Summary
We presenteren een protocol met behulp van hoge-resolutie micro-computertomografie imaging om te bepalen of ruimtevlucht veroorzaakte schade aan oculaire structuren. Het protocol toont de micro-CT-afgeleide meting van ex vivo knaagdier oculaire structuren. We tonen de mogelijkheid om oculaire morfologische veranderingen na de ruimtevaart te beoordelen met behulp van een niet-destructieve driedimensionale techniek om oculaire schade te evalueren.
Abstract
Rapporten tonen aan dat langdurige blootstelling aan een ruimtevlucht omgeving produceert morfologische en functionele oogheelkundige veranderingen in astronauten tijdens en na een International Space Station (ISS) missie. Echter, de onderliggende mechanismen van deze ruimtevlucht geïnduceerde veranderingen zijn momenteel onbekend. Het doel van deze studie was om de impact van de ruimtevlucht omgeving op oculaire structuren te bepalen door de evaluatie van de dikte van de muis netvlies, het netvlies pigment epitheel (RPE), de choroïde en de sclera laag met behulp van micro-CT beeldvorming. Tien weken oude C57BL/6 mannelijke muizen werden ondergebracht aan boord van het ISS voor een 35-daagse missie en vervolgens levend terug naar de aarde voor weefselanalyse. Ter vergelijking, grondcontrole (GC) muizen op aarde werden gehandhaafd in identieke omgevingsomstandigheden en hardware. Oculaire weefselmonsters werden verzameld voor micro-CT-analyse binnen 38(±4) uur na splashdown. De beelden van de dwarsdoorsnede van het netvlies, de RPE, de choroïde en de scleralaag van het vaste oog werden opgenomen in een axiale en sagittale weergave met behulp van een micro-CT-beeldacquisitie-acquisitiemethode. De micro-CT-analyse toonde aan dat de dwarsdoorsnede gebieden van het netvlies, RPE, en choroïde laag dikte werden veranderd in spaceflight monsters in vergelijking met GC, met spaceflight monsters tonen aanzienlijk dunnere dwarsdoorsnedes en lagen in vergelijking met controles. De bevindingen van deze studie geven aan dat micro-CT-evaluatie een gevoelige en betrouwbare methode is om veranderingen in de oculaire structuur te karakteriseren. Deze resultaten zullen naar verwachting het inzicht in de impact van milieustress op de mondiale oculaire structuren verbeteren.
Introduction
In de microzwaartekracht omgeving van de ruimtevaart, verhoogde intracraniale druk (ICP) veroorzaakt door vloeistof verschuiving kan hebben bijgedragen aan ruimtevlucht-geassocieerde neuro-oculair syndroom (SANS)1,2,3,4,5. Meer dan 40% van de astronauten heeft namelijk SANS ervaren tijdens en na een International Space Station (ISS) missie6, inclusief het ruimtevluchtonderwerp van de NASA Twins Study7. De huidige pathofysiologie van SANS omvat fysiologische veranderingen zoals optische schijf oedeem, globe flattening, choroïdale en retinale plooien, hyperopische refractieve foutverschuivingen, en zenuwvezel laag infarcten (dat wil zeggen, watten vlekken) en zijn goed gedocumenteerd5,8. De onderliggende mechanismen van de veranderingen en factoren die bijdragen aan de ontwikkeling van schade zijn echter onduidelijk. Om een beter begrip van SANS te hebben, zijn er diermodellen beschikbaar om de ruimtevluchtgerelateerde veranderingen in de retinale structuur en functie te karakteriseren.
In een eerder onderzoek naar dezelfde dieren, rapporteerden we de impact van 35 dagen ruimtevlucht op het muisnetvlies. De resultaten verduidelijken dat de ruimtevaart aanzienlijke schade veroorzaakt in het netvlies en retinale vasculatuur, en sommige eiwitten / trajecten geassocieerd met celdood, ontsteking en metabole stress werden aanzienlijk veranderd na spaceflight9.
