Summary
Ayrışmış hipokampal hücre kültürü, nörobilimde çok önemli bir deneysel araçtır. Nöroprotektif ve nöromodülatif rolleri nedeniyle mercan iskeletleri matris olarak kullanıldığında kültürde nöral hücre sağkalımı ve fonksiyonu artar. Bu nedenle, mercan matrisinde yetiştirilen nöral hücreler daha yüksek dayanıklılık gösterir ve bu nedenle kültürleme için daha yeterlidir.
Abstract
Ayrışmış hipokampal, nöronal ve glial hücrelerin kültürleri, yüksek hücre izolasyonu ve kontrollü bir ortam sağlayarak nöral büyümeyi ve fonksiyonu incelemek için değerli bir deneysel modeldir. Bununla birlikte, hipokampal hücrelerin in vitro olarak hayatta kalması tehlikeye girer: çoğu hücre kültürün ilk haftasında ölür. Bu nedenle, kültürdeki sinir hücrelerinin dayanıklılığını arttırmanın yollarını belirlemek büyük önem taşımaktadır.
Mercanların iskeletinden elde edilen kristalin aragonit formundaki kalsiyum karbonat, nöral kültürler için üstün, aktif bir matris olarak kullanılabilir. Glial hücreleri besleyerek, koruyarak ve aktive ederek, mercan iskeleti bu hücrelerin hayatta kalmasını ve büyümesini in vitro olarak diğer matrislerden daha iyi arttırır.
Bu protokol, bir mercan matrisi üzerinde hipokampal hücrelerin yetiştirilmesi için bir yöntem açıklar. Bu matris, mercan iskeletlerinin tanelerinin kültür yemeklerine, şişelere ve cam örtülere bağlanmasıyla üretilir. Tahıllar, hücrelerin ortamını, büyümek ve doku benzeri yapılar oluşturmak için ince bir üç boyutlu (3B) ortama sokarak iyileştirmeye yardımcı olur. Mercan iskeleti tarafından tanıtılan 3D ortam, glial hücrelerin aktivitesini etkilediği tespit edilen bir özellik olan taneciklerin büyüklüğü ve yoğunluğu (yani, matris pürüzlülüğü) üzerinde kontrol sağlayan öğütme yoluyla hücreler için optimize edilebilir. Dahası, tahıl kullanımı, özellikle ışık mikroskobu kullanıldığında, kültürlerin gözlemlenmesini ve analizini kolaylaştırır. Bu nedenle, protokol, in vitro sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmek için bir araç olarak mercan matrisinin oluşturulması ve optimizasyonu için prosedürler içerir.
Introduction
Ayrışmış sinir hücrelerinin kültürleri, bu durumda hipokampal hücreler, yüksek hücre izolasyonu ve erişilebilirliği sağlayarak nöral büyümeyi ve işlevi incelemek için değerli bir deneysel modeldir 1,2,3. Bu tür bir kültür, büyüme ve canlılık oranları, nörotoksisite, nörit büyümesi ve ağ oluşturma, sinaptik bağlantı ve plastisite, morfolojik modifikasyonlar, nöritlerin organizasyonu ve kablolaması gibi toplanabilecek büyük miktarda bilgi nedeniyle nörobilim, ilaç geliştirme ve doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmaktadır.1,4,5,6,7.
Kültürlerin önemine rağmen, ekili hücreler genellikle iki boyutlu tek katmanlı cam örtüler üzerinde büyümeye zorlanır. Bu katı çevresel değişiklikler, sinir hücrelerinin zaman içinde hayatta kalma yeteneğini önemli ölçüde azaltır, çünkü cam örtüler, düşük yapışma mukavemetine sahip, hücre büyümesini desteklemek için daha düşük bir kapasite sergileyen, besleyici olmayan substratlardır 8,9,10,11.
Ekili sinir hücreleri zorlu koşullarda büyümeye zorlandığından, hayatta kalmalarını arttırmak için temel bir yaklaşım, doğal çevrelerini mümkün olduğunca taklit etmek olacaktır12,13. Bu, matris görevi görecek ve hücrelerin hücre dışı matrisini taklit edecek, doku benzeri bir yapı oluşturmalarını ve beslenmelerine yardımcı olmalarını sağlayacak biyomalzemeler kullanılarak başarılabilir14.
