Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit hochauflösender Mikro-Computertomographie-Bildgebung, um festzustellen, ob die Raumfahrt Schäden an Augenstrukturen verursacht hat. Das Protokoll zeigt die mikro-CT-abgeleitete Messung von ex vivo Nagetier-Augenstrukturen. Wir zeigen die Fähigkeit, okuläre morphologische Veränderungen nach der Raumfahrt mit einer zerstörungsfreien dreidimensionalen Technik zur Bewertung von Augenschäden zu bewerten.
Abstract
Berichte zeigen, dass eine längere Exposition gegenüber einer Raumflugumgebung morphologische und funktionelle ophthalmologische Veränderungen bei Astronauten während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS) verursacht. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser durch die Raumfahrt induzierten Veränderungen sind jedoch derzeit unbekannt. Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss der Raumflugumgebung auf die Augenstrukturen zu bestimmen, indem die Dicke der Mausnetzhaut, des retinalen Pigmentepithels (RPE), der Aderhaut und der Skleraschicht mittels Mikro-CT-Bildgebung bewertet wurde. Zehn Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse wurden an Bord der ISS für eine 35-tägige Mission untergebracht und kehrten dann lebend zur Gewebeanalyse zur Erde zurück. Zum Vergleich: Bodenkontrollmäuse (GC) auf der Erde wurden unter identischen Umgebungsbedingungen und Hardware gehalten. Augengewebeproben wurden für Mikro-CT-Analysen innerhalb von 38(±4) Stunden nach dem Splashdown gesammelt. Die Bilder des Querschnitts der Netzhaut, des RPE, der Aderhaut und der Skleraschicht des fixierten Auges wurden in einer axialen und sagittalen Ansicht mit einem Mikro-CT-Bildaufnahmeverfahren aufgezeichnet. Die Mikro-CT-Analyse zeigte, dass die Querschnittsbereiche der Netzhaut, RPE und Der Aderhautschichtdicke in Raumflugproben im Vergleich zu GC verändert wurden, wobei Raumflugproben im Vergleich zu Kontrollen deutlich dünnere Querschnitte und Schichten zeigten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Mikro-CT-Evaluierung eine empfindliche und zuverlässige Methode zur Charakterisierung von Veränderungen der Augenstruktur ist. Diese Ergebnisse sollen das Verständnis der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf globale Augenstrukturen verbessern.
Introduction
In der Mikrogravitationsumgebung der Raumfahrt kann ein erhöhter intrakranieller Druck (ICP), der durch Flüssigkeitsverschiebung verursacht wird, zum Raumflug-assoziierten neurookulären Syndrom (SANS)1,2,3,4,5beigetragen haben. Tatsächlich haben über 40% der Astronauten SANS während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS)6erlebt, einschließlich des Raumflugthemas der NASA-Zwillingsstudie7. Die aktuelle Pathophysiologie von SANS umfasst physiologische Veränderungen wie optische Sscheibenödeme, Globe-Flattening, Aderoid- und Netzhautfalten, hyperopic refraktive Fehlerverschiebungen und Nervenfaserschichtinfarkte (d.h. Watteflecken) und sind gut dokumentiert5,8. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Veränderungen und Faktoren, die zur Entwicklung von Schäden beitragen, sind jedoch unklar. Um SANS besser verstehen zu können, stehen Tiermodelle zur Verfügung, um die raumfliegenassoziierten Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion zu charakterisieren.
In einer früheren Untersuchung an denselben Tieren berichteten wir über die Auswirkungen von 35 Tagen Raumfahrt auf die Netzhaut der Maus. Die Ergebnisse erklären, dass die Raumfahrt erhebliche Schäden in der Netzhaut und Netzhautvaskulatur induziert, und einige Proteine/Wege, die mit Zelltod, Entzündungen und metabolischem Stress verbunden sind, wurden nach der Raumfahrt signifikant verändert9.
Derzeit gibt es eine Vielzahl von nichtinvasiven bildgebenden Verfahren zur Überwachung der Krankheitsentwicklung und -progression sowie physiologische Reaktionen auf verschiedene Umweltstressoren, die auch in kleinen Nagetiermodellen weit verbreitet sind. Eine dieser Techniken ist micro-CT, die anatomische Strukturen und pathologische Prozesse bewertet und erfolgreich auf Organismen so klein wie Mäuse10eingesetzt wurde.
