Summary
Vi præsenterer en protokol ved hjælp af høj opløsning mikro-computertomografi billedbehandling at afgøre, om rumflyvning induceret skade på okulære strukturer. Protokollen viser mikro-CT-afledt måling af ex vivo gnaver okulære strukturer. Vi demonstrerer evnen til at vurdere okulære morfologiske ændringer efter rumflyvning ved hjælp af en ikke-destruktiv tridimensional teknik til at vurdere øjenskader.
Abstract
Rapporter viser, at langvarig eksponering for et rumflyvningsmiljø medfører morfologiske og funktionelle oftalmologiske ændringer i astronauter under og efter en international rumstation (ISS) mission. De underliggende mekanismer i disse rumflyvningsinducerede ændringer er imidlertid på nuværende tidspunkt ukendte. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære strukturer ved at evaluere tykkelsen af musethinden, nethindepigmentepitel (RPE), choroid og scleralaget ved hjælp af mikro-CT-billeddannelse. Ti uger gamle C57BL/6 mandlige mus blev anbragt ombord på ISS for en 35-dages mission og derefter vendte tilbage til Jorden i live til vævsanalyse. Til sammenligning blev jordkontrolmus (GC) på Jorden opretholdt under identiske miljøforhold og hardware. Okulære vævsprøver blev indsamlet til mikro-CT-analyse inden for 38(±4) timer efter splashdown. Billederne af tværsnittet af nethinden, RPE, choroid, og sclera lag af det faste øje blev registreret i en aksial og sagittal visning ved hjælp af en mikro-CT imaging erhvervelse metode. Mikro-CT-analysen viste, at tværsnitsområderne i nethinden, RPE og choroidlagtykkelsen blev ændret i rumflyvningsprøver sammenlignet med GC, hvor rumflyvningsprøver viste betydeligt tyndere tværsnit og lag sammenlignet med kontroller. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at mikro-CT evaluering er en følsom og pålidelig metode til at karakterisere okulære struktur ændringer. Disse resultater forventes at forbedre forståelsen af miljøbelastningens indvirkning på de globale okulære strukturer.
Introduction
I rumflyvningens mikrotyngdekraftsmiljø kan øget intrakranielt tryk (ICP) forårsaget af væskeskift have bidraget til rumflyvnings-associeret neuro-okulært syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktisk har over 40% af astronauter oplevet SANS under og efter en International Space Station (ISS) mission6, herunder rumflyvning genstand for NASA Twins Study7. Den nuværende patofysiologi af SANS omfatter fysiologiske ændringer såsom optisk disk ødem, kloden udfladning, choroidal og retinale folder, hyperopiske brydning fejlskift, og nervefiber lag infarkter (dvs. vat pletter) og er veldokumenteret5,8. De underliggende mekanismer i de ændringer og faktorer, der bidrager til udviklingen af skader, er imidlertid uklare. For at få en bedre forståelse af SANS, dyremodeller er tilgængelige for at karakterisere rumflyvning-associerede ændringer i retinale struktur og funktion.
I en tidligere undersøgelse af de samme dyr, rapporterede vi virkningen af 35 dages rumflyvning på musen nethinden. Resultaterne belyse, at rumflyvning inducerer betydelig skade i nethinden og retinal vaskulatur, og nogle proteiner / veje forbundet med celledød, inflammation og metabolisk stress blev væsentligt ændret efter rumflyvning9.
I øjeblikket er der en række noninvasive imaging teknikker etableret for at overvåge sygdomsudvikling og progression, samt fysiologiske reaktioner på forskellige miljømæssige stressfaktorer, som også er meget udbredt i små gnavere modeller. En af disse teknikker er mikro-CT, som evaluerer anatomiske strukturer og patologiske processer, og har med succes været anvendt på organismer så små som mus10.
Mikro-CT kan opnå en mikrosized opløsning, og det kan give høj kontrast til volumetrisk analyse af blødt væv med tilføjelse af den relevante kontrastmiddel10,11,,12,13,14. Mikro-CT-teknologi er fordelagtig i forhold til traditionelle metoder såsom grov anatomi, lys mikroskopi, og histologi undersøgelse, da det minimerer fysisk skade på den geometriske profil af prøverne og ændrer ikke det rumlige forhold mellem strukturer. Desuden kan tre-dimensionelle (3D) modeller af strukturer rekonstrueres fra mikro-CT-billeder12,14. Til dato, på trods af dokumentation for synsnedsættelse efter eksponering for rummiljøet, er der kun få data i dyremodeller til rådighed for en bedre forståelse af rumflyvningsrelaterede ændringer i retinale struktur og funktion. I den nuværende undersøgelse blev mus fløjet på en 35-dages mission ombord på ISS for at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære vævsstrukturer ved at kvantificere mikrostrukturen i nethinden, RPE og choroidlagene ved hjælp af mikro-CT.