Biyomateryallerin kullanımı, hücre kültürlerinin iyileştirilmesinde umut verici bir yaklaşımdır, çünkü biyouyumlu iskeleler gibi davranırlar, mekanik stabilite sağlarlar ve yapışma, hayatta kalma, çoğalma, göç, morfogenez ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli hücre özelliklerini arttırırlar15,16,17. İn vitro hücrelerin koşullarını iyileştirmek için çeşitli biyomateryal türleri kullanılır. Bunlar arasında biyopolimerler veya genellikle hücrelerin hücre dışı matrisinin bir parçası olan biyolojik bileşenler bulunur. Bu biyomalzemeler çoğunlukla polimerize kaplama ajanlarının veya hidrojellerin bir formu olarak kullanılır18,19,20. Bir yandan, yukarıda bahsedilen matrisler, hücrelere büyümeleri için tanıdık bir 3D ortam sağlar, çanağa yapışmalarını teşvik eder ve onlara mekanik destek verir21,22. Öte yandan, polimerize formları ve hücrelerin hidrojeller içinde hapsedilmesi, hücrelerin büyüme ortamında bulunan besleyici bileşenlere erişimini bozar ve ayrıca hücrelerin mikroskobik yöntemlerle takibini zorlaştırır23.
Mercan dış iskeletleri biyolojik deniz kaynaklı matrislerdir. Kalsiyum karbonattan yapılmış, mekanik stabiliteye sahip ve biyolojik olarak parçalanabilirler. Mercan iskeletini kültürde büyüyen sinir hücreleri için bir matris olarak kullanan önceki çalışmalar, cam örtükaymalarına kıyasla çok daha fazla yapışma göstermiştir 24,25. Ek olarak, mercan iskeleti üzerinde yetiştirilen nöral hücreler, iskeletin oluştuğu kalsiyumu alma yeteneklerini göstermiştir, bu da sinir hücrelerini besin yoksunluğu koşullarında korur26. Dahası, mercan iskeleti, sinir hücrelerinin hayatta kalmasını artıran, sinir ağlarının oluşumunu teşvik eden, sinaptik bağlantı oranını yükselten ve doku benzeri yapıların oluşumunu sağlayan destekleyici ve besleyici bir matristir27,28. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mercan iskelet matrisinin yüzey topografyasının glial hücrelerin dağılımında ve aktivasyonunda çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,29. Ayrıca, mercan iskeleti, osteositler30,31, hepatositler ve kültürdeki kardiyomiyositler gibi diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için bir matris olarak etkilidir (yayınlanmamış veriler).
Bu nedenle, mercan iskeleti, in vitro hücrelerin yetiştirilmesi için umut verici bir matristir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, mevcut yöntemlerle elde edilenlerden daha kararlı ve müreffeh sinir kültürleri üretmek için mercan iskeleti üzerindeki sinir hücrelerini yetiştirme tekniğini açıklamaktadır. Bu protokol ayrıca kardiyomiyositlerin, hepatositlerin ve diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için de yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde hayvanların kullanımı Ulusal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Kalsiyum karbonatlı mercan iskeletleri, aragonitin kristal formunda kullanılmalıdır. Nöral kültürler için şimdiye kadar test edilen mercan türleri Porites Lutea, Stylophora Pistillata ve Trachyphyllia Geoffroyi'dir. İskeletler tamamen veya öğütülmüş olarak satın alınabilir.
1. Mercan iskelet parçalarının temizlenmesi
DİKKAT: Aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında kimyasal bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir, çünkü aşağıda açıklanan çözeltiler tehlikelidir ve yanıklara ve tahrişlere neden olabilir.
- Mercan iskeletini kırmak ve 0,5-2 cm'lik parçalara bölmek için bir çekiç kullanın. Organik ve organik olmayan kalıntıları çözmek için, mercan iskelet parçalarını 10 dakika boyunca% 10 sodyum hipoklorit çözeltisine batırın, ardından bir kez çift damıtılmış su (DDW) ile yıkayın.
- Kalan organik kalıntıları gidermek için, parçaları 5 dakika boyunca 1M NaOH çözeltisine batırın, ardından DDW ile bir kez yıkayın. Parçaları 10 dakika boyunca% 30H2O2 çözeltisine batırarak organik birikintilerin uzaklaştırılmasına devam edin, ardından parçaları DDW ile 3x yıkayın.
- Mümkün olduğunca fazla DDW'yi çıkarın ve mercan parçalarını davlumbazda kurumaya bırakın (1-8 saat).
2. Cam kapakların temizlenmesi
- Cam kapakları 100 mm'lik bir cam Petri kabına aktarın. 15 dakika boyunca 10 mL% 95 etanol ekleyin.
- Etanol çıkarın ve DDW 3x ile yıkayın, her yıkama arasında 10 dakika bekleyin. Çanağı, DDW buharlaşana kadar 80 ° C önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin. Birbirlerine yapışmalarını önlemek için kururken plaka içindeki kapakları birkaç kez hafifçe karıştırın.
- Kapak fişlerini otoklavlayın.