Micro-CT kann eine Mikro-Auflösung erreichen, und es kann einen hohen Kontrast für die volumetrische Analyse von Weichteilen mit der Zugabe des geeignetenKontrastmittels 10,11,12,13,14bieten. Die Mikro-CT-Technologie ist im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie Grobanatomie, Lichtmikroskopie und Histologie-Untersuchung von Vorteil, da sie physikalische Schäden am geometrischen Profil der Proben minimiert und das räumliche Verhältnis zwischen Denstrukturen nicht verändert. Darüber hinaus können dreidimensionale (3D) Strukturen aus Mikro-CT-Bildern12,14rekonstruiert werden. Trotz der Hinweise auf Sehbehinderungen nach expositionsunfähiger Weltraumumgebung stehen bisher nur wenige Daten in Tiermodellen zur Verfügung, um die mit der Raumfahrt verbundenen Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion besser zu verstehen. In der aktuellen Studie wurden Mäuse auf einer 35-tägigen Mission an Bord der ISS geflogen, um die Auswirkungen der Raumflugumgebung auf die Augengewebestrukturen zu bestimmen, indem die Mikrostruktur der Netzhaut, des RPE und der Aderhautschichten mit Mikro-CT quantifiziert wurden.
Protocol
Die Studie folgte den Empfehlungen des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH) und wurde sowohl vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Loma Linda University (LLU) als auch von der National Aeronautics and Space Administration (NASA) genehmigt. Ausführlichere Informationen zu diesem Flugexperiment finden Sie an anderer Stelle9,15.
1. Flug- und Kontrollbedingungen
HINWEIS: Ein 12. Kommerzieller Nachschubdienst (CRS-12) Nutzlast wurde von SpaceX im Kennedy Space Center (KSC) auf einer 35-tägigen Mission im August 2017 gestartet, die an Bord der 10 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäuse (n = 20) für das neunte Nagetierforschungsexperiment (RR-9) der NASA gehörte.
- Bevor sie über die Dragon-Kapsel von SpaceX zur Erde zurückkehren, lassen Sie die Mäuse 35 Tage lang in den NAGEtier-Habitaten (RH) der NASA an Bord der ISS bei einer Umgebungstemperatur von 26–28 °C mit einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus während des gesamten Fluges leben.
- Platzieren Sie Ground Control (GC)-Mäuse in die gleiche Gehäusehardware, die im Flug verwendet wird, und stimmen Sie Aufderstraßenwiefern (CO2) auf der Grundlage von Telemetriedaten so genau wie möglich mit Umweltparametern wie Temperatur und Kohlendioxid(CO2)überein.
- Füttern Sie GC-Mäuse die gleiche NASA-Lebensmittelriegel-Diät wie ihre weltraumgestützten Pendants. Bieten Sie sowohl der Raumfahrt als auch den GC-Mäusen den gleichen ad libitum-Zugang zu Wasser und Nahrung.
2. Bewertung der Mäuse nach dem Flug
- Transportieren Sie die Mäuse innerhalb von 28 Stunden nach dem Abschuss auf der Erde zur Loma Linda University (LLU). Dort angekommen, entfernen Sie die Mäuse aus dem Tiergehege Hardware und bewerten für das Überleben und die Gesundheit.
HINWEIS: Bei der Beobachtung berichtete das Inspektionspersonal, dass alle Mäuse die 35-tägige Weltraummission überlebt hatten und sich in einem guten Zustand befanden, d. h. keine auffälligen Mängel/Anomalien.
3. Sezieren und Bewahrung von Mausaugen nach der Raumfahrt
- Innerhalb von 38(±4) Stunden nach dem Abspritzen (n=20/Gruppe), einschläfern sie die Mäuse in 100%CO2 und sammeln ihre Augen.
- Sezieren Sie die Netzhaut des rechten Auges und legen Sie sie einzeln in sterile Kryovials, fangen Sie in flüssigem Stickstoff ein und halten Sie sie vor der Anwendung bei 80 °C.
- Fixieren Sie die gesamten linken Augen in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) für 24 h und spülen Sie dann mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) für Mikro-CT-Assays ab.
4. Probenvorbereitung für Mikro-CT-Scanning
- Nach der Fixierung die Augen der Mäuse in Ethanol dehydrieren. Um eine weitere oder abrupte Schrumpfung der festen Probe zu verhindern, verwenden Sie eine abgestufte Reihe von Ethanollösungen: beginnend mit 50% Ethanol für 1 Stunde und dann Erhöhung der Konzentrationen der Ethanol-Lösungen für jeweils 1 Stunde: 70, 80, 90, 96 und 100%.