Momenteel zijn er een verscheidenheid van niet-invasieve beeldvorming technieken vastgesteld om de ontwikkeling en progressie van de ziekte te controleren, evenals fysiologische reacties op verschillende milieustressoren, die ook op grote schaal worden gebruikt in kleine knaagdier modellen. Een van deze technieken is micro-CT, die anatomische structuren en pathologische processen evalueert, en met succes is gebruikt op organismen zo klein als muizen10.
Micro-CT kan een gemicrosiseerde resolutie bereiken en kan een hoog contrast bieden voor volumetrische analyse van zachte weefsels met de toevoeging van het juiste contrastmiddel10,11,12,13,14. Micro-CT-technologie is voordelig in vergelijking met traditionele methoden zoals bruto anatomie, lichtmicroscopie en histologieonderzoek, omdat het fysieke schade aan het geometrische profiel van de specimens minimaliseert en de ruimtelijke relatie tussen structuren niet verandert. Daarnaast kunnen driedimensionale (3D) modellen van structuren worden gereconstrueerd uit micro-CT-beelden12,14. Tot op heden zijn er, ondanks gegevens waaruit blijkt dat het gezichtsvermogen na blootstelling aan de ruimteomgeving, weinig gegevens in diermodellen beschikbaar zijn voor een beter begrip van de veranderingen in de retinale structuur en functie van de ruimtevaart. In de huidige studie, muizen werden gevlogen op een 35-daagse missie aan boord van het ISS om de impact van de ruimtevlucht omgeving op oculaire weefselstructuren te bepalen door het kwantificeren van de microstructuur van het netvlies, de RPE, en de choroïde lagen met behulp van micro-CT.
Protocol
De studie volgde de aanbevelingen uiteengezet in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH) en werd goedgekeurd door zowel de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Loma Linda University (LLU) en de National Aeronautics and Space Administration (NASA). Meer gedetailleerde informatie over dit vluchtexperiment is elders te vinden9,15.
1. Vlucht- en controleomstandigheden
OPMERKING: Een 12e Commercial Resupply Service (CRS-12) payload werd gelanceerd door SpaceX in het Kennedy Space Center (KSC) op een 35-daagse missie in augustus 2017 die opgenomen aan boord van 10 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen (n = 20) voor nasa's negende Rodent Research experiment (RR-9).
- Voordat u terugkeert naar de aarde via spacex's Dragon capsule, hebben de muizen leven in NASA's Knaagdier Habitats (RH) aan boord van ISS voor 35 dagen bij een omgevingstemperatuur van 26-28 °C met een 12-uurs licht / donker cyclus gedurende de vlucht.
- Plaats Ground Control (GC) muizen in dezelfde behuizing hardware die wordt gebruikt bij de vlucht en overeenkomen met milieuparameters zoals temperatuur en kooldioxide (CO2)niveaus zo dicht mogelijk op basis van telemetrie gegevens.
- Voer GC muizen hetzelfde NASA food bar dieet als hun ruimte-gebaseerde tegenhangers. Geef zowel de spaceflight als de GC muizen dezelfde ad libitum toegang tot water en voedsel.
2. Evaluatie na de vlucht van de muizen
- Binnen 28 uur na splashdown op aarde, vervoer de muizen naar Loma Linda University (LLU). Zodra er, verwijder de muizen uit de dierlijke behuizing hardware en beoordelen op overleving en gezondheid.
OPMERKING: Bij observatie meldde het inspecterende personeel dat alle muizen de 35-daagse ruimtemissie hadden overleefd en in goede staat waren, d.w.z. geen merkbare tekortkomingen/afwijkingen.
3. Ontleden en bewaren van muisogen na de vlucht
- Binnen 38(±4) uur van splashdown (n=20/groep), euthanaseren de muizen in 100% CO2 en het verzamelen van hun ogen.
- Ontleed het rechteroogvliesvlies en plaats individueel in steriele cryovials, snap-freeze in vloeibare stikstof, en houd op −80 °C voorafgaand aan gebruik.
- Bevestig de hele linkerogen in 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 24 uur en spoel vervolgens af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor micro-CT-testen.