3. Mercan iskelet tanelerinin hazırlanması
- Mercan iskelet parçalarını bir harç ve havan (manuel taşlama) kullanarak tamamen parçalanana kadar öğütün. Sonuç, 20 μm-200 μm arasında değişen boyutlara sahip tanelerin bir karışımıdır.
- Alternatif olarak, mercan iskelet parçalarını elektrikli bir taşlama makinesi kullanarak 30 s boyunca 1.000 rpm hızında öğütün (bıçak uzunluğu = 6 cm; genişlik = 0,5 cm-1,0 cm). Elde edilen tane boyutu, manuel taşlama ile üretilen boyut aralığına benzer.
4. Belirli bir boyut aralığındaki tanelerin saflaştırılması
NOT: Bir matristeki taneciklerin boyutu üzerinde kontrol isteniyorsa, aşağıdaki filtreleme tabanlı tane saflaştırma prosedürünü kullanın.
- Taneleri manuel veya elektrikli 40 μm filtre örgü süzgecine aktarın.
- Taneleri süzgeçten geçirerek taneleri iki spesifik aralığa bölün (elektrikli süzgeç kullanılıyorsa, aşağıdaki koşullar önerilir: sallama = 600 genlik / dak, sıçrama = 6 / s). Bu prosedür, biri <40 μm ve ikincisi >40 μm olmak üzere iki grup tane boyutu üretir.
NOT: İki boyut, farklı kafeslere sahip süzgeçler kullanılarak belirlenebilir. Daha kısıtlı bir aralık isteniyorsa, adım 4.2'den itibaren her grubu farklı kafeslere sahip süzgeçler aracılığıyla yeniden eleyin. - Taneleri otoklavlayın.
5. Mercan tanesi kaplı tabakların veya örtülerin hazırlanması
- Şişeleri, tabakları veya Petri tabaklarını kaplamak için
NOT: Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.- Mercan iskelet tanelerini, Hanks çözeltisinde çözünmüş 20 μg / mL poli-D-lizin (PDL) çözeltisine ekleyin. Önerilen konsantrasyon, 1 mL PDL çözeltisi başına 5 mg / 10 mg tahıldır.
- Çözeltiyi şişelere ve tabaklara (yaklaşık 2 mL / 25cm2) dökün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Taneler batar ve dibe yapışır.
- Ertesi gün, şişeleri ve bulaşıkları steril DDW ile bir kez yıkayın. Şişelerin ve bulaşıkların davlumbazda kurumasını bekleyin.
NOT: Taze kaplanmış şişe ve tabakların kullanılması tercih edilir. Kaplanan şişeler ve tabaklar, 4 °C'de muhafaza edilirse kaplamadan sonra bir haftaya kadar kullanılabilir. Bununla birlikte, matrisin etkinliği tehlikeye girebilir.
- Kaplama cam kapakları (12 mm çap, 0,17 mm kalınlık)
- İstenilen herhangi bir konsantrasyonda DDW'ye mercan iskelet taneleri ekleyin. Nöral hücreler için kullanılan yaygın yoğunluklar 5 mg / mL ve 10 mg / mL'dir. Tane çözeltisinin 40 μL'sini kapak kaymasının ortasına dökün (Şekil 4).
- Kapak fişlerini 80 ° C'ye önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin ve tam buharlaşmayı bekleyin (genellikle 15 dakika). Bu koşullar altında, taneler kapak kaymasına yapışır. Kaplanmış kapak fişlerini otoklavlayın. Steril koşullarda saklayın.
- Kültürden bir gün önce, kapakları steril bir 24 kuyucuk plakasının kapağına yerleştirin. Her bir kapak fişine 100 μL 20 μg/mL PDL çözeltisi ekleyin. Sıvının tüm tane bölgesini ve kapak kayma yüzeyinin geri kalanını kapladığından emin olmak için ucu kullanın.
- Kapağı plakanın alt kısmıyla örtün. Plakaların kenarlarını parafin film ile sarın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, DDW ile bir kez yıkayın ve davlumbazda kurutun.
NOT: Taze kaplamalı kapakların kullanılması tercih edilir.
6. Mercan iskeleti tahıl kaplı cam örtüler üzerinde hipokampal ayrışmış hücrelerin yetiştirilmesi
NOT: Hipokampal ayrışmış hücre kültürü için yöntem daha önce yayınlanmış prosedürlerden24,27 olarak değiştirilmiştir. Kültürün hazırlanması dört sıçan yavrusu için tarif edilmiştir. Her hipokampustan beklenen verim 1–1.5 x 106 hücredir.
- Kurulum
- Boş bir 60 mm Petri kabı hazırlayın. 60 mm'lik bir Petri kabına 2 mL minimal esansiyel ortam (MEM) dökün ve buz üzerine koyun.
- 35 mm'lik bir kaba 2 mL MEM dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun. 15 mL'lik bir tüpe 2 mL MEM dökün ve 4 ° C'de tutun.
