Summary
Nous présentons un protocole utilisant l’imagerie micro-calculée de tomographie à haute résolution pour déterminer si les dommages induits par des vols spatiaux sur les structures oculaires. Le protocole montre la mesure dérivée du micro-CT des structures oculaires des rongeurs ex vivo. Nous démontrons la capacité d’évaluer les changements morphologiques oculaires après les vols spatiaux à l’aide d’une technique tridimensionnelle non destructive pour évaluer les dommages oculaires.
Abstract
Les rapports montrent que l’exposition prolongée à un environnement de vol spatial produit des changements ophtalmiques morphologiques et fonctionnels chez les astronautes pendant et après une mission de la Station spatiale internationale (ISS). Cependant, les mécanismes sous-jacents de ces changements induits par les vols spatiaux sont actuellement inconnus. Le but de la présente étude était de déterminer l’impact de l’environnement des vols spatiaux sur les structures oculaires en évaluant l’épaisseur de la rétine de la souris, l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE), la choroïde et la couche de sclère à l’aide de l’imagerie micro-CT. Des souris mâles C57BL/6, âgées de dix semaines, ont été hébergées à bord de l’ISS pour une mission de 35 jours, puis sont retournées sur Terre vivantes pour analyse tissulaire. À titre de comparaison, les souris de contrôle au sol (GC) sur Terre ont été maintenues dans des conditions environnementales et du matériel identiques. Des échantillons de tissus oculaires ont été prélevés pour l’analyse de micro-CT dans les 38(±4) heures après l’éclaboussure. Les images de la section transversale de la rétine, de l’ERP, du choroïde et de la couche de sclère de l’œil fixe ont été enregistrées dans une vue axiale et sagittale à l’aide d’une méthode d’acquisition d’imagerie micro-CT. L’analyse micro-CT a montré que les zones transversales de la rétine, du RPE et de l’épaisseur de la couche choroïde ont été modifiées dans les échantillons de vols spatiaux par rapport au GC, les échantillons de vols spatiaux montrant des sections transversales et des couches significativement plus minces par rapport aux commandes. Les résultats de cette étude indiquent que l’évaluation de micro-CT est une méthode sensible et fiable pour caractériser les changements de structure oculaire. Ces résultats devraient améliorer la compréhension de l’impact du stress environnemental sur les structures oculaires mondiales.
Introduction
Dans l’environnement de microgravité des vols spatiaux, l’augmentation de la pression intracrânienne (PIC) causée par le changement de fluide peut avoir contribué au syndrome neuro-oculaire associé aux vols spatiaux (SANS)1,2,3,4,5. En effet, plus de 40% des astronautes ont connu SANS pendant et après une mission de la Station spatiale internationale (ISS)6, y compris le sujet des vols spatiaux de la NASA Twins Study7. La pathophysiologie actuelle de SANS comprend des changements physiologiques tels que l’œdème de disque optique, l’aplatissement de globe, les plis choroïdal et rétiniens, les décalages d’erreur réfraction hyperopique, et les infarctus de couche de fibre nerveuse (c.-à-d. taches de laine de coton) et sont bien documentés5,8. Toutefois, les mécanismes sous-jacents des changements et des facteurs qui contribuent à l’évolution des dommages ne sont pas clairs. Afin d’avoir une meilleure compréhension de SANS, des modèles animaux sont disponibles pour caractériser les changements associés aux vols spatiaux dans la structure et la fonction rétiniennes.
Dans une enquête précédente sur les mêmes animaux, nous avons signalé l’impact de 35 jours de vol spatial sur la rétine de la souris. Les résultats élucident que les vols spatiaux induit des dommages significatifs dans la rétine et la vascularisation rétinienne, et certaines protéines / voies associées à la mort cellulaire, l’inflammation et le stress métabolique ont été sensiblement modifiés après le vol spatial9.
Actuellement, il existe une variété de techniques d’imagerie non invasives établies pour surveiller le développement et la progression de la maladie, ainsi que les réponses physiologiques à divers facteurs de stress environnementaux, qui sont également largement utilisés dans les modèles de petits rongeurs. Une de ces techniques est micro-CT, qui évalue les structures anatomiques et les processus pathologiques, et a été utilisé avec succès sur des organismes aussi petits que les souris10.
