmo inibitório para alguns tipos celulares, como no caso das células neurais36. Portanto, uma redução da densidade de grãos pode ser necessária e otimizada para cada tipo celular. Além disso, é importante lembrar que a disponibilidade de esqueletos de corais pode ser limitada. Os corais crescem lentamente em aquários e em seu ambiente natural. Seu crescimento é ainda mais atrofiado como resultado do aquecimento global e da acidificação dos oceanos37. Assim, a abundância e a disponibilidade de esqueletos de corais são limitadas.

O fortalecimento das células neurais dissociadas quando em contato com grãos de esqueleto de coral em cultura abre novos caminhos para pesquisas em neurobiologia. O crescimento celular, a extensão e ramificação neurítica, bem como a sinaptogênese e a plasticidade sináptica, podem ser estudados com maior intensidade e duração experimental prolongada.

Além disso, parece que a matriz coralina causa um aumento em algumas das funções celulares das células gliais, como crescimento, reatividade e proliferação. Portanto, é possível que essas condições também aumentem a capacidade astrocitária de enriquecer os meios de cultura neural dissociados com fatores tróficos secretados, algo que pode ser de aplicabilidade para a medicina regenerativa do sistema nervoso central.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo programa KAMIN do Ministério do Comércio e Trabalho de Israel e pela Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, EUA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Greiner #60-662160
B-27 Gibco #17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma #A4503
D – glucose Sigma #G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) Sigma #D5796
Electrical sieve Ari Levy #3700
Fetal Bovine Serun (FBS) Biological Industries #04-007-1A
First Day Medium 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks Greiner #60-690160 25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine Sigma #F0503
Glass Coverslips Menzel-Glaser #BNCB00120RA1
H2O2 Romical #007130-72-19 Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture Sigma #N4888
HANK'S solution Sigma #H6648
Kynurenic acid Sigma #K3375
L - glutamine Sigma #G7513
Manual strainer (40µm) VWR #10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM) Sigma #M2279
Mortar and pestle De-Groot 4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite) Sigma #425044 Hazardous
NaOH Sigma #S8045 Hazardous
Neuronal Growth Medium 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish Greiner #60-628160, #60-627160 60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine Sigma #P7280
Smart Dentin Grinder KometaBio #GR101
Trypsin Gibco #15-090-046
Uridine Sigma #U3750

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References

  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

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Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa
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Weiss, O. E., Hendler, R. M., Baranes, D. Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix. J. Vis. Exp. (160), e60443, doi:10.3791/60443 (2020).

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