- 15 mL'lik bir tüpe 1 mL İlk Gün Ortamı dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun.
NOT: İlk Gün Ortamının bileşimi Malzemeler Tablosunda açıklanmıştır. - 200 μL'lik %2.5'lik tripsin çözeltisini çözün ve 37 °C'de inkübe edin.
- Alev kullanarak 0,5 mm, 0,75 mm ve 1,0 mm çapında kafalara sahip üç cam Pasteur pipet hazırlayın.
- Yeterli cerrahi aletler hazırlayın: bir büyük makas, iki küçük makas, bir büyük cımbız, dört küçük cımbız ve bir neşter.
- Kaputta bir stereomikroskop hazırlayın.
- Büyük bir makas kullanarak, 0-3 günlük Sprague Dawley sıçan yavrularını kafalarını vücutlarından ayırarak boş bir 60 mm Petri kabına kurban edin (adım 6.1.1). Cesetleri atın.
- Kafayı büyük bir cımbızla ağızdan tutarak alın. Kafatasını kaplayan cildi küçük bir makasla kesin.
- Temiz bir makasla kafatasının altına (beyincik tarafında) girin ve çıkarılmasını sağlamak için kafatasını sağa ve sola kesin. Küçük bir cımbız kullanarak, kafatasını beyinden çıkarın.
- Temiz bir cımbız ile, beyni kafadan ayırın ve 2 mL soğuk MEM içeren 60 mm'lik bir Petri kabına koyun (bkz. adım 6.1.2).
- İki küçük cımbız kullanarak, hipokampiyi stereomikroskop altında parçalayın. Hipokampi, MEM içeren hazırlanmış 35 mm'lik kaba (adım 6.1.2'den itibaren) aktarın.
NOT: Her yavru için 6.3-6.6 arası adımlar tekrarlanmalıdır. - Neşteri kullanarak hipokampiyi yaklaşık 1 mm'lik dilimlere kesin. 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin (% 0.25'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilir). Yavaşça karıştırın ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, tripsini devre dışı bırakmak için yemeğe 2 mL soğuk MEM (adım 6.1.2) ekleyin. Tripsinize edilmiş dokuyu, en büyük çapa sahip cam Pasteur pipeti (adım 6.1.5) kullanarak 37 °C'ye (adım 6.1.3) önceden ısıtılmış 1 mL İlk Gün Ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: Dokunun daha fazla işlenmesi için en iyi orta-doku (v:v) oranı 1 mL/8 hipokampidir. Ortamı mümkün olduğunca doku ile transfer etmekten kaçının. - Dokuyu en büyük çaplı cam pipetten 10-15 kez geçirerek tritüre edin. Ardından, orta çaplı cam pipeti kullanarak bu işlemi tekrarlayın. En küçük çaplı pipetle tritürasyona devam edin. Hücre ölümünü azaltmak için köpürmekten kaçının.
- Kalan doku parçalarının 2-5 dakika batmasına izin verin, ardından süpernatantı başka bir 15 mL tüpe aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Tercih edilen hücre yoğunluğu 200.000-400.000 hücre/mL'dir. Hücreleri konsantre etmek için 470 x g'de seyreltmek veya santrifüjlemek için İlk Gün Ortamını kullanın. - Her cam kapak üzerine 100 μL hücre tohumlayın. Tohumlama sırasında, tüm kapak kaymasını hücrelerle kapladığınızdan emin olun. 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün, kuyucuklara 500 μL Nöronal Büyüme Ortamı ekleyin.
NOT: Nöronal Büyüme Ortamının bileşimi Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. - Her bir kapak fişini cımbız kullanarak nazikçe uygun kuyucuğuna aktarın ve kapak kapağını eğerek İlk Gün Ortamını çıkarın. Kalan ortamı kapaktan emin.
- 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin. Kuluçka boyunca ortamı değiştirmekten kaçının. Kültürler bu koşullar altında 1 aya kadar muhafaza edilebilir. En büyük endişe nemdir. Bu nedenle, inkübatörün maksimum nemli tutulduğundan emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mercan iskelet matrisini hazırlamak için, tüm mercan iskeleti (Şekil 1A) bir çekiç kullanılarak 0,5-2 cm'lik parçalara ayrıldı (Şekil 1B) ve% 10 hipoklorit çözeltisi, 1M NaOH çözeltisi ve% 30H2O2çözeltisi (Şekil 1C) kullanılarak üç adımda (protokolde adım 1) organik artıklardan iyice temizlendi. İskelet rengi kahverengiden (Şekil 1D) beyaza (Şekil 1E) değiştiğinde mercan parçaları iyi temizlenmiştir. Daha sonra, temizlenen parçalar (Şekil 2A) bir harç ve havan topu (Şekil 2B) veya bir elektrikli taşlama makinesi (Şekil 2C) kullanılarak öğütüldü. Her iki prosedür de benzer sonuçlar verdi: boyutları 20 μm-200 μm arasında değişen taneciklerin bir karışımı (Şekil 2D-G).