Protocol
Undersøgelsen fulgte anbefalingerne i vejledningen om pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH) og blev godkendt af både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Loma Linda University (LLU) og The National Aeronautics and Space Administration (NASA). Mere detaljerede oplysninger om dette flyveeksperiment findes andresteder 9,15.
1. Flyve- og kontrolforhold
BEMÆRK: En 12th Commercial Resupply Service (CRS-12) nyttelast blev lanceret af SpaceX på Kennedy Space Center (KSC) på en 35-dages mission i august 2017, som omfattede ombord 10-uger gamle mandlige C57BL/6 mus (n = 20) for NASAs niende Gnavere Research eksperiment (RR-9).
- Før du vender tilbage til Jorden via SpaceX's Dragon kapsel, har musene bor i NASAs Gnavere Habitats (RH) ombord ISS i 35 dage ved en omgivende temperatur på 26-28 °C med en 12-timers lys / mørk cyklus under hele flyvningen.
- Placer Ground Control (GC) mus i samme kabinet hardware, der anvendes i flyvningen og matche miljømæssige parametre såsom temperatur og kuldioxid (CO2)niveauer så tæt som muligt baseret på telemetri data.
- Feed GC mus samme NASA food bar kost som deres rumbaserede kolleger. Giv både rumflyvning og GC mus med samme ad libitum adgang til vand og mad.
2. Efter flyvning evaluering af mus
- Inden for 28 timer efter splashdown på Jorden, transportere musene til Loma Linda University (LLU). Når musene er der, fjernes de fra dyrets indhegningshardware, og der skal vurderes, om der er overlevelse og sundhed.
BEMÆRK: Efter observation rapporterede inspektionspersonalet, at alle mus havde overlevet 35-dages rummissionen og var i god stand, dvs.
3. Dissekere og bevarelse af museøjne efter rumflyvning
- Inden for 38(±4) timer efter splashdown (n=20/gruppe) aflives musene i 100% CO2 og indsamle deres øjne.
- Disseker højre øjenhæninaer og læg dem individuelt i sterile kryovialer, fastfrysning i flydende nitrogen, og hold den ved −80 °C før brug.
- Fastgør hele venstre øjne i 4% paraformaldehyd i fosfat-bufferet saltvand (PBS) i 24 timer og skyl derefter med fosfat-bufferet saltvand (PBS) for mikro-CT-analyser.
4. Prøveforberedelse til mikro-CT-scanning
- Efter fiksering, dehydrere musenes øjne i ethanol. For at forhindre yderligere eller brat svind af den faste prøve skal der anvendes en sorteret serie ethanolopløsninger: begyndende med 50 % ethanol i 1 time og derefter øge koncentrationerne af ethanolopløsningerne som følger i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100 %.
BEMÆRK: Musenes øjne skal håndteres i et hættekammer. - Farvning af fosforolsyre (PMA)
FORSIGTIG: På grund af, at PMA er ætsende, kræftfremkaldende og giftig for organer, er passende beskyttelse af personlige midler nødvendigt, herunder brug af en røghætte.- Forbered farvningsopløsningen: 10 mg PMA i 100 ml absolut ethanol.
- Pletten musenes øjne (10 wt. % fosfofalybdisk syre - PMA opløst i absolut ethanol) i 6 dage.
- Før scanning skal du først vaske øjenprøverne i absolut ethanol og derefter placere hvert øje i individuelle 2 ml plastbeholdere, der er fyldt med 100% absolut ethanol. Tilføj en vatrondel til stabiliserede prøver under scanningen.
5. Mikro-CT scanning og analyse
BEMÆRK: SkyScan 1272-scanneren, et røntgen-ray-system til stationære computere, blev brugt til vurdering af retinale skader i musenes øjne
- Monter bløddelsprøven på en passende prøveholder. For at undgå bevægelse under røntgen-CT-målingerne skal prøven sikres en tætsiddende plads på holderen (figur 1).
- Efter omhyggelig justering af hver prøve, individuelt scanne prøven via røntgenstråler.
- Når du har åbnet softwaren, skal du centrere prøven i rammen. I protokollen skal du ikke bruge noget filter og indstille matrixen til at øge pixlen til 4 μm. Brug mikropositionering til at holde prøven centreret på rammen.