HINWEIS: Die Augen der Mäuse müssen in einer Kapuzenkammer behandelt werden. - Phosphomolybdsäure (PMA) Färbung
VORSICHT: Da PMA ätzend, krebserregend und für Organe giftig ist, ist eine geeignete persönliche Schutzausrüstung erforderlich, einschließlich der Verwendung einer Dunstabzugshaube.- Bereiten Sie die Färbelösung vor: 10 mg PMA in 100 ml absolutem Ethanol.
- Die Augen der Mäuse (10 Gew. % Phosphomolybdidsäure - IN absolutem Ethanol gelöstes PMA) 6 Tage lang färben.
- Waschen Sie vor dem Scannen zunächst die Augenproben in absolutem Ethanol und legen Sie dann jedes Auge in einzelne 2 ml Kunststoffbehälter, die mit 100% absolutem Ethanol gefüllt sind. Fügen Sie ein Wattepad zu stabilisierten Proben während des Scans hinzu.
5. Micro-CT-Scannen und -Analyse
HINWEIS: Der SkyScan 1272 Scanner, ein Desktop-Röntgen-Mikro-CT-System, wurde zur Bewertung von Netzhautschäden in den Augen der Mäuse verwendet
- Montieren Sie die Weichgewebeprobe an einem geeigneten Probenhalter. Um bewegungen während der Röntgen-CT-Messungen zu vermeiden, stellen Sie eine enge Passform der Probe auf ihren Halter sicher (Abbildung 1).
- Nach sorgfältiger Ausrichtung der einzelnen Proben scannen Sie die Probe einzeln mit Röntgenstrahlen.
- Nach dem Öffnen der Software zentrieren Sie das Beispiel im Rahmen. Verwenden Sie im Protokoll keinen Filter, und legen Sie die Matrix fest, um das Pixel auf 4 m zu erhöhen. Verwenden Sie die Mikropositionierung, um die Probenmitte auf dem Rahmen zu halten.
- Danach überprüfen Sie den Parameter, um den Kontrast-Agent zu maximieren. Um die Kalibrierung durchzuführen, entfernen Sie die Probe, und überprüfen Sie, ob die Flachfeldkorrektur größer als 80 % ist.
- Setzen Sie die Probe nach der Kalibrierung wieder in die Scankammer ein. Verwenden Sie zum Scannen einen Rotationsschritt von 0,400, eine Rahmenmittelwertung von 4, eine zufällige Bewegung von 30, und drehen Sie die Proben um 180°.
- Verwenden Sie eine Positionierungsvorrichtung für wiederholte Messungen. Durch die wie beschrieben durchgeführte Phasenkontrastverbesserung können Objektdetails von bis zu 4 m durch Röntgenaufnahmen nachgewiesen werden, die von einer versiegelten Mikrofokus-Röntgenröhre (Wolframanode) bei 50 keV und 80 mA mit einer Integrationszeit von 90 Minuten erzeugt werden.
HINWEIS: Die Erfassungsparameter, die in diesem Abschnitt zur Auswahl festgelegt sind, um Übersichts-CT-Scans mit höchster Bildqualität zu erstellen. - Verwenden Sie nach dem Scannen Software (z. B. NRecon), um die Daten zu rekonstruieren.
- Passen Sie das Histogramm an und verwenden Sie den gleichen Bereich (0 – 0,24) für alle Proben. Rekonstruieren Region von Interesse war ein Kreis, und keine Skalen oder Beschriftungen verwendet wurden.
- Um Artefakte während des Scannens zu reduzieren, verwenden Sie eine Strahlhärtekorrektur von 20, eine Glättungskorrektur von 1, eine Ringartefaktreduktion von 6, und führen Sie keine Änderung der Fehlausrichtungskompensation durch. Nach dem Wiederaufbau wurde bestätigt, dass die Stichprobe in der Region von Interesse war.
- Positionieren Sie Bilder mit einer Ebene parallel zum Sehnerv und der Linse der Augen.
- Verwenden Sie nach dem Scannen Software (z. B. DataViewer), um die rekonstruierten Bilder in allen drei Ansichten zu visualisieren.
HINWEIS: Bei Bedarf können die Bilder mit dieser Software mit einer Ebene parallel zum Sehnerv und der Augenlinse neu positioniert werden, um eine standardisierte Analyse durchzuführen. - Beschreibende Analyse
- Messen Sie die Strukturen mit einem Messwerkzeug in der Software (z.B. CTAn). Verwenden Sie den optischen Nerv, um den Bereich des Interesses für die Analyse abzugrenzen. Bei der Berechnung verwendete das Protokoll das mittlere Segment, um die Messungen durchzuführen. Diese Auswertung wurde durch eine beschreibende Analyse durchgeführt (Abbildung 2 und Abbildung 3).