Taneli matrisin çözünür substratlara göre avantajlarından biri, yapısal ve fiziksel özelliklerinin birçoğunun değiştirilebilmesi ve daha nicel hale getirilmesidir. Bu mercan iskeleti tane matrisinde, tane karışımı özelliklerinden ikisi manipüle edildi: tane büyüklüğü ve tane yoğunluğu. Yukarıdaki taşlama prosedürü tarafından üretilen 20 μm–200 μm boyut çeşitliliğini azaltmak için, 40 μm'lik bir filtre ağı kullanan bir eleme yaklaşımı seçilmiştir. Manuel (Şekil 3 A-D) veya elektrikli (Şekil 3E) süzgeçler kullanılarak, iki tip tahıl karışımı üretildi: biri 40 μm-200 μm arasında değişen taneciklere sahip (Şekil 3 F, H) ve ikincisi 40 μm veya daha küçük boyutlu (Şekil 3G, I). Örtü fişlerini ve bulaşıkları kaplayan tanelerin yoğunluğu, değişen miktarlarda tanecik uygulanarak ve bunları ısı ile örtü fişlerine (Şekil 4C) veya yerçekimi ile şişelere ve tabaklara tutturularak (Şekil 4H) basitçe belirlenmiştir. Bu sayede düşük (Şekil 4 D,F,I) ve yüksek yoğunluklu (Şekil 4E,G,J) matrisler üretilmiştir.
Şekil 5, hipokampal hücrelerin <40 μm (10 mg / mL) mercan iskelet taneleri ile kaplanmış örtü fişleri üzerinde yetiştirilmesinin sonucunu göstermektedir. Faz kontrast mikrografları, hücrelerin matrisin yokluğunda (Şekil 5A) ve varlığında (Şekil 5B) karmaşık sinir ağları oluşturduğunu göstermektedir. Hücre çekirdeği boyama (Şekil 5C,D), tohumlamadan 14 gün sonra, matris üzerindeki hücre yoğunluğunun, kaplanmamış kapaklara göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) ile boyama, kontrole kıyasla matris üzerinde karmaşık bir nöronal ve dendritik ağın oluştuğunu göstermiştir (Şekil 5F) (Şekil 5E). Ek olarak, glial fibriler asidik protein (GFAP) kullanılarak görselleştirilen mercan iskelet matrisi üzerinde yetiştirilen glial hücreler önemli morfolojik değişikliklere uğramıştır. Kontrol substratı üzerinde yetiştirilen glial hücrelerden daha uzun süreçlerle daha sivri bir görünüm elde ettiler, burada daha yuvarlak ve daha düz göründüler (Şekil 5G, H).
Resim 1: Mercan iskeletinin temizlenmesi. (A) Mercan Stylophora pistillata'nın iskeleti. (B) Temizlemeden önce iskeletin parçalarının parçalanması. (C) Hipoklorit çözeltisi, sodyum hidroksit ve hidrojen peroksit ile işlemden sonra (B)'den gelen fragmanlar. (D) (B)'de gösterilen temizlenmemiş parçanın büyütülmesi. (E) (C)'de gösterilen temizlenmiş parçanın büyütülmesi. Ölçek: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Mercan iskeletinin öğütülmesi. (A) Temizlenmiş mercan iskelet parçaları. (B) Manuel taşlama için kullanılan harç ve havane. Kırmızı ok, ortaya çıkan taneleri işaret eder. (C) Taşlama makinesi. Kırmızı ok, ortaya çıkan taneleri işaret eder. (D) Manuel öğütmeden sonra taneler (E) Mekanik öğütmeden sonra taneler (F) (D)'nin genişletilmesi. (G) (E)'nin genişletilmesi. Ölçek: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tane büyüklüğü üzerindeki kontrol. (A-D) Manuel germe prosedürü. (A) 40 μm süzgeç kullanmak. (B) 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş ve bir vorteks kullanılarak gerilmiş gerilmemiş öğütülmüş taneciklere sahip süzgeç. (C) 50 mL'lik tüpün dibinde süzülmüş <40 μm tanecikler. (D) Ağınkine benzer minimum büyüklükte taneler (>40 μm, sarı ok). (E) 20 μm-200 μm boyutlarındaki taneciklerin karışımından <40 μm taneleri süzmek için kullanılan mekanik süzgeç. (F) Süzmeden önce öğütmeden sonra farklı tane boyutlarının gösterilmesi. (G) Gerilmiş tanelerin gösterilmesi <40 μm. (H) (F)'nin genişlemesi. (i) (G)'nin genişletilmesi. Ölçek: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Matrisin yoğunluğunu kontrol etme. (A) Kapaklar için DDW, diğer