Micro-CT peut atteindre une résolution microdimensionnée, et il peut fournir un contraste élevé pour l’analyse volumétrique des tissus mous avec l’ajout de l’agent de contraste approprié10,11,12,13,14. La technologie micro-CT est avantageuse par rapport aux méthodes traditionnelles telles que l’anatomie brute, la microscopie légère et l’examen de l’histologie, car elle minimise les dommages physiques au profil géométrique des spécimens et ne modifie pas la relation spatiale entre les structures. En outre, les modèles tridimensionnels (3D) de structures peuvent être reconstruits à partir d’images micro-CT12,14. À ce jour, malgré les preuves montrant une déficience visuelle à la suite de l’exposition à l’environnement spatial, peu de données dans les modèles animaux sont disponibles pour une meilleure compréhension des changements associés aux vols spatiaux dans la structure et la fonction rétiniennes. Dans la présente étude, des souris ont effectué une mission de 35 jours à bord de l’ISS afin de déterminer l’impact de l’environnement des vols spatiaux sur les structures oculaires des tissus en quantifiant la microstructure de la rétine, de l’ERP et des couches de choroïdes à l’aide de micro-CT.
Protocol
L’étude a suivi les recommandations énoncées dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH) et a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Loma Linda (LLU) et de la National Aeronautics and Space Administration (NASA). Des informations plus détaillées concernant cette expérience de vol peuvent être trouvées ailleurs9,15.
1. Conditions de vol et de contrôle
REMARQUE : Une 12e charge utile du Service commercial de ravitaillement (CRS-12) a été lancée par SpaceX au Centre spatial Kennedy (KSC) lors d’une mission de 35 jours en août 2017 qui comprenait des souris C57BL/6 mâles de 10 semaines (n = 20) pour la neuvième expérience de recherche sur les rongeurs de la NASA (RR-9).
- Avant de revenir sur Terre via la capsule Dragon de SpaceX, demandez aux souris de vivre dans les habitats des rongeurs (RH) de la NASA à bord de l’ISS pendant 35 jours à une température ambiante de 26 à 28 °C avec un cycle clair/foncé de 12 heures tout au long du vol.
- Placez les souris de contrôle au sol (GC) dans le même matériel de logement utilisé en vol et correspondent aux paramètres environnementaux tels que la température et le dioxyde de carbone (CO2)les plus étroitement possible s’appuyant sur les données de télémétrie.
- Nourrir les souris GC le même régime de la NASA barre alimentaire que leurs homologues de l’espace. Fournir aux souris de vol spatial et de GC le même accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
2. Évaluation post-vol des souris
- Dans les 28 heures suivant l’éclaboussure sur Terre, transportez les souris à l’Université de Loma Linda (LLU). Une fois sur place, retirez les souris du matériel de l’enclos des animaux et évaluez la survie et la santé.
REMARQUE : Après observation, le personnel d’inspection a signalé que toutes les souris avaient survécu à la mission spatiale de 35 jours et étaient en bon état, c’est-à-dire qu’il n’y avait pas de lacunes ou d’anomalies notables.
3. Disséquer et préserver les yeux de souris après le vol spatial
- Dans les 38(±4) heures d’éclaboussure (n=20/groupe), euthanasier les souris enCO 2 à 100% et recueillir leurs yeux.
- Disséquer les rétines de l’œil droit et placer individuellement dans des cryocials stériles, le gel instantané dans l’azote liquide, et le garder à −80 °C avant l’utilisation.
- Fixer l’ensemble des yeux gauches dans 4% de paraformaldéhyde dans la solution saline (PBS) tamponnée par phosphate pendant 24 h, puis rincer à l’aide d’une solution saline tamponnée par phosphate (PBS) pour les tests micro-CT.