4. Voorbereiding van monsters voor micro-CT-scanning
- Na fixatie dehydrateren van de ogen van de muizen in ethanol. Om verdere of abrupte krimp van het vaste monster te voorkomen, gebruikt u een gesorteerde serie ethanoloplossingen: te beginnen met 50% ethanol gedurende 1 uur en vervolgens de concentraties van de ethanoloplossingen gedurende elk 1 uur te verhogen: 70, 80, 90, 96 en 100%.
LET OP: De ogen van de muizen moeten worden behandeld in een kapkamer. - Fosfolybdiczuur (PMA) kleuring
LET OP: Omdat PMA corrosief, kankerverwekkend en giftig is voor organen, is passende beschermende persoonlijke apparatuur noodzakelijk, waaronder het gebruik van een rookkap.- Bereid de kleuroplossing voor: 10 mg PMA in 100 mL absolute ethanol.
- Bevlek de ogen van de muizen (10 wt. % fosfolybdiczuur - PMA opgelost in absolute ethanol) gedurende 6 dagen.
- Voorafgaand aan het scannen, eerst wassen van de oogmonsters in absolute ethanol en plaats dan elk oog in individuele 2 mL plastic containers die zijn gevuld met 100% absolute ethanol. Voeg een wattenschijfje toe aan gestabiliseerde monsters tijdens de scan.
5. Micro-CT scannen en analyseren
OPMERKING: De SkyScan 1272-scanner, een x-ray micro-CT-systeem op de desktop, werd gebruikt voor de evaluatie van netvliesschade in de ogen van de muizen
- Monteer het zachte weefselmonster op een geschikte monsterhouder. Om beweging tijdens de CT-metingen van de röntgenstraal te voorkomen, moet u zorgen voor een strakke pasvorm van het monster op dehouder (figuur 1).
- Bij zorgvuldige uitlijning van elk monster, individueel scannen van het monster via röntgenfoto's.
- Nadat u de software hebt geopend, centreert u het voorbeeld in het frame. Gebruik in het protocol geen filter en stel de matrix in om de pixel op 4 μm te verhogen. Gebruik micropositionering om het monstercentrum op het frame te houden.
- Controleer daarna de parameter om het contrastmiddel te maximaliseren. Als u de kalibratie wilt uitvoeren, verwijdert u het monster en controleert u of de correctie met een vlak veld groter is dan 80%.
- Na kalibratie het monster opnieuw in de scankamer. Gebruik voor het scannen een rotatiestap van 0,400, een frame van gemiddeld 4, een willekeurige beweging van 30 en draai de monsters 180°.
- Gebruik een positioneringsdrie voor herhaalde metingen. Als gevolg van fase-contrast verbetering uitgevoerd zoals beschreven, object details zo klein als 4 μm kan worden gedetecteerd van x-stralen gegenereerd door een verzegelde micro-focus X-ray buis (wolfraam anode) op 50 keV en 80 mA met een integratietijd van 90 minuten.
OPMERKING: De acquisitieparameters die in deze sectie zijn vastgelegd voor selectie om overzicht CT-scans met de hoogste beeldkwaliteit te produceren. - Gebruik na het scannen software (bijvoorbeeld NRecon) om de gegevens te reconstrueren.
- Pas het histogram aan en gebruik hetzelfde bereik (0 – 0,24) voor alle monsters. Reconstrueren regio van belang was een cirkel, en geen schalen of etiketten werden gebruikt.
- Om artefacten tijdens het scannen te verminderen, gebruikt u een straalverhardingscorrectie van 20, een gladmakende correctie van 1, een ringartefactreductie van 6 en voert u geen wijziging uit in de compensatie voor verkeerde uitlijning. Na de wederopbouw werd bevestigd dat de steekproef was binnen de regio van belang.
- Afbeeldingen verplaatsen met behulp van een vlak parallel aan de oogzenuw en de lens van de ogen.
- Gebruik na het scannen software (bijvoorbeeld DataViewer) om de gereconstrueerde afbeeldingen in alle drie de weergaven te visualiseren.