tabaklar için PDL ile 10 mg/mL'ye seyreltilmiş <40 μm tanecikli 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpü. (B) 40 μL 10 mg/mL çözelti içeren cam kapak. (C) 80 °C'ye önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde kuruyan 40 μL 10 mg/mL çözeltili kapak fişleri, tanelerin kapak kaymasına yapışmasını sağlar. (D) DDW buharlaşmasından sonra tane konsantrasyonu 5 mg/mL olan kaplamalı kapak kayması. (E) DDW buharlaşmasından sonra tane konsantrasyonu 10 mg/mL olan kaplamalı kapak kayması. (F) (D)'nin genişletilmesi. (G) (E)'nin genişletilmesi. (H) T-25 şişesinde, 60 mm'lik plakada 10 mg/mL'lik bir çözelti. (I) 5 mg/mL konsantrasyonda tanelerle kaplanmış şişe. (J) 10 mg/mL konsantrasyonda tanelerle kaplanmış şişe. Ölçek: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mercan iskelet matrisi üzerinde hipokampal sinir hücrelerinin yetiştirilmesi. Görüntüler, 14 gün boyunca kültürde yetiştirilen ve GFAP (kırmızı, glial hücreler), MAP2 (yeşil, nöronal soma ve dendritler), DAPI (mavi, hücre çekirdekleri) ile boyanmış 0-3 günlük sıçan yavrusu hipokampisinden ekstrakte edilen hücreleri göstermektedir. (A) Matrisin yokluğunda hücrelerin faz kontrast görüntüsü. (B) Mercan iskelet matrisinde yetiştirilen hücrelerin faz kontrast görüntüsü. (C) DAPI ile boyanmış matris olmadan yetiştirilen hücreler. (D) DAPI ile boyanmış mercan iskelet matrisi üzerinde yetiştirilen hücreler. (E) MAP2 için boyanmış matrisin yokluğunda büyüyen hücreler. (F) MAP2 için boyanmış mercan iskelet matrisi üzerinde yetiştirilen hücreler. (G) GFAP için boyanmış matris olmadan yetiştirilen hücreler. (H) GFAP için boyanmış mercan iskelet matrisi üzerinde yetiştirilen hücreler. (I) (C),(E),(G)'nin birleştirilmiş görüntüsü. (J) (D),(F),(H)'nin birleştirilmiş görüntüsü. Ölçek = 40 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan teknik, kültürdeki sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu, hücreleri, hücreleri besleyen ve büyümelerini ve aktivitelerini teşvik eden mercan iskelet tanelerinden yapılmış bir matrise yapıştırarak elde edilir. Bu tekniği kullanmak, nöral kültür modelinin beyindeki hücrelerin ortamını taklit etme kapasitesini arttırır.
Matrisin bir kültür substratı olarak tanıtılması, klasik nöral hücre kültürü yöntemlerinde kullanılan diğer substratlara göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, hücre yapışkanlığını arttırır. Mercan iskeleti ve PDL'nin kombinasyonu, cam ve PDL'den (gösterilmemiştir) daha güçlü bir yapışkanlık oluşturur. Yapışkanlıktaki böyle bir artışın, kültürde yapışkan yüzmeyen hücrelerin hayatta kalması için gerekli olduğu gösterilmiştir32. İkincisi, mercan iskelet tanelerinin kalsiyum karbonatlı kristalleri, aslında hücreler tarafından emilen bir kalsiyum iyonu kaynağıdır. Mercan iskelet matrisinde sergilenen nöral hücrelerin artan dayanıklılığının ve artan yoğunluğunun (Şekil 5C, D) nedeninin, yokluğundaki hayatta kalma seviyelerine kıyasla26 olması muhtemeldir.
Üçüncü bir avantaj, mercan iskelet matrisinin, cam örtünün aksine, aslında düzlemsel olmaması gerçeğinde yatmaktadır. Taneler karmaşık, kavisli bir yüzey mimarisi ile 3D olarak yapılandırılmıştır. Bu yapısal özellikler, hücrelerin değişen morfolojilere, boyutlara ve yoğunluklara sahip tahıl popülasyonlarıyla karşı karşıya kaldığı düşünüldüğünde değişir. Böyle kaba ve düzlemsel olmayan bir kültür maddesi, hücrelerin ortamını in vivo olarak klasik düz örtüden daha iyi taklit eder. Gerçekten de, mercan iskeletinin pürüzlülüğünün, boyutunun ve morfolojisinin hücre dağılımını, hayatta kalmayı ve aktiviteyi etkilediğini gösterdik 8,26,29.
