Summary
La coltura cellulare ippocampale dissociata è uno strumento sperimentale fondamentale nelle neuroscienze. La sopravvivenza e la funzione delle cellule neurali in coltura sono migliorate quando gli scheletri corallini sono usati come matrici, a causa dei loro ruoli neuroprotettivi e neuromodulativi. Quindi, le cellule neurali cresciute sulla matrice corallina mostrano una maggiore durata e quindi sono più adeguate per la coltivazione.
Abstract
Le colture di cellule neuronali e gliali dissociate dell'ippocampo sono un prezioso modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e un ambiente controllato. Tuttavia, la sopravvivenza delle cellule ippocampali in vitro è compromessa: la maggior parte delle cellule muore durante la prima settimana di coltura. È quindi di grande importanza identificare modi per aumentare la durata delle cellule neurali in coltura.
Il carbonato di calcio sotto forma di aragonite cristallina derivata dallo scheletro dei coralli può essere utilizzato come matrice attiva superiore per colture neurali. Nutrendo, proteggendo e attivando le cellule gliali, lo scheletro di corallo migliora la sopravvivenza e la crescita di queste cellule in vitro meglio di altre matrici.
Questo protocollo descrive un metodo per coltivare cellule ippocampali su una matrice corallina. Questa matrice viene generata attaccando granelli di scheletri di corallo a piatti di coltura, fiaschi e vetrine. I grani aiutano a migliorare l'ambiente delle cellule introducendole in un ambiente tridimensionale (3D) per crescere e formare strutture simili ai tessuti. L'ambiente 3D introdotto dallo scheletro di corallo può essere ottimizzato per le cellule mediante macinazione, che consente il controllo sulla dimensione e la densità dei grani (cioè la rugosità della matrice), una proprietà che è stata trovata per influenzare l'attività delle cellule gliali. Inoltre, l'uso dei grani facilita l'osservazione e l'analisi delle colture, soprattutto quando si utilizza la microscopia ottica. Quindi, il protocollo include procedure per la generazione e l'ottimizzazione della matrice corallina come strumento per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in vitro.
Introduction
Le colture di cellule neurali dissociate, in questo caso cellule ippocampali, sono un valido modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e accessibilità 1,2,3. Questo tipo di coltura è frequentemente utilizzato nelle neuroscienze, nello sviluppo di farmaci e nell'ingegneria tissutale a causa della grande quantità di informazioni che possono essere raccolte, come tassi di crescita e vitalità, neurotossicità, crescita e networking dei neuriti, connettività sinaptica e plasticità, modifiche morfologiche, organizzazione e cablaggio dei neuriti, ecc.1,4,5,6,7.
Nonostante l'importanza delle colture, le cellule coltivate sono solitamente costrette a crescere su vetrini in un monostrato bidimensionale. Queste rigide modifiche ambientali riducono significativamente la capacità delle cellule neurali di sopravvivere nel tempo, perché i vetrini di copertura sono substrati non nutritivi con una bassa forza di adesione, esibendo una minore capacità di sostenere la crescita cellulare 8,9,10,11.
Poiché le cellule neurali coltivate sono costrette a crescere in condizioni difficili, un approccio essenziale per migliorare la loro sopravvivenza sarebbe quello di imitare il loro ambiente naturale il più possibile12,13. Ciò potrebbe essere ottenuto utilizzando biomateriali che agiranno come matrici e imiteranno la matrice extracellulare delle cellule, consentendo loro di formare una struttura simile a un tessuto e assistere nel loro nutrimento14.
L'uso di biomateriali è un approccio promettente per migliorare le colture cellulari, perché agiscono come scaffold biocompatibili, fornendo stabilità meccanica e migliorando una varietà di proprietà cellulari, tra cui adesione, sopravvivenza, proliferazione, migrazione, morfogenesi e differenziazione15,16,17. Diversi tipi di biomateriali sono utilizzati per migliorare le condizioni delle cellule in vitro. Tra questi ci sono i biopolimeri o componenti biologici che di solito fanno parte della matrice extracellulare delle cellule. Questi biomateriali sono utilizzati principalmente come forma di agenti di rivestimento polimerizzati o idrogel18,19,20. Da un lato, le matrici sopra menzionate danno alle cellule un ambiente 3D familiare in cui crescere, incoraggiano la loro adesione al piatto e danno loro supporto meccanico21,22. D'altra parte, la loro forma polimerizzata e il confinamento delle cellule all'interno degli idrogel disturba l'accesso delle cellule ai componenti nutritivi presenti nei mezzi di crescita e rende anche più difficile il follow-up delle cellule con metodi microscopici23.