4. Préparation de l’échantillon pour la numérisation micro-CT
- Après fixation, déshydratez les yeux des souris dans l’éthanol. Pour prévenir tout rétrécissement ultérieur ou brutal de l’échantillon fixe, utilisez une série de solutions d’éthanol classées : en commençant par 50 % d’éthanol pendant 1 heure, puis en augmentant les concentrations des solutions d’éthanol comme suit pendant 1 heure chacune : 70, 80, 90, 96 et 100 %.
REMARQUE : Les yeux des souris doivent être manipulés dans une chambre à capuche. - Coloration de l’acide phosphomolybique (PMA)
ATTENTION : En raison de la PMA corrosive, cancérogène et toxique pour les organes, un équipement personnel de protection approprié est nécessaire, y compris l’utilisation d’une hotte de fumée.- Préparer la solution de coloration : 10 mg de PMA dans 100 mL d’éthanol absolu.
- Tacher les yeux des souris (10 wt. % acide phosphomolybdic - PMA dissous dans l’éthanol absolu) pendant 6 jours.
- Avant de scanner, lavez d’abord les échantillons oculaires dans de l’éthanol absolu, puis placez chaque œil dans des contenants en plastique individuels de 2 ml qui sont remplis d’éthanol 100% absolu. Ajouter un tampon de coton aux échantillons stabilisés pendant le balayage.
5. Balayage et analyse micro-CT
REMARQUE : Le scanner SkyScan 1272, un système de micro-CT à rayons X de bureau, a été utilisé pour évaluer les dommages rétiniens dans les yeux des souris
- Placez l’échantillon de tissus mous à un support d’échantillon approprié. Pour éviter tout mouvement pendant les mesures de tomodensitométrie à rayons X, assurez-vous d’un ajustement serré de l’échantillon sur son support (figure 1).
- Lors de l’alignement méticuleux de chaque échantillon, numérisez individuellement l’échantillon par rayons X.
- Après l’ouverture du logiciel, centrez l’échantillon dans le cadre. Dans le protocole, n’utilisez pas de filtre et définissez la matrice pour augmenter le pixel à 4 μm. Utilisez le micro-positionnement pour garder le centre d’échantillon sur le cadre.
- Après cela, vérifiez le paramètre pour maximiser l’agent de contraste. Pour effectuer l’étalonnage, retirez l’échantillon et vérifiez que la correction du champ plat est supérieure à 80 %.
- Après étalonnage, réinsérer l’échantillon dans la chambre de balayage. Pour la numérisation, utilisez une étape de rotation de 0,400, un cadre moyen de 4, un mouvement aléatoire de 30, et faites pivoter les échantillons à 180°.
- Utilisez un gabarit de positionnement pour des mesures répétées. En raison de l’amélioration du contraste de phase effectuée tel que décrit, les détails de l’objet aussi petits que 4 μm peuvent être détectés à partir de rayons X générés par un tube à rayons X micro-focus scellé (anode de tungstène) à 50 keV et 80 mA avec un temps d’intégration de 90 minutes.
REMARQUE : Les paramètres d’acquisition énoncés dans cette section pour la sélection afin de produire des tomodensitogrammes de vue d’ensemble avec la plus haute qualité d’image. - Après la numérisation, utilisez un logiciel (p. ex., NRecon) pour reconstituer les données.
- Réglez l’histogramme et utilisez la même plage (0 – 0,24) pour tous les échantillons. Reconstruire la région d’intérêt était un cercle, et aucune échelle ou étiquette n’a été utilisée.
- Pour réduire les artefacts pendant le balayage, utilisez une correction de durcissement du faisceau de 20, une correction de lissage de 1, une réduction d’artefact d’anneau de 6, et n’effectuez aucune modification dans la compensation de désalignement. Après la reconstruction, il a été confirmé que l’échantillon se trouvait dans la région d’intérêt.
- Repositionnez les images à l’aide d’un plan parallèle au nerf optique et à la lentille des yeux.
- Après analyse, utilisez un logiciel (p. ex., DataViewer) pour visualiser les images reconstruites dans les trois vues.