- Derefter skal du kontrollere parameteren for at maksimere kontrastmidlet. Hvis du vil udføre kalibreringen, skal du fjerne eksemplet og kontrollere, at flat-field-korrektionen er større end 80 %.
- Efter kalibrering skal prøven sættes i igen i scanningskammeret. Til scanning skal du bruge et rotationstrin på 0,400, en ramme med et gennemsnit på 4, en tilfældig bevægelse på 30 og rotere prøverne 180°.
- Brug en positionering jig til gentagne målinger. På grund af fase-kontrast ekstraudstyr udført som beskrevet, objekt detaljer så små som 4 μm kan påvises fra røntgenstråler genereret af en forseglet mikro-fokus X-ray rør (wolfram anode) på 50 keV og 80 mA med en integration tid på 90 minutter.
BEMÆRK: De anskaffelsesparametre, der er fastlagt i dette afsnit for udvælgelse for at producere CT-scanninger med den højeste billedkvalitet. - Efter scanning skal du bruge software (f.eks.
- Juster histogrammet, og brug det samme område (0 – 0,24) til alle prøverne. Rekonstruere region af interesse var en cirkel, og ingen skalaer eller etiketter blev brugt.
- For at reducere artefakter under scanningen skal du bruge en strålehærdende korrektion på 20, en udjævningskorrektion på 1, en ringartefakt reduktion på 6, og udføre ingen ændring i forskydningskompensationen. Efter genopbygningen blev det bekræftet, at stikprøven lå i den pågældende region.
- Flyt billeder ved hjælp af et plan parallelt med synsnerven og linsen i øjnene.
- Når du har scannet, skal du bruge software (f.eks.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, med denne software, kan billederne re-placeret ved hjælp af et fly parallelt med synsnerven og linse af øjnene til at udføre en standardiseret analyse. - Beskrivende analyse
- Mål strukturerne ved hjælp af et måleværktøj i softwaren (f.eks. Brug den optiske nerve til at afgrænse området af interesse for analyse. Ved beregning brugte protokollen det midterste udsnit til at udføre målingerne. Denne evaluering blev udført ved beskrivende analyse (figur 2 og figur 3).
- Der udføres målinger af nethinden, retinal pigmentepitel (RPE), choroid og scleralaget i sagittal (Figur 2) og aksial visning (Figur 3). Tag tre målinger af hver struktur for at beregne et gennemsnit.
Representative Results
Den gennemsnitlige tykkelse af nethinden, RPE, choroid og sclera lag blev registreret ved hjælp af mikro-CT-scanninger efter at have fulgt protokollen ovenfor (Figur 1). Teknikken viste en multiplanær rekonstruktion af øjnene i tre forskellige synspunkter. Under analysen var observatøren i stand til at rulle gennem hele prøven for at standardisere analysen lige midt i prøven.
Mikro-CT-analysen viste tværsnitsområderne i øjnene i sagittal- og aksial visning (figur 2 og figur 3), hvor de lineære målinger blev udført. RPE- og choroidlaget var betydeligt eller lavere i rumflyvningsgruppen sammenlignet med GC-gruppen (Figur 3).
Figur 1: Mikro-CT-procedure for blødt væv. (A) Bløddelsprøve (museøje). bB) Prøverne blev fastsat i 4 % formaldehyd i fosfatbufferopløsning (PBS). Efter fikseringen blev musenes øjne dehydreret i ethanol. For at forhindre en yderligere og brat svind af den faste prøve blev der anvendt en sorteret serie ethanolopløsninger, begyndende med 50 % ethanol i 1 time og følgende ethanolopløsninger i de anførte koncentrationer i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100 %. (C) Musenes øjne blev plettet i fosforlydsyre (PMA) i 6 dage, vasket i absolut ethanol og derefter placeret i individuelle 2 ml plastbeholdere fyldt med absolut ethanol. (D) En desktop X-ray mikro-CT-system scanner blev brugt til at vurdere retinale skade i mus øjne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sagittal visning af en jordkontrol mus. Lag af øjet på højre side af billedet er kommenteret, fra top-til-bund, nethinden (0,077 mm), nethinden pigment lag (RPE, 0,038 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Aksial visning af en jordkontrolmus. Lag af øjet på højre side af billedet er kommenteret, fra top-til-bund, nethinden (0,144 mm), nethinde pigment lag (RPE, 0,051 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gennemsnitlig tykkelse af retinale lag, RPE lag, og choroid lag målt ved mikro-CT i rumflyvning og kontrolgrupper. Optællingerne blev i gennemsnit fordelt på fem nethiner pr. gruppe. Værdierne var repræsenteret som middeltykkelse ± standardfejl (SEM). SEM af middelværdien er markeret med fejllinjer. Markant lavere i tværsnitstykkelsen i flt-gruppen (spaceflight) sammenlignet med gruppen med jordkontrol (GC) er angivet '*' (p < 0,05). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Resultaterne af denne undersøgelse viste, at der var strukturelle ændringer i rumflyvning mus øjet ved hjælp af mikro-CT teknik i forhold til GC grupper, især af nethinden, RPE, og choroid lag af øjet, som det fremgår af deres nedsat tykkelse. Micro-CT giver en effektiv og ikke-destruktiv teknik til at karakterisere ændringerne uden behov for manipulation. Brugen af PMA farvning forbedret kvaliteten af mikro-CT billeder til at opnå klare 3D tomografiske billeder efter rekonstruktion, ovenstående ethvert behov for fysisk at ændre strukturen af prøven. En ekstra fordel ved disse billeder er, at de viser hele interesseområdet digitalt, hvilket øger tilgængeligheden samt reproducerbarheden af resultaterne. Gennem mikro-CT-billeder produceret i løbet af denne undersøgelse, den målrettede prøve viste differentiering af de mange strukturer som nethinden, RPE, choroid, og sclera lag til bestemmelse af tykkelsen af hvert lag.