Gli esoscheletri corallini sono matrici biologiche di origine marina. Sono fatti di carbonato di calcio, hanno stabilità meccanica e sono biodegradabili. Studi precedenti che utilizzavano lo scheletro di corallo come matrice per la crescita di cellule neurali in coltura hanno mostrato un'adesione molto maggiore, rispetto ai vetrini24,25. Inoltre, le cellule neurali cresciute sullo scheletro di corallo hanno dimostrato la loro capacità di assumere il calcio di cui è composto lo scheletro, che protegge le cellule neurali in condizioni di privazione di nutrienti26. Inoltre, lo scheletro di corallo è una matrice di supporto e nutrimento che aumenta la sopravvivenza delle cellule neurali, incoraggia la formazione di reti neurali, eleva il tasso di connettività sinaptica e consente la formazione di strutture simili a tessuti27,28. Recenti studi hanno anche dimostrato che la topografia superficiale della matrice dello scheletro di corallo gioca un ruolo cruciale nella distribuzione e nell'attivazione delle cellule gliali 8,29. Inoltre, lo scheletro di corallo è efficace come matrice per la coltivazione di altri tipi cellulari, come gli osteociti30,31, gli epatociti e i cardiomiociti in coltura (dati non pubblicati).
Quindi, lo scheletro di corallo è una matrice promettente per la coltivazione di cellule in vitro. Pertanto, il protocollo descritto di seguito descrive la tecnica di coltivazione di cellule neurali su scheletro di corallo per produrre colture neurali più stabili e prospere di quelle ottenute con i metodi esistenti. Questo protocollo può anche essere utile per la coltivazione di cardiomiociti, epatociti e altri tipi di cellule.
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Protocol
L'uso di animali in questo protocollo è stato approvato dal National Animal Care and Use Committee.
NOTA: Gli scheletri di corallo carbonato di calcio devono essere usati nella forma cristallina di aragonite. I tipi di corallo testati finora per le colture neurali sono Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Gli scheletri possono essere acquistati interi o macinati.
1. Pulizia dei pezzi dello scheletro di corallo
ATTENZIONE: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una cappa chimica a temperatura ambiente, poiché le soluzioni descritte di seguito sono pericolose e possono causare ustioni e irritazioni.
- Usa un martello per rompere lo scheletro di corallo e dividerlo in frammenti di 0,5-2 cm. Per sciogliere i residui organici e non organici, immergere i frammenti dello scheletro di corallo in una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per 10 minuti, quindi lavare una volta con acqua distillata doppia (DDW).
- Per rimuovere i residui organici rimanenti, immergere i frammenti in una soluzione 1M NaOH per 5 minuti, quindi lavare una volta con DDW. Continuare con la rimozione dei depositi organici immergendo i frammenti in soluzione di H 2O 2al 30% per 10 minuti, quindi lavare i frammenti 3x con DDW.
- Rimuovere quanto più DDW in eccesso possibile e lasciare asciugare i frammenti di corallo nel cappuccio (1-8 ore).
2. Pulizia dei vetrini
- Trasferire i coperchi di vetro in una capsula di Petri di vetro da 100 mm. Aggiungere 10 ml di etanolo al 95% per 15 minuti.
- Rimuovere l'etanolo e lavare con DDW 3x, aspettando 10 minuti tra ogni lavaggio. Posizionare il piatto su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 °C fino a quando il DDW evapora. Mescolare delicatamente i coperchi all'interno del piatto più volte mentre si asciugano per evitare che si attacchino l'uno all'altro.
- Autoclavare i coprivetrini.
3. Preparazione dei grani dello scheletro di corallo
- Macinare i frammenti dello scheletro di corallo usando un mortaio e un pestello (macinazione manuale) fino alla completa rottura. Il risultato è una miscela di grani con dimensioni comprese tra 20 μm e 200 μm.