REMARQUE : Si nécessaire, avec ce logiciel, les images peuvent être repositionnées à l’aide d’un plan parallèle au nerf optique et à la lentille des yeux pour effectuer une analyse normalisée. - Analyse descriptive
- Mesurer les structures à l’aide d’un outil de mesure dans le logiciel (p. ex., CTAn). Utilisez le nerf optique pour délimiter la région d’intérêt pour l’analyse. Par calcul, le protocole a utilisé la tranche du milieu pour effectuer les mesures. Cette évaluation a été effectuée par analyse descriptive (figure 2 et figure 3).
- Effectuer des mesures de la rétine, de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE), de la choroïde et de la couche de sclère dans la vue sagittale (figure 2) et axiale (figure 3). Prenez trois mesures de chaque structure afin de calculer une moyenne.
Representative Results
L’épaisseur moyenne de la couche de rétine, de RPE, de choroïde et de sclère a été enregistrée à l’aide des micro-tomodensitogrammes après avoir suivi le protocole ci-dessus (figure 1). La technique a montré une reconstruction multiplanaire des yeux dans trois vues différentes. Au cours de l’analyse, l’observateur a pu faire défiler l’ensemble de l’échantillon pour normaliser l’analyse en plein milieu de l’échantillon.
L’analyse micro-CT a montré les zones transversales des yeux dans la vue sagittale et axiale (figure 2 et figure 3) dans lesquelles ont été effectuées les mesures linéaires. La couche rpe et choroïde était significativement ou tendait à la baisse dans le groupe des vols spatiaux par rapport au groupe GC (figure 3).
Figure 1 : Procédure de micro-CT des tissus mous. (A) Échantillon de tissus mous (œil de souris). (B) Les échantillons ont été fixés dans 4 % de formaldéhyde dans la solution tampon de phosphate (PBS). Après fixation, les yeux des souris étaient déshydratés dans l’éthanol. Pour éviter un rétrécissement supplémentaire et brutal de l’échantillon fixe, une série de solutions éthanoliques gradées a été utilisée, à commencer par 50 % d’éthanol pour 1 h et les solutions d’éthanol suivantes dans les concentrations énumérées, pendant 1 heure chacune : 70, 80, 90, 96 et 100 %. (C) Les yeux des souris ont été tachés dans l’acide phosphomolybique (PMA) pendant 6 jours, lavés dans de l’éthanol absolu, puis placés dans des récipients en plastique individuels de 2 ml remplis d’éthanol absolu. (D) Un scanner de micro-CT de rayon X de bureau a été employé pour évaluer la blessure rétinienne dans les yeux de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Vue sagittale d’une souris de contrôle au sol. Les couches de l’œil sur le côté droit de l’image sont annotées, de haut en bas, rétine (0,077 mm), couche pigmentaire de la rétine (RPE, 0,038 mm), choroïde (0,041 mm), sclère (0,059 mm). Ce chiffre a été tiré d’Overbey et coll.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Vue axiale d’une souris de contrôle au sol. Les couches de l’œil sur le côté droit de l’image sont annotées, de haut en bas, rétine (0,144 mm), couche pigmentaire de la rétine (RPE, 0,051 mm), choroïde (0,041 mm), sclère (0,073 mm). Ce chiffre a été tiré d’Overbey et coll.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Épaisseur moyenne de la couche rétinienne, de la couche rpe et de la couche choroïde mesurée par micro-CT dans les groupes de contrôle et de vol spatial. Les comptes étaient en moyenne sur cinq rétines par groupe. Les valeurs étaient représentées comme épaisseur moyenne ± erreur standard (SEM). SEM de la moyenne est marqué par des barres d’erreur. L’épaisseur transversale du groupe des vols spatiaux (FLT) est nettement plus faible que le groupe de contrôle au sol (GC) est noté « » (p < 0,05). Ce chiffre a été tiré d’Overbey et coll.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Les résultats de cette étude ont montré qu’il y avait des changements structurels dans l’œil de souris de vol spatial utilisant la technique de micro-CT par rapport aux groupes de GC, particulièrement de la rétine, du RPE, et des couches choroïdes de l’oeil, comme en témoigne leur épaisseur diminuée. Micro-CT fournit une technique efficace et non destructive pour caractériser les changements sans besoin de manipulation. L’utilisation de la coloration PMA a amélioré la qualité des images micro-CT pour obtenir avec succès des images tomographiques 3D claires après la reconstruction, ce qui précède tout besoin de modifier physiquement la structure du spécimen. Un avantage supplémentaire de ces images est qu’elles affichent l’ensemble de la région d’intérêt numériquement, augmentant ainsi l’accessibilité ainsi que la reproductibilité des résultats. Grâce aux images micro-CT produites au cours de cette étude, le spécimen ciblé a montré la différenciation des structures multiples comme la rétine, rpe, choroïde, et la couche de sclère pour la détermination de l’épaisseur de chaque couche.