OPMERKING: Indien nodig, met deze software, kunnen de beelden opnieuw worden gepositioneerd met behulp van een vlak parallel aan de oogzenuw en de lens van de ogen om een gestandaardiseerde analyse uit te voeren. - Beschrijvende analyse
- Meet de structuren met behulp van een meetinstrument in de software (bijvoorbeeld CTAn). Gebruik de optische zenuw om het gebied van belang af te bakenen voor analyse. Door berekening, het protocol gebruikt het middelste segment om de metingen uit te voeren. Deze evaluatie werd uitgevoerd door beschrijvende analyse(figuur 2 en figuur 3).
- Verricht metingen van het netvlies, retinale pigmenteptheel (RPE), choroïde en scleralaag in de sagittale(figuur 2) en axiale weergave(figuur 3). Neem drie metingen van elke structuur om een gemiddelde te berekenen.
Representative Results
De gemiddelde dikte van het netvlies, RPE, choroïde en scleralaag werd geregistreerd met behulp van de micro-CT-scans na het volgen van het bovenstaande protocol (figuur 1). De techniek toonde een multiplanaire reconstructie van de ogen in drie verschillende opvattingen. Tijdens de analyse kon de waarnemer door het hele monster scrollen om de analyse midden in het monster te standaardiseren.
De micro-CT-analyse toonde de dwarsdoorsnedegebieden van de ogen in de sagittale en axiale weergave(figuur 2 en figuur 3) waarin de lineaire metingen werden uitgevoerd. RPE en choroid laag waren aanzienlijk of trend lager in de spaceflight groep in vergelijking met de GC groep (Figuur 3).
Figuur 1: Micro-CT-procedure van zacht weefsel. (A) Zacht weefsel monster (muisoog). (B) De monsters werden vastgesteld in 4% formaldehyde in fosfaatbufferoplossing (PBS). Na fixatie werden de ogen van de muizen uitgedroogd in ethanol. Om een verdere en abrupte krimp van het vaste monster te voorkomen, werd een gesorteerde reeks ethanoloplossingen gebruikt, te beginnen met 50% ethanol voor 1 uur en de volgende ethanoloplossingen in de genoemde concentraties, elk 1 uur: 70, 80, 90, 96 en 100%. (C) De ogen van de muizen waren 6 dagen lang gekleurd in fosfolybisch zuur (PMA), gewassen in absolute ethanol en vervolgens in afzonderlijke 2 mL plastic containers gevuld met absolute ethanol. (D)Een desktop X-ray micro-CT-systeem scanner werd gebruikt om het netvlies letsel in muizen ogen te evalueren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Sagittale weergave van een grondcontrolemuis. Lagen van het oog aan de rechterkant van het beeld worden geannoteerd, van boven naar beneden, netvlies (0,077 mm), netvliespigmentlaag (RPE, 0,038 mm), choroïde (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Dit cijfer is overgenomen van Overbey et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Axiale weergave van een grondcontrolemuis. Lagen van het oog aan de rechterkant van het beeld worden geannoteerd, van boven naar beneden, netvlies (0,144 mm), netvliespigmentlaag (RPE, 0,051 mm), choroïde (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Dit cijfer is overgenomen van Overbey et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Gemiddelde dikte van de netvlieslaag, RPE-laag en de choroïde laag gemeten door micro-CT in de ruimtevlucht- en controlegroepen. Tellingen werden gemiddeld over vijf retina's per groep. Waarden werden weergegeven als gemiddelde dikte ± standaardfout (SEM). SEM van het gemiddelde is gemarkeerd met foutbalken. Aanzienlijk lager in dwarsdoorsnededikte in de spaceflight (FLT) groep in vergelijking met de groep grondcontrole (GC) wordt aangeduid als '*' (p < 0,05). Dit cijfer is overgenomen van Overbey et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De resultaten van deze studie toonden aan dat er structurele veranderingen in de spaceflight muis oog met behulp van de micro-CT-techniek in vergelijking met GC-groepen, met name van het netvlies, de RPE, en de choroïde lagen van het oog, zoals blijkt uit hun verminderde dikte. Micro-CT biedt een efficiënte en niet-destructieve techniek om de veranderingen te karakteriseren zonder manipulatie. Het gebruik van PMA-kleuring verbeterde de kwaliteit van de micro-CT-beelden om duidelijke 3D-tomografische beelden na de reconstructie te verkrijgen, waarbij elke noodzaak om de structuur van het monster fysiek te veranderen, wordt afgewisseld. Een bijkomend voordeel van deze beelden is dat ze de hele regio van belang digitaal weergeven, waardoor de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van de bevindingen toenemen. Door de micro-CT beelden geproduceerd tijdens deze studie, het beoogde exemplaar toonde differentiatie van de meerdere structuren zoals het netvlies, RPE, choroïde, en sclera laag voor de bepaling van de dikte van elke laag.