- In alternativa, macinare i frammenti dello scheletro di corallo utilizzando una rettificatrice elettrica a una velocità di 1.000 giri / min per 30 s (lunghezza della lama = 6 cm; larghezza = 0,5 cm-1,0 cm). La granulometria risultante è simile alla gamma di dimensioni prodotta dalla macinazione manuale.
4. Purificazione dei grani di una gamma granulometrica specifica
NOTA: se si desidera controllare la dimensione dei grani in una matrice, utilizzare la seguente procedura di purificazione del grano basata sulla filtrazione.
- Trasferire i grani su un filtro manuale o elettrico da 40 μm.
- Dividere i grani in due intervalli specifici setacciando i grani attraverso il filtro (se si utilizza un filtro elettrico, si raccomandano le seguenti condizioni: scuotimento = 600 ampiezze / min, rimbalzo = 6 / s). Questa procedura produce due gruppi di granulometrie, uno <40 μm e il secondo >40 μm.
NOTA: le due dimensioni possono essere determinate utilizzando filtri di maglie diverse. Se si desidera un intervallo più ristretto, selezionare nuovamente ciascun gruppo dal punto 4.2 attraverso filtri con maglie diverse. - Autoclavare i grani.
5. Preparazione di piatti o coprivetrine rivestiti di grani di corallo
- Per il rivestimento di palloni, piastre o piastre di Petri
NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili.- Aggiungere i grani dello scheletro di corallo in una soluzione di poli-D-lisina (PDL) da 20 μg/mL disciolta nella soluzione di Hanks. La concentrazione raccomandata è di 5 mg/10 mg di grani per 1 mL di soluzione PDL.
- Versare la soluzione in matraccio e piatti (circa 2 ml/25 cm2) e incubare per una notte a 4 °C. I grani affondano e si attaccano al fondo.
- Il giorno dopo, lavare le borracce e i piatti una volta con DDW sterile. Lasciare asciugare le fiasche e i piatti nel cappuccio.
NOTA: È preferibile utilizzare fiaschi e piatti appena rivestiti. I palloni e i piatti rivestiti possono essere utilizzati fino a una settimana dopo il rivestimento se conservati a 4 °C. Tuttavia, l'efficacia della matrice può essere compromessa.
- Rivestimento vetrini (diametro 12 mm, spessore 0,17 mm)
- Aggiungi grani di scheletro di corallo a DDW a qualsiasi concentrazione desiderata. Le densità comuni utilizzate per le cellule neurali sono 5 mg/ml e 10 mg/ml. Versare 40 μL della soluzione di grani al centro del vetrino di copertura (Figura 4).
- Posizionare i vetrini su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 °C e attendere la completa evaporazione (di solito 15 min). In queste condizioni, i grani aderiscono al coprifoglio. Autoclavare i coprivetrini rivestiti. Conservare in condizioni sterili.
- Un giorno prima della cultura, posizionare i vetrini sul coperchio di una piastra sterile da 24 pozzetti. Aggiungere 100 μL di soluzione PDL da 20 μg/mL a ciascun vetrino. Utilizzare la punta per assicurarsi che il liquido copra l'intera regione del grano e il resto della superficie del coprifoglio.
- Coprire il coperchio con il fondo del piatto. Avvolgere i lati dei piatti con pellicola di paraffina. Incubare per una notte a 4 °C.
- Il giorno dopo, lavare una volta con DDW e asciugare nel cappuccio.
NOTA: È preferibile utilizzare copertine appena rivestite.
6. Coltivazione di cellule dissociate ippocampali su vetrine rivestite di grani di corallo
NOTA: Il metodo per la coltura cellulare dissociata dell'ippocampo è stato modificato rispetto alle procedure precedentemente pubblicate24,27. La preparazione della cultura è descritta per quattro cuccioli di ratto. La resa attesa da ciascun ippocampo è di 1-1,5 x 106 cellule.
- Apparecchio
- Preparare una capsula di Petri vuota da 60 mm. Versare 2 ml di mezzo essenziale minimo (MEM) in una capsula di Petri da 60 mm e mettere su ghiaccio.
- Versare 2 mL di MEM in un piatto da 35 mm e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5-10% CO2. Versare 2 mL di MEM in una provetta da 15 mL e mantenerla a 4 °C.