Une étape critique dans le protocole est la manipulation des échantillons en raison de leur taille et leur texture. La manipulation du spécimen doit être effectuée avec soin sans mettre de pression sur le spécimen pendant la préparation. Le micro-CT a quelques limites : la résolution et l’absence de valeurs normalisées pour les paramètres. Au cours de la numérisation, les différents scanners micro-CT peuvent avoir divers algorithmes de traitement d’image; pourtant l’étalonnage pour une échelle de gris pourrait être poursuivi pour surmonter n’importe quel problème. Après balayage, la reconstruction des images doit être basée sur le tissu et l’analyse qui sera effectuée. Il peut être critique puisque la qualité de l’image dépend du système tomographique, les paramètres, la taille du spécimen ainsi que les méthodes de préparation16,17.
En raison de son application réussie dans l’étude de plusieurs types de tissus normaux et pathologiques, les capacités d’imagerie micro-CT devraient être utilisées dans la recherche future pour compiler des données volumétriques pour d’autres analyses. Ainsi, en fonction de l’objectif de la présente étude, il était acceptable d’utiliser des mesures bidimensionnelles, mais la segmentation de la structure 3D brute peut également être bénéfique pour fournir un aperçu précis de l’ensemble du spécimen. Même avec tous les avantages d’une technique non destructive, le micro-CT ne remplacera pas d’autres méthodes telles que l’immunohistorichimie, mais complétera et permettra des analyses d’histologie ultérieures si désiré.
Une condition prolongée de vol spatial produit une série de changements oculaires structurels et fonctionnels chez les astronautes pendant et après la mission spatiale définie comme SANS. Les résultats incluent des décalages hyperopes, l’aplatissement de globe, les plis choroïdal/rétiniens, et les taches de laine de coton19. Contrairement à la tomographie optique de cohérence des astronautes (OCT) de l’épaississement de la couche de fibre nerveuse rétinienne, l’amincissement de la rétine et de la couche choroïdal a été documenté dans cette étude animale de micro-CT. Ces résultats étaient inattendus. Cet écart peut être dû à des facteurs de confusion. Les souris ont un changement limité de fluide de céphalade par rapport à l’homme. Ce manque de changement de fluide peut avoir évoqué différentes réponses aux changements gravitationnels. Deuxièmement, les souris ont été disséquées dans les 38 heures suivant l’éclaboussure, et une réponse aiguë pour la ré-adaptation peut également contribuer aux changements morphologiques dans la rétine et la choroïde. La confirmation de cette possibilité nécessite d’autres mesures pendant les vols spatiaux et à long terme après la mission.
Les résultats de cette étude indiquent que les conditions de vol spatial, en particulier les changements gravitationnels, peuvent induire une réponse aiguë et à court terme dans l’œil. Des recherches plus poussées sont nécessaires pour déterminer les conséquences des changements aigus sur la fonction oculaire et le mécanisme des changements de structure induits par les vols spatiaux.
Disclosures
Tous les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention de biologie spatiale de la NASA # NNX15AB41G et LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson et Rebecca Klotz ont grandement contribué au succès de notre étude sur les vols spatiaux et nous apprécions grandement leur soutien. Les auteurs tiennent également à remercier l’ensemble du groupe du Programme de partage des biospécimens de la NASA pour leur grande aide.
Les auteurs tiennent également à remercier le Center for Dental Research for Micro-CT service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
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