Een kritieke stap binnen het protocol is de manipulatie van de monsters vanwege hun grootte en textuur. De behandeling van het monster moet zorgvuldig worden gedaan zonder druk uit te oefenen op het monster tijdens de bereiding. De micro-CT heeft een aantal beperkingen: resolutie en het gebrek aan gestandaardiseerde waarden voor de parameters. Tijdens het scannen kunnen de verschillende micro-CT-scanners verschillende beeldverwerkingsalgoritmen hebben; toch kan kalibratie voor een grijswaarden worden nagestreefd om elk probleem te overwinnen. Na het scannen moet de reconstructie van de beelden worden gebaseerd op het weefsel en de analyse die zal worden uitgevoerd. Het kan van cruciaal belang zijn omdat de beeldkwaliteit afhangt van het tomografische systeem, de instellingen, de grootte van het monster en de bereidingsmethoden16,17.
Vanwege de succesvolle toepassing ervan bij het bestuderen van verschillende soorten normale en pathologische weefsels, moeten micro-CT-beeldvormingsmogelijkheden worden gebruikt in toekomstig onderzoek om volumetrische gegevens voor andere analyses samen te stellen. Op basis van het doel van deze studie was het dus aanvaardbaar om tweedimensionale metingen te gebruiken, maar segmentatie van de bruto 3D-structuur kan ook nuttig zijn om een nauwkeurige schets van het gehele specimen te geven. Zelfs met alle voordelen van een niet-destructieve techniek zal micro-CT andere methoden zoals immunohistochemie niet vervangen, maar zal het desgewenst volgende histologieanalyses aanvullen en toestaan.
Een langdurige ruimtevlucht voorwaarde produceert een reeks structurele en functionele oculaire veranderingen in de astronauten tijdens en na de ruimtemissie gedefinieerd als SANS. De bevindingen omvatten hyperopische verschuivingen, globe flattening, choroidal / retinale plooien, en watten vlekken19. In tegenstelling tot astronauten ' optische coherentie tomografie (OCT) het vinden van retinale zenuwvezel laag verdikking, dunner worden van netvlies en choroïdale laag werd gedocumenteerd in deze dierlijke micro-CT studie. Deze resultaten waren onverwacht. Deze discrepantie kan te wijten zijn aan verwarrende factoren. Muizen hebben een beperkte cephalad vloeistof verschuiving in vergelijking met de mens. Dit gebrek aan vloeistofverschuiving kan verschillende reacties op gravitatieveranderingen hebben opgeroepen. Ten tweede werden muizen binnen 38 uur na splashdown ontleed, en een acute reactie op heraanpassing kan ook bijdragen aan morfologische veranderingen in het netvlies en chooïde. Bevestiging van deze mogelijkheid vereist verdere metingen tijdens de ruimtevaart en lange termijn na de missie.
De resultaten van deze studie geven aan dat de omstandigheden van de ruimtevaart, met name gravitatieveranderingen, een acute en korte-termijnrespons in het oog kunnen veroorzaken. Verder onderzoek is nodig om de gevolgen van de acute veranderingen op de oculaire op retinale functie en mechanisme van ruimtevlucht-geïnduceerde structuur veranderingen te bepalen.
Disclosures
Alle auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NASA Space Biology grant # NNX15AB41G en LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson en Rebecca Klotz hebben aanzienlijk bijgedragen aan het succes van onze ruimtevluchtstudie en we waarderen hun steun enorm. De auteurs willen ook de hele NASA Biospecimen Sharing Program groep bedanken voor hun grote hulp.
De auteurs willen ook het Center for Dental Research bedanken voor micro-CT service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