- Versare 1 mL di First Day Medium in un tubo da 15 mL e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5-10% CO2.
NOTA: La composizione del mezzo del primo giorno è descritta nella tabella dei materiali. - Scongelare 200 μL di una soluzione di tripsina al 2,5% e incubare a 37 °C.
- Preparare tre pipette Pasteur in vetro con teste da 0,5 mm, 0,75 mm e 1,0 mm di diametro utilizzando una fiamma.
- Preparare strumenti chirurgici adeguati: una grande forbice, due piccole forbici, una grande pinzetta, quattro piccole pinzette e un bisturi.
- Preparare uno stereomicroscopio nel cappuccio.
- Usando una grande forbice, sacrifica cuccioli di ratto Sprague Dawley di 0-3 giorni separando le loro teste dai loro corpi in una capsula di Petri vuota da 60 mm (passo 6.1.1). Smaltire i corpi.
- Raccogli la testa tenendola dalla bocca con una grande pinzetta. Taglia la pelle che copre il cranio con una piccola forbice.
- Con una forbice pulita, entra sotto il cranio (sul lato del cervelletto) e taglia il cranio a destra e a sinistra per consentirne la rimozione. Usando una piccola pinzetta, staccare il cranio dal cervello.
- Con una pinzetta pulita, separare il cervello dalla testa e metterlo in una capsula di Petri da 60 mm contenente 2 ml di MEM freddo (vedere punto 6.1.2).
- Usando due piccole pinzette, sezionare l'ippocampo sotto uno stereomicroscopio. Trasferire l'ippocampo nel piatto preparato da 35 mm (dal punto 6.1.2) contenente MEM.
NOTA: i passaggi da 6.3 a 6.6 devono essere ripetuti per ogni cucciolo. - Tagliare l'ippocampo a fette di circa 1 mm usando il bisturi. Aggiungere 200 μL della soluzione di tripsina (diluita ad una concentrazione finale dello 0,25%). Mescolare delicatamente e incubare a 37 °C, 5-10% CO2 per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di MEM freddo (punto 6.1.2) al piatto per disattivare la tripsina. Trasferire il tessuto tripsinizzato in una provetta da 15 mL contenente 1 mL di Primo Giorno di Mezzo preriscaldato a 37 °C (punto 6.1.3) utilizzando la pipetta Pasteur in vetro con il diametro maggiore (fase 6.1.5).
NOTA: Il miglior rapporto mezzo-tessuto (v:v) per un'ulteriore lavorazione del tessuto è di 1 mL/8 ippocampi. Evitare il più possibile di trasferire il mezzo con il tessuto. - Triturare il tessuto facendolo passare attraverso la pipetta di vetro di diametro maggiore 10-15 volte. Quindi, ripetere questo processo utilizzando la pipetta di vetro con il diametro medio. Continuare a triturare con la pipetta di diametro più piccolo. Evitare il gorgogliamento per ridurre la morte cellulare.
- Lasciare affondare i pezzi di tessuto rimanenti per 2-5 minuti, quindi trasferire il surnatante in un altro tubo da 15 ml. Contare le cellule usando un emocitometro.
NOTA: La densità cellulare preferibile è 200.000-400.000 cellule/ml. Utilizzare First Day Medium per diluire o centrifugare a 470 x g per concentrare le cellule. - Seminare 100 μL di cellule su ogni vetrino. Durante la semina, assicurati di coprire l'intero coprislip con le celle. Incubare a 37 °C, 5–10% CO2.
- Il giorno successivo, aggiungere 500 μL di terreno di crescita neuronale ai pozzetti.
NOTA: La composizione del Terreno di Crescita Neuronale è descritta nella Tabella dei Materiali. - Trasferire delicatamente ogni coprislip nel suo pozzetto appropriato usando una pinzetta mentre si rimuove il First Day Medium inclinando il coprifoglio. Aspirare il supporto rimanente dal coperchio.
- Incubare a 37 °C, 5–10% CO2. Evitare di sostituire il mezzo durante l'incubazione. Le colture possono essere mantenute in queste condizioni fino a 1 mese. La preoccupazione principale è l'umidità. Pertanto, assicurarsi di mantenere l'incubatore umidificato al massimo.