Et kritisk skridt i protokollen er manipulation af prøverne på grund af deres størrelse og tekstur. Håndteringen af prøven skal udføres omhyggeligt uden at lægge pres på prøven under præparatet. Mikro-CT har nogle begrænsninger: opløsning og manglen på standardiserede værdier for parametrene. Under scanningen kan de forskellige mikro-CT-scannere have forskellige billedbehandlingsalgoritmer; alligevel kalibrering for en gråtoner kan forfølges for at overvinde ethvert problem. Efter scanning, rekonstruktion af billederne bør være baseret på væv og den analyse, der vil blive udført. Det kan være kritisk, da billedkvaliteten afhænger af det tomografiske system, indstillingerne, prøvestørrelsen samt tilberedningsmetoderne16,17.
På grund af sin vellykkede anvendelse i at studere flere typer af normale og patologiske væv, mikro-CT billeddannelse kapaciteter bør anvendes i fremtidig forskning til at udarbejde volumetriske data til andre analyser. På grundlag af denne undersøgelses formål var det således acceptabelt at anvende bidimensionale målinger, men segmentering af brutto3D-strukturen kan også være gavnligt at give en præcis oversigt over hele prøven. Selv med alle fordelene ved en ikke-destruktiv teknik, mikro-CT vil ikke erstatte andre metoder såsom immunohistochemistry, men vil supplere og tillade efterfølgende histologi analyser, hvis det ønskes.
En langvarig rumflyvning tilstand producerer en række strukturelle og funktionelle okulære ændringer i astronauterne under og efter rummission defineret som SANS. Resultaterne omfatter hyperopiske skift, kloden udfladning, choroidal / retinal folder, og vat pletter19. I modsætning til astronauternes optiske sammenhæng tomografi (OCT) konstatering af retinale nerve fiber lag fortykkelse, udtynding af nethinden og choroidal lag blev dokumenteret i dette dyr mikro-CT-undersøgelse. Disse resultater var uventede. Denne uoverensstemmelse kan skyldes konfunderende faktorer. Mus har begrænset cephalad væske skift i forhold til mennesker. Denne mangel på væskeskift kan have fremkaldt forskellige reaktioner på tyngdekraftsændringer. For det andet blev mus dissekeret inden for 38 timer efter stænk ned, og en akut respons for re-tilpasning kan også bidrage til morfologiske ændringer i nethinden og choroid. Bekræftelse af denne mulighed kræver yderligere målinger under rumflyvning og lang sigt efter missionen.
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at rumflyvningsforhold, især gravitationelle ændringer, kan fremkalde en akut og kortsigtet respons i øjet. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå konsekvenserne af de akutte ændringer på okulær på retinale funktion og mekanisme af rumflyvning-induceret struktur ændringer.
Disclosures
Alle forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NASA Space Biology grant # NNX15AB41G og LLU Institut for Grundlæggende Videnskaber. Sungshin Choi, Dennis Leveson og Rebecca Klotz bidrog væsentligt til succesen med vores rumflyvningsundersøgelse, og vi sætter stor pris på deres støtte. Forfatterne vil også gerne takke hele NASA Biospecimen Sharing Program gruppe for deres store hjælp.
Forfatterne vil også gerne takke Center for Dental Research for Micro-CT service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