- Führen Sie Messungen der Netzhaut-, Retina-Pigmentepithel (RPE), Der Aderhaut und der Skleraschicht in der sagittalen (Abbildung 2) und der axialen Ansicht (Abbildung 3) durch. Nehmen Sie drei Messungen jeder Struktur vor, um einen Durchschnitt zu berechnen.
Representative Results
Die mittlere Dicke der Netzhaut-, RPE-, Aderhaut- und Skleraschicht wurde mit den Mikro-CT-Scans nach dem obigen Protokoll aufgezeichnet (Abbildung 1). Die Technik zeigte eine multiplanare Rekonstruktion der Augen in drei verschiedenen Ansichten. Während der Analyse konnte der Beobachter durch die gesamte Stichprobe scrollen, um die Analyse mitten in der Stichprobe zu standardisieren.
Die Mikro-CT-Analyse zeigte die Querschnittsbereiche der Augen in der sagittalen und axialen Ansicht (Abbildung 2 und Abbildung 3), in denen die linearen Messungen durchgeführt wurden. RPE und Aderhautschicht waren in der Raumfluggruppe signifikant oder im Vergleich zur GC-Gruppe deutlich oder tendenziell niedriger (Abbildung 3).
Abbildung 1: Mikro-CT-Verfahren von Weichgewebe. (A) Weichteilprobe (Mausauge). (B) Proben wurden in 4% Formaldehyd in Phosphatpufferlösung (PBS) fixiert. Nach der Fixierung wurden die Augen der Mäuse in Ethanol dehydriert. Um eine weitere und abrupte Schrumpfung der festen Probe zu verhindern, wurde eine abgestufte Reihe von Ethanollösungen verwendet, beginnend mit 50% Ethanol für 1 h und den folgenden Ethanollösungen in den aufgeführten Konzentrationen, jeweils 1 Stunde: 70, 80, 90, 96 und 100%. (C) Die Augen der Mäuse wurden 6 Tage lang in Phosphomolybdinsäure (PMA) gefärbt, in absolutem Ethanol gewaschen und dann in einzelne 2 ml Kunststoffbehälter mit absolutem Ethanol gefüllt. (D) Ein Desktop-Röntgen-Mikro-CT-Systemscanner wurde verwendet, um die Netzhautverletzung bei Mäuseaugen zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Sagittale Ansicht einer Bodenkontrollmaus. Die Augenschichten auf der rechten Seite des Bildes sind kommentiert, von oben nach unten, Netzhaut (0,077 mm), Netzhautpigmentschicht (RPE, 0,038 mm), Aderhaut (0,041 mm), Sklera (0,059 mm). Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Axialansicht einer Bodenkontrollmaus. Die Augenschichten auf der rechten Seite des Bildes sind kommentiert, von oben nach unten, Netzhaut (0,144 mm), Netzhautpigmentschicht (RPE, 0,051 mm), Aderhaut (0,041 mm), Sklera (0,073 mm). Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Durchschnittliche Dicke der Netzhautschicht, der RPE-Schicht und der Mithautschicht, die mit micro-CT in den Raumflug- und Kontrollgruppen gemessen wird. Die Anzahl der Zählungen wurde auf fünf Netzhaut pro Gruppe gemittelt. Werte wurden als mittlere Dicke ± Standardfehler (SEM) dargestellt. SEM des Mittelwerts ist mit Fehlerbalken gekennzeichnet. Deutlich niedriger in der Querschnittsdicke in der Raumfluggruppe (FLT) im Vergleich zur Gruppe der Bodenkontrolle (GC) wird "*" (p < 0,05) bezeichnet. Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es strukturelle Veränderungen im Raumflug-Mausauge mit der Mikro-CT-Technik im Vergleich zu GC-Gruppen, insbesondere der Netzhaut, der RPE und den Aderhautschichten des Auges gab, wie ihre verminderte Dicke zeigt. Micro-CT bietet eine effiziente und zerstörungsfreie Technik, um die Veränderungen ohne Manipulation zu charakterisieren. Die Verwendung von PMA-Färbung verbesserte die Qualität der Mikro-CT-Bilder, um nach der Rekonstruktion erfolgreich klare 3D-Tomographiebilder zu erhalten, ohne dass die Struktur der Probe physisch verändert werden musste. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Bilder besteht darin, dass sie die gesamte Interessenregion digital anzeigen und damit die Zugänglichkeit sowie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöhen. Durch die mikro-CT-Bilder, die während dieser Studie produziert wurden, zeigte die Zielprobe eine Differenzierung der multiplen Strukturen wie Netzhaut, RPE, Aderhaut und Sklera-Schicht zur Bestimmung der Dicke jeder Schicht.