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Representative Results
Al fine di preparare la matrice dello scheletro di corallo, l'intero scheletro di corallo (Figura 1A) è stato rotto in frammenti di 0,5-2 cm usando un martello (Figura 1B) e accuratamente pulito dai residui organici attraverso tre fasi (fase 1 del protocollo) utilizzando una soluzione di ipoclorito al 10%, una soluzione di NaOH al 10% e una soluzione di H 2 O2al 30% (Figura 1C). I frammenti di corallo sono stati ben puliti quando il colore dello scheletro è cambiato da marrone (Figura 1D) a bianco (Figura 1E). Quindi, i pezzi puliti (Figura 2A) sono stati macinati usando un mortaio e un pestello (Figura 2B) o una rettificatrice elettrica (Figura 2C). Entrambe le procedure hanno prodotto risultati simili: una miscela di grani di dimensioni comprese tra 20 μm e 200 μm (Figura 2D-G).
Uno dei vantaggi della matrice granulare rispetto ai substrati solubili è che molte delle sue proprietà strutturali e fisiche possono essere modificate, rendendola più quantitativa. In questa matrice di grano dello scheletro di corallo, sono state manipolate due delle proprietà della miscela di grani: dimensione del grano e densità del grano. Per ridurre la diversità dimensionale di 20 μm-200 μm generata dalla procedura di macinazione di cui sopra, è stato scelto un approccio di setacciatura utilizzando una rete filtrante di 40 μm. Utilizzando filtri manuali (Figura 3 A-D) o elettrici (Figura 3E), sono stati prodotti due tipi di miscele di cereali: uno con grani di dimensioni comprese tra 40 μm e 200 μm (Figura 3 F,H) e il secondo con dimensioni pari o inferiori a 40 μm (Figura 3G,I). La densità dei grani che rivestivano i foglietti e le stoviglie era determinata semplicemente applicando quantità variabili di grani e attaccandoli ai vetrini mediante calore (figura 4C) o a palloni e piatti per gravità (figura 4H). In questo modo sono state prodotte matrici di bassa (Figura 4 D,F,I) e alta densità (Figura 4E,G,J).
La figura 5 mostra il risultato della coltivazione di cellule ippocampali su vetrini rivestiti con grani di scheletro di corallo da <40 μm (10 mg/ml). Le micrografie a contrasto di fase mostrano che le cellule formavano reti neurali complesse in assenza (Figura 5A) e presenza (Figura 5B) della matrice. La colorazione dei nuclei cellulari (Figura 5C,D) ha indicato che 14 giorni dopo la semina, la densità cellulare era più alta sulla matrice rispetto ai vetrini di copertura non rivestiti. La colorazione con microtubuli associati alla proteina 2 (MAP2) ha mostrato che sulla matrice si è formata una complessa rete neuronale e dendritica (Figura 5F) rispetto al controllo (Figura 5E). Inoltre, le cellule gliali cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo visualizzate utilizzando la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) hanno subito cambiamenti morfologici significativi. Hanno acquisito un aspetto più appuntito con processi più lunghi rispetto alle cellule gliali cresciute sul substrato di controllo, dove apparivano più rotonde e piatte (Figura 5G,H).