Dahası, bir mercan iskelet matrisinin hücrelere bir mikro ortam olarak sağladığı 3D konfigürasyonu, in vitro 3D büyüme için kullanılan geleneksel hidrojel matrislerinden büyük ölçüde farklıdır. Kollajen ve hyaluronik asit gibi hidrojeller kullanıldığında, hücreler jel23'ün içine gömülür. Jel, boşluk dolumu, sertlik ve diğer özellikler açısından hücre dışı matrise benzer, ancak jellerin viskozitesi nedeniyle, bu kültürler hücreleri iyi beslemek için karmaşık besleme sistemleri gerektirir21,22. Buna karşılık, mercan iskeleti 3D taneleri, hücrelerin kültür ortamına tamamen açık olan yüzeylerini işgal etmelerini sağlar. Ayrıca, hidrojel kültürlerinin aksine, mercan iskelet matrisi üzerindeki hücreler faz ve floresan mikroskobu ile kolayca izlenir.
Bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. Yukarıda listelenen avantajlara rağmen, mercan iskeleti bir biyomalzemedir ve imal edilemez, ancak ölü mercanlardan toplanır, bu da bazıları ticari olarak mevcut olmasına rağmen, matris tedarikinde sınırlamalara neden olur. Ayrıca, birden fazla mercan türünün iskeletlerinin kullanılması, kültür özelliklerinde farklılıklar yaratabilir. Öte yandan, mercan iskelet kristallerinin hepsinin tek bir maddeden, aragonitten yapılmış olması ve taneciklerin boyutunun kontrol edilebilmesi, matrisler arasındaki kimyasal ve yapısal çeşitliliğin çoğunu ortadan kaldırmaktadır. Test edilen tüm biyomalzemelerin taneleri, hücreleri üç boyutlu olarak büyümeye zorlayacak kadar büyüktür. Hücreler8 tanelerine tırmanır, kristallerin uçlarına yapışarak büyür33 ve taneler arasında çapraz27. Alternatif olarak, fosil çökeltilerinden ve sentetik kalsiyum karbonattan yapılmış jeolojik aragonit, ticari olarak temin edilebilir ve bir matris olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, cam kapaklara daha az yapışma gösterebilir.
Birden fazla mercan türünün kullanılması göz önüne alındığında, bazı çalışmaların mercanların biyomineralizasyonuna dair kanıtlar gösterdiğine dikkat etmek önemlidir, bu da kalsiyum karbonat kristalleri arasında çeşitli organik birikintilerin varlığına yol açabilir. Bunlar, bu protokol33,34'te açıklanan temizleme işlemi kullanılarak kaldırılamaz. Bu gerçek, biyolojik uygulamalar için bir biyomateryali tanımlarken çok önemlidir. Bu çalışmada, iskelenin mümkün olduğunca homojenliğini sağlamak için daha önce birkaç adım gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, matrisler için üç tür mercan test edildi: Porites Lutea, Stylophora Pistillata ve Trachyphyllia Geoffroyi. Bu mercan iskeletlerinde nöral hücrelerin büyümesi ve hayatta kalması açısından önemli bir değişiklik olmadı. Bu sonuç, iskelet içindeki farklı organik birikintilerin bu durumda önemli bir etkiye sahip olmadığını gösterebilir. İkincisi, temiz mercan iskeletinin Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi, organik kalıntıların bulunmadığını gösterdi29.
Protokol içerisinde dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar bulunmaktadır. İlk olarak, taneleri manuel olarak elerken, süzgeçler tıkanma eğiliminde olduğundan, süzgecin zaman zaman değiştirilmesi önerilir. Elektrikli süzgeç, eleme sırasında daha fazla kuvvet kullanır. Bu nedenle, kolayca tıkanma eğiliminde değildir. İkincisi, PDL-mercan taneleri karışımını bulaşıklara ve kapaklara dağıtırken, tanelerin batmasını önlemek için karışımı sık sık pipetlemek önemlidir. Bu, çözeltinin homojen bir şekilde dağılmasını sağlayacaktır. Tanelerin kapaklara bağlanma işlemine dikkat etmek önemlidir. Cam kapak kaymasına tahıl tutturulması sırasında yanlış ısıtma sıcaklıkları, titreşimler ve diğer faktörler, tanelerin hücre tohumlamasından önce veya sonra ayrılmasına neden olabilir. Sıcaklığı dikkatlice kontrol ederek ve titreşimleri en aza indirerek bu sorunun çözülmesi önerilir. Ayrıca, deneylerin şişeleri ve bulaşıkları kapladıktan sonra belirli bir zamanda yapılması tercih edilir. Bulaşıkları kültürden bir gün önce taze kaplamanızı öneririz. PDL-tahıl karışımı ile bulaşıkların uzun süreli inkübasyonu, yemeğe bağlı tanelerin miktarında çeşitliliğe neden olabilir.