Ein kritischer Schritt innerhalb des Protokolls ist die Manipulation der Samples aufgrund ihrer Größe und Textur. Die Handhabung der Probe muss sorgfältig erfolgen, ohne die Probe während der Vorbereitung unter Druck zu setzen. Der Micro-CT hat einige Einschränkungen: Auflösung und das Fehlen standardisierter Werte für die Parameter. Während des Scannens können die verschiedenen Mikro-CT-Scanner unterschiedliche Bildverarbeitungsalgorithmen haben; dennoch könnte die Kalibrierung für eine Graustufen-Skala fortgesetzt werden, um jedes Problem zu überwinden. Nach dem Scannen sollte die Rekonstruktion der Bilder auf dem Gewebe und der Analyse basieren, die durchgeführt wird. Es kann kritisch sein, da die Bildqualität vom tomographischen System, den Einstellungen, der Probengröße sowie den Aufbereitungsmethoden16,17abhängt.
Aufgrund seiner erfolgreichen Anwendung bei der Untersuchung verschiedener Arten von normalen und pathologischen Geweben sollten Mikro-CT-Bildgebungsfunktionen in der zukünftigen Forschung verwendet werden, um volumetrische Daten für andere Analysen zu kompilieren. Auf der Grundlage des Zwecks der vorliegenden Studie war es daher akzeptabel, zweidimensionale Messungen zu verwenden, aber die Segmentierung der brutto 3D-Struktur kann auch vorteilhaft sein, um eine genaue Umrisslinie der gesamten Probe zu liefern. Selbst bei allen Vorteilen einer zerstörungsfreien Technik wird micro-CT andere Methoden wie die Immunhistochemie nicht ersetzen, sondern nachfolgende Histologieanalysen ergänzen und auf Wunsch ermöglichen.
Ein längerer Raumflugzustand führt zu einer Reihe struktureller und funktioneller Augenveränderungen bei den Astronauten während und nach der Weltraummission, die als SANS definiert ist. Die Ergebnisse umfassen hyperopic Verschiebungen, Globus-Abflachung, Aderhaut-/Retinafalten und Watteflecken19. Im Gegensatz zur optischen Kohärenztomographie (OCT) der Astronauten wurde in dieser tierischen Mikro-CT-Studie die Erkenntnis der Verdickung der retinalen Nervenfaserschicht, der Ausdünnung der Netzhaut und der Aderhautschicht dokumentiert. Diese Ergebnisse waren unerwartet. Diese Diskrepanz kann auf verwirrende Faktoren zurückzuführen sein. Mäuse haben eine begrenzte Cephalad-Flüssigkeitsverschiebung im Vergleich zum Menschen. Dieser Mangel an Flüssigkeitsverschiebung kann unterschiedliche Reaktionen auf Gravitationsveränderungen heraufbeschworen haben. Zweitens wurden Mäuse innerhalb von 38 Stunden nach dem Splashdown seziert, und eine akute Reaktion auf eine Reanpassung kann auch zu morphologischen Veränderungen in der Netzhaut und Aderhaut beitragen. Die Bestätigung dieser Möglichkeit erfordert weitere Messungen während der Raumfahrt und langfristig nach der Mission.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Bedingungen der Raumfahrt, insbesondere Gravitationsveränderungen, eine akute und kurzfristige Reaktion im Auge hervorrufen können. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Folgen der akuten Veränderungen auf die Netzhautfunktion und den Mechanismus der raumfliegeninduzierten Strukturveränderungen zu bestimmen.
Disclosures
Alle Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das NASA Space Biology-Stipendium NNX15AB41G und das LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson und Rebecca Klotz haben maßgeblich zum Erfolg unserer Raumflugstudie beigetragen und wir schätzen ihre Unterstützung sehr. Die Autoren danken auch der gesamten NASA Biospecimen Sharing Program Gruppe für ihre großartige Unterstützung.
Die Autoren danken auch dem Center for Dental Research for Micro-CT Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
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