Figura 1: Pulizia dello scheletro di corallo. (A) Lo scheletro del corallo Stylophora pistillata. (B) Frammenti scomposti dello scheletro prima della pulizia. (C) I frammenti di (B) dopo trattamento con soluzione di ipoclorito, idrossido di sodio e perossido di idrogeno. (D) Ingrandimento del frammento non ripulito di cui alla lettera B). (E) Ingrandimento del frammento pulito di cui alla lettera C). Scala: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Macinazione dello scheletro di corallo. (A) Frammenti di scheletro di corallo puliti. (B) Mortaio e pestello utilizzati per la macinazione manuale. La freccia rossa indica i grani risultanti. (C) Rettificatrice. La freccia rossa indica i grani risultanti. (D) Grani dopo macinazione manuale. (E) Grani dopo macinazione meccanica. f) Ampliamento della lettera d). g) Ampliamento della lettera E). Scala: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Controllo sulla granulometria. (A-D) Procedura di sforzo manuale. (A) Utilizzo di un filtro da 40 μm. (B) Filtro con grani macinati non stirati posti in un tubo da 50 mL e filtrati con un vortice. (C) Grani filtrati <40 μm sul fondo del tubo da 50 ml. D) Grani di dimensioni minime simili a quelle delle maglie (>40 μm, freccia gialla). (E) Filtro meccanico utilizzato per filtrare grani di <40 μm da una miscela di grani di dimensioni comprese tra 20 μm e 200 μm. (F) Dimostrazione di diverse granulometrie dopo la macinazione prima della filtrazione. (G) Dimostrazione di grani filtrati <40 μm. (H) Allargamento di (F). — Ampliamento di (G). Scala: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Controllo della densità della matrice. (A) Una provetta da centrifuga da 1,5 mL con grani da <40 μm diluiti a 10 mg/ml con DDW per i vetrini di copertura, PDL per le altre stoviglie. (B) Vetrino con 40 μL di soluzione da 10 mg/ml. C) Vetrini con 40 μL di soluzione da 10 mg/mL essiccati su una piastra riscaldata preriscaldata a 80 °C, che consenta ai grani di aderire al vetrino. (D) Coprislip rivestito con una concentrazione di grani di 5 mg/ml dopo evaporazione DDW. (E) Coprislip rivestito con una concentrazione di grani di 10 mg/ml dopo evaporazione del DDW. f) Ampliamento della lettera d). g) Ampliamento della lettera E). H) Una soluzione da 10 mg/ml in un matraccio T-25, piastra da 60 mm. I) Pallone rivestito di grani in concentrazione di 5 mg/ml. J) Pallone rivestito in grani in concentrazione di 10 mg/ml. Scala: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Coltivazione di cellule neurali ippocampali sulla matrice dello scheletro di corallo. Le immagini mostrano cellule estratte dall'ippocampo di un cucciolo di ratto di 0-3 giorni cresciuti in coltura per 14 giorni e colorati con GFAP (cellule rosse, gliali), MAP2 (verde, somi e dendriti neuronali), DAPI (blu, nuclei cellulari). (A) Immagine di contrasto di fase delle cellule in assenza della matrice. (B) Immagine di contrasto di fase delle cellule cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo. (C) Cellule coltivate senza matrice colorata con DAPI. (D) Cellule cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo colorata con DAPI. (E) Cellule cresciute in assenza della matrice colorata per MAP2. (F) Cellule cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo colorata per MAP2. (G) Cellule coltivate senza matrice colorata per GFAP. (H) Cellule cresciute sulla matrice dello scheletro di corallo colorata per GFAP. (I) Immagine unita di (C),(E),(G). (J) Immagine unita di (D),(F),(H). Scala = 40 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La tecnica qui presentata descrive un modo per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in coltura. Ciò si ottiene facendo aderire le cellule a una matrice fatta di grani di scheletro di corallo che nutre le cellule e ne promuove la crescita e l'attività. L'uso di questa tecnica aumenta la capacità del modello di coltura neurale di imitare l'ambiente delle cellule nel cervello.
L'introduzione della matrice come substrato di coltura presenta diversi vantaggi rispetto ad altri substrati utilizzati nei metodi classici di coltura di cellule neurali. In primo luogo, aumenta l'aderenza cellulare. La combinazione di scheletro di corallo e PDL genera un'adesività più forte rispetto al vetro e al PDL (non mostrato). Tale aumento dell'adesività si è dimostrato essenziale per la sopravvivenza delle cellule aderenti non galleggianti in coltura32. In secondo luogo, i cristalli carbonati di calcio dei grani dello scheletro di corallo sono una fonte di ioni calcio che vengono effettivamente assorbiti dalle cellule. È altamente probabile che questa sia la ragione per una maggiore durata e una maggiore densità (Figura 5C, D) delle cellule neurali esibite sulla matrice dello scheletro di corallo, rispetto al loro livello di sopravvivenza in sua assenza26.
Un terzo vantaggio risiede nel fatto che la matrice dello scheletro di corallo è in realtà non planare, a differenza del vetrino. I grani sono strutturati in 3D con una complessa architettura di superficie curva. Queste proprietà strutturali variano se si considera che le cellule affrontano popolazioni di grano di varie morfologie, dimensioni e densità. Una sostanza di coltura così ruvida e non planare imita meglio l'ambiente delle cellule in vivo rispetto al classico coprislip piatto. Infatti, abbiamo dimostrato che la rugosità, le dimensioni e la morfologia dello scheletro di corallo influenzano la distribuzione cellulare, la sopravvivenza e l'attività 8,26,29.