Yukarıda tarif edilen tekniğin bazı modifikasyonları, kültürlenmiş hücrelerin ihtiyaçlarına göre mümkündür. Kültürdeki sinir hücrelerinin büyümesini iyileştirme kapasitesine ek olarak, mercan iskelet matrisleriosteositlerin 30,31, hepatositlerin ve kardiyomiyositlerin büyümesini destekler (yayınlanmamış veriler). Diğer hücre tiplerinin kültür dayanıklılığını arttırmak için, farklı mercan tiplerinin iskeletlerine en güçlü hücre reaksiyonunu kontrol etmenin yanı sıra tanelerin boyutunu ve yoğunluğunu optimize etmeniz önerilir.
Nöral hücreleri ek kaplama olmadan doğrudan tahıllar üzerinde büyütmek de mümkündür. Bununla birlikte, tanelerin PDL ile ön kaplaması, bu protokolde (adım 5) belirtildiği gibi, PDL kaplı cam ile elde edilen seviyelerin üzerinde, sinir hücrelerinin yapışmasını ve hayatta kalmasını büyük ölçüde artırır. Farklı hücre tiplerinin tercihine göre diğer kaplama malzemelerinin kullanılması da mümkündür.
Matristeki tanelerin boyutunun sınırlı olduğunu belirtmekte fayda var. Belirli bir eşiğin üzerinde, yaklaşık 200 μm, onları cam kapaklara bağlamak zorlaşır. Bu nedenle, matris yüzeyinin pürüzlülüğü sonlu bir aralığa sahiptir. Daha büyük tanecikler veya iskelet parçaları gerektiren deneyler bu teknik için uygun değildir. Belki de yapıştırıcılar veya jeller kullanarak daha büyük taneleri bağlamak için alternatif bir yol bulunabilir, ancak bu, tahıllarla hücre temasını gizleyebilir. Diğer bir olasılık, hücreleri öğütmeden doğrudan iskelet üzerinde yetiştirmektir. Bu yöntem, hücre tohumlama prosedürünün24,27 değiştirilmesini gerektirir. Öğütülmemiş mercan iskeletinin 3D yapısı,26'dan önce bildirdiğimiz gibi nöral hücre hayatta kalmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, böyle karmaşık ve yoğun bir matris mikroskopinin çalışmasını zorlaştırır. Zemin iskeletinin tehlikeye atılmış kurulumu, iskeletin kimyasal özelliklerini korur, 2D mikroskopi analizini mümkün kılar ve tanelerin büyüklüğü nedeniyle, hücreleri 3D8'de büyümeye zorlar.
Ayrıca, mercan iskelet tanelerinin fazlalığı toksik olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, mercan iskelet matrisinin kalsiyum bileşeni hücreler tarafından emilir35. Yüksek tane yoğunluğunun neden olduğu kalsiyum fazlalığı, sinir hücrelerinde olduğu gibi bazı hücre tipleri için bir yük veya hatta inhibitör olabilir36. Bu nedenle, her hücre tipi için tane yoğunluğunun azaltılması gerekebilir ve optimize edilebilir. Ek olarak, mercan iskeleti mevcudiyetinin sınırlı olabileceğini hatırlamak önemlidir. Mercanlar akvaryumlarda ve doğal ortamlarında yavaş büyür. Büyümeleri, küresel ısınma ve okyanus asitlenmesinin bir sonucu olarak daha da bodurdur37. Bu nedenle, mercan iskeletlerinin bolluğu ve mevcudiyeti sınırlıdır.
Kültürdeki mercan iskelet taneleri ile temas ettiğinde ayrışmış sinir hücrelerinin güçlendirilmesi, nörobiyolojide araştırma için yeni yollar açar. Hücresel büyüme, nöritik genişleme ve çarpmanın yanı sıra sinaptogenez ve sinaptik plastisite, arttırılmış yoğunluk ve uzun deneysel süre ile incelenebilir.
Ayrıca, mercan matrisinin, glial hücrelerin büyüme, reaktivite ve proliferasyon gibi bazı hücresel işlevlerinde bir artışa neden olduğu görülmektedir. Bu nedenle, bu koşulların, dissosiyasyonlu nöral kültür ortamını salgılanan trofik faktörlerle zenginleştirmek için astrositik kapasiteyi arttırması da mümkündür; bu, merkezi sinir sisteminin rejeneratif tıbbı için uygulanabilir olabilecek bir şeydir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma İsrail Ticaret ve Çalışma Bakanlığı'nın KAMIN programı ve Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, ABD tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L - glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R.
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