Inoltre, la configurazione 3D che una matrice di scheletro di corallo fornisce alle cellule come microambiente differisce notevolmente dalle matrici convenzionali di idrogel utilizzate per la crescita 3D in vitro. Quando si utilizzano idrogel, come collagene e acido ialuronico, le cellule sono incorporate nel gel23. Il gel assomiglia alla matrice extracellulare in termini di riempimento dello spazio, rigidità e altri attributi, ma a causa della viscosità dei gel, queste colture richiedono complicati sistemi di alimentazione per mantenere le cellule ben nutrite21,22. Al contrario, i grani 3D dello scheletro di corallo consentono alle cellule di occupare la loro superficie, che è completamente aperta al terreno di coltura. Inoltre, a differenza delle colture di idrogel, le cellule sulla matrice dello scheletro di corallo sono prontamente monitorate attraverso la microscopia di fase e fluorescente.
Questa tecnica ha diverse limitazioni. Nonostante i vantaggi sopra elencati, lo scheletro di corallo è un biomateriale e non può essere fabbricato ma raccolto da coralli morti, causando limitazioni nella fornitura di matrice, sebbene alcuni siano disponibili in commercio. Inoltre, l'uso di scheletri di più specie di coralli può introdurre variazioni nelle proprietà della coltura. D'altra parte, il fatto che i cristalli dello scheletro di corallo siano tutti fatti di un'unica sostanza, l'aragonite, e che la dimensione dei grani possa essere controllata, elimina la maggior parte della diversità chimica e strutturale tra le matrici. I grani di tutti i biomateriali testati sono abbastanza grandi da costringere le cellule a crescere tridimensionalmente. Le cellule si arrampicano sui grani8, crescono attaccandosi alle punte dei cristalli33 e incrociano i grani27. In alternativa, l'aragonite geologica, costituita da sedimenti fossili e carbonato di calcio sintetico, è disponibile in commercio e può essere utilizzata come matrice. Tuttavia, potrebbe mostrare una minore aderenza ai vetrini di copertura.
In vista dell'utilizzo di più specie di coralli, è importante notare che alcuni studi hanno dimostrato prove di biomineralizzazione dei coralli, che possono portare alla presenza di diversi depositi organici tra i cristalli di carbonato di calcio. Questi non possono essere rimossi utilizzando il processo di pulizia descritto nel presente protocollo33,34. Questo fatto è di fondamentale importanza quando si identifica un biomateriale per applicazioni biologiche. Nel caso di questo studio, sono stati precedentemente eseguiti diversi passaggi al fine di garantire la massima omogeneità possibile dell'impalcatura. In primo luogo, tre tipi di coralli sono stati testati per le matrici: Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Non ci sono stati cambiamenti significativi in termini di crescita e sopravvivenza delle cellule neurali su questi scheletri di corallo. Questo risultato può indicare che diversi depositi organici all'interno dello scheletro non hanno un'influenza significativa in questo caso. In secondo luogo, la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier dello scheletro di corallo pulito ha mostrato l'assenza di residui organici29.
Ci sono alcuni passaggi critici all'interno del protocollo che dovrebbero essere presi in considerazione. In primo luogo, durante la setacciatura manuale dei grani, si consiglia di sostituire il colino di volta in volta, poiché i filtri tendono a intasarsi. Il filtro elettrico utilizza una forza maggiore durante la setacciatura. Pertanto, non tende a intasarsi facilmente. In secondo luogo, mentre si disperde la miscela di grani di corallo PDL sui piatti e sui coprifogli, è importante pipettare frequentemente la miscela per evitare l'affondamento dei grani. Ciò garantirà una dispersione omogenea della soluzione. È importante prestare attenzione al processo di attaccamento dei grani ai coprifogli. Temperature di riscaldamento errate durante l'attacco del grano al vetrino, vibrazioni e altri fattori possono causare il distacco dei grani prima o dopo la semina cellulare. Si consiglia di risolvere questo problema controllando attentamente la temperatura e riducendo al minimo le vibrazioni. Inoltre, è preferibile eseguire gli esperimenti in un determinato momento dopo aver rivestito i palloni e le stoviglie. Si consiglia di ricoprire i piatti freschi un giorno prima della cultura. L'incubazione prolungata di piatti con la miscela di cereali PDL può comportare una diversità nella quantità di grani attaccati al piatto.
Alcune modifiche della tecnica sopra descritta sono possibili in base alle esigenze delle cellule coltivate. Oltre alla sua capacità di migliorare la crescita delle cellule neurali in coltura, le matrici dello scheletro di corallo supportano la crescita degli osteociti30,31, degli epatociti e dei cardiomiociti (dati non pubblicati). Per aumentare la durata della coltura di altri tipi di cellule, si raccomanda di verificare la reazione cellulare più forte agli scheletri di diversi tipi di corallo, nonché di ottimizzare le dimensioni e la densità dei grani.
È anche possibile coltivare cellule neurali direttamente sui grani, senza rivestimento aggiuntivo. Tuttavia, il prerivestimento dei grani con PDL, come menzionato in questo protocollo (fase 5) migliora notevolmente l'adesione e la sopravvivenza delle cellule neurali, al di sopra dei livelli ottenuti con vetro rivestito PDL. È anche possibile utilizzare altri materiali di rivestimento in base alle preferenze di diversi tipi di celle.
Vale la pena ricordare che la dimensione dei grani nella matrice è limitata. Al di sopra di una certa soglia, circa 200 μm, diventa difficile legarli ai vetrini di copertura. Pertanto, la rugosità della superficie della matrice ha un intervallo finito. Gli esperimenti che richiedono grani più grandi o pezzi di scheletro non sono adatti a questa tecnica. Si può trovare un modo alternativo per attaccare grani più grandi, magari usando colle o gel, ma questo può oscurare il contatto cellulare con i grani. Un'altra possibilità è quella di coltivare le cellule direttamente sullo scheletro, senza macinare. Questo metodo richiede una modifica della procedura di semina cellulare24,27. La struttura 3D dello scheletro di corallo non macinato contribuisce alla sopravvivenza delle cellule neurali, come abbiamo riportato primadi 26. Tuttavia, una matrice così complessa e densa rende difficile il lavoro di microscopia. La configurazione compromessa dello scheletro di terra preserva le proprietà chimiche dello scheletro, consente l'analisi al microscopio 2D e, a causa delle grandi dimensioni dei grani, costringe le cellule a crescere in 3D8.
Inoltre, un eccesso di grani di scheletro di corallo può essere tossico. Come accennato in precedenza, la componente calcica della matrice dello scheletro di corallo viene assorbita dalle cellule35. L'eccesso di calcio causato dall'elevata densità del grano può essere un peso o addirittura inibitorio per alcuni tipi di cellule, come nel caso delle cellule neurali36. Pertanto, può essere necessaria una riduzione della densità del grano e ottimizzata per ciascun tipo di cella. Inoltre, è importante ricordare che la disponibilità di scheletri di corallo può essere limitata. I coralli crescono lentamente negli acquari e nel loro ambiente naturale. La loro crescita è ulteriormente rallentata a causa del riscaldamento globale e dell'acidificazione degli oceani37. Pertanto, l'abbondanza e la disponibilità di scheletri di corallo sono limitate.
Il rafforzamento delle cellule neurali dissociate a contatto con i grani dello scheletro di corallo in coltura apre nuove strade per la ricerca in neurobiologia. La crescita cellulare, l'estensione neuritica e la ramificazione, così come la sinaptogenesi e la plasticità sinaptica, possono essere studiate con maggiore intensità e durata sperimentale prolungata.
Inoltre, sembra che la matrice corallina causi un aumento di alcune delle funzioni cellulari delle cellule gliali, come la crescita, la reattività e la proliferazione. È quindi possibile che queste condizioni aumentino anche la capacità astrocitaria di arricchire i terreni di coltura neurale dissociati con fattori trofici secreti, qualcosa che può essere applicabile per la medicina rigenerativa del sistema nervoso centrale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal programma KAMIN del Ministero del Commercio e del Lavoro israeliano e da Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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