Summary
Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.
Abstract
Epithel-Organoid-Modelle dienen als wertvolle Werkzeuge, um die grundlegende Biologie eines Organsystems zu untersuchen und Krankheiten zu modellieren. Wenn sie als Organoide gezüchtet werden, können sich epitheliale Vorläuferzellen selbst erneuern und differenzierende Nachkommen erzeugen, die zelluläre Funktionen aufweisen, die denen ihrer In-vivo-Gegenstücke ähneln. Hierin beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um regionsspezifische Vorläufer aus der menschlichen Lunge zu isolieren und 3D-Organoidkulturen als experimentelles und validierendes Werkzeug zu generieren. Wir definieren proximale und distale Regionen der Lunge mit dem Ziel, regionsspezifische Vorläuferzellen zu isolieren. Wir nutzten eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation, um Gesamtzellen aus Höhle und Luftröhre zu isolieren. Spezifische Vorläuferzellen wurden dann aus den proximalen oder distalen Ursprungszellen mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) auf der Grundlage von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern wie NGFR für die Sortierung von Basalzellen und HTII-280 für die Sortierung von alveolären Typ-II-Zellen fraktioniert. Isolierte basale oder alveoläre Typ-II-Vorläufer wurden verwendet, um 3D-Organoidkulturen zu erzeugen. Sowohl distale als auch proximale Vorläufer bildeten Organoide mit einer koloniebildenden Effizienz von 9-13% in der distalen Region und 7-10% in der proximalen Region, wenn sie am 30. Tag 5000 Zellen / Well plattiert wurden. Distale Organoide hielten HTII-280+ alveoläre Typ-II-Zellen in Kultur, während proximale Organoide bis zum 30. Tag in flimmer- und sekretorische Zellen differenzierten. Diese 3D-Organoidkulturen können als experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie von Lungenepithel- und epithelialen mesenchymalen Interaktionen sowie für die Entwicklung und Validierung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung der epithelialen Dysfunktion bei einer Krankheit verwendet werden.
Introduction
Lufträume des menschlichen Atmungssystems können grob in leitende und respiratorische Zonen unterteilt werden, die den Transport von Gasen und deren anschließenden Austausch über die epithelial-mikrovaskuläre Barriere vermitteln. Die leitenden Atemwege umfassen Luftröhren, Bronchien, Bronchiolen und terminale Bronchiolen, während Atemlufträume respiratorische Bronchiolen, Alveolargänge und Alveolen umfassen. Die Epithelauskleidung dieser Lufträume ändert ihre Zusammensetzung entlang der proximo-distalen Achse, um den einzigartigen Anforderungen jeder funktional unterschiedlichen Zone gerecht zu werden. Das pseudostratifizierte Epithel der tracheo-bronchialen Atemwege besteht aus drei Hauptzelltypen, basal, sekretorisch und ziliiert, zusätzlich zu den weniger häufigen Zelltypen, einschließlich Bürsten, neuroendokrinen und Ionozyten 1,2,3. Bronchioläre Atemwege beherbergen morphologisch ähnliche Epithelzelltypen, obwohl es Unterschiede in ihrer Häufigkeit und ihren funktionellen Eigenschaften gibt. Zum Beispiel sind Basalzellen in bronchiolären Atemwegen weniger häufig, und sekretorische Zellen umfassen einen größeren Anteil an Clubzellen im Vergleich zu serösen und Kelchzellen, die in Tracheo-Bronchial-Atemwegen vorherrschen. Epithelzellen der Atemzone umfassen einen schlecht definierten quaderförmigen Zelltyp in respiratorischen Bronchiolen, zusätzlich zu alveolären Typ-I- (ATI) und Typ-II- (ATII) -Zellen von Alveolargängen und Alveolen 1,4.
Die Identität von Epithelstamm- und Vorläuferzelltypen, die zur Erhaltung und Erneuerung von Epitheln in jeder Zone beitragen, wird unvollständig beschrieben und weitgehend aus Studien in Tiermodellenabgeleitet 5,6,7,8. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass entweder Basalzellen pseudostratifizierter Atemwege oder Keulenzellen bronchiolärer Atemwege oder ATII-Zellen des Alveolarepithels als epitheliale Stammzellen dienen, basierend auf der Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung und multipotenten Differenzierung 7,9,10,11,12 . Trotz der Unfähigkeit, genetische Linienverfolgungsstudien durchzuführen, um die Stammheit menschlicher Lungenepithelzelltypen zu beurteilen, bietet die Verfügbarkeit von Organoid-basierten Kulturmodellen zur Beurteilung des funktionellen Potenzials von Epithelstamm- und Vorläuferzellen ein Werkzeug für vergleichende Studien zwischen Maus und Mensch 13,14,15,16,17.
Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Epithelzelltypen aus verschiedenen Regionen der menschlichen Lunge und deren Kultur unter Verwendung eines 3D-Organoidsystems, um die regionalen Zelltypen zu rekapitulieren. Ähnliche Methoden wurden für die Funktionsanalyse und Krankheitsmodellierung von Epithelzellen aus anderen Organsystemenentwickelt 18,19,20,21. Diese Methoden bieten eine Plattform für die Identifizierung regionaler epithelialer Vorläuferzellen, für die Durchführung mechanistischer Studien, die ihre Regulation und Mikroumgebung untersuchen, sowie für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffforschung. Obwohl Studien an Lungenepithel-Vorläuferzellen, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, von der Analyse profitieren können, entweder in vivo oder in vitro, waren die Erkenntnisse über die Identität menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen weitgehend von der Extrapolation von Modellorganismen abhängig. Als solche bieten diese Methoden eine Brücke, um die Identität und das Verhalten menschlicher Lungenepithelzelltypen mit ihren Studien zur Regulation von Stamm- / Vorläuferzellen in Beziehung zu setzen.
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Protocol
Menschliches Lungengewebe wurde von verstorbenen Gewebespendern in Übereinstimmung mit den vom International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) entwickelten und vom Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board genehmigten Einwilligungsverfahren gewonnen.
1. Gewebeverarbeitung zur Isolierung von Lungenzellen aus tracheo-bronchialen oder kleinen Atemwegs-/Parenchymregionen (kleine Atemwege und Alveolen)
- Bereiten Sie alle Dissektionsinstrumente, Glaswaren und die entsprechenden Lösungen einen Tag vor der Zellisolierung vor und autoklavieren Sie sie.
- Identifizieren und trennen Sie nach Erhalt von Lungengewebe die proximalen und distalen Regionen. Die Luftröhre und die Bronchien gelten als "proximal". Für die Zwecke dieses Protokolls werden Luftröhre und die ersten 2-3 Generationen von Bronchien spezifiziert und zur Isolierung des "proximalen" Atemwegsepithels verwendet. Kleine Atemwege mit einem Durchmesser von 2 mm oder weniger und das umgebende Parenchymgewebe werden für die Zwecke dieses Protokolls als "distales" Lungenepithel betrachtet (Abbildung 1A).
HINWEIS: Alle Verfahren, die die Verarbeitung von menschlichem Lungengewebe beinhalten, sollten in einer Biosicherheitskabine unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
2. Anreicherung und Untersetzung von kleinen Atemwegs- und alveolären Epithel-Vorläuferzellen aus distalem Lungengewebe
- Vorbereitung von distalem Gewebe
- Geben Sie das distale Lungengewebe in eine sterile Petrischale (150 x 15 mm). Würfelgewebe in ca. 1 cm3 Stücke geben und in ein sauberes 50 ml Röhrchen geben.
- Waschen Sie das Gewebe 3x mit gekühltem HBSS und entsorgen Sie HBSS-Waschen jedes Mal, um Blut und Epithelauskleidungsflüssigkeit zu entfernen.
- Legen Sie das Gewebe in eine neue Petrischale und tupfen Sie es mit sterilen Fusselschutztüchern trocken. Entfernen Sie mit Pinzette und Schere so viel viszerale Pleura (eine empfindliche transparente Membran, die die Oberfläche der Lunge bedeckt) wie möglich.
- Verwenden Sie eine Schere, um Gewebe in Stücke von ca. 2 mm Durchmesser zu zerkleinern. Hackfleisch in eine saubere Petrischale geben und weiter zerkleinern, indem man es mit einer sterilen einseitigen Rasierklinge auf eine ungefähre Größe von 1 mm hackt.
- Enzymverdauung
HINWEIS: Die Liberase-Stammlösung beträgt 5 mg / ml (100x) und der DNase-Stamm beträgt 2,5 mg / ml (100x) (Materialtabelle).- 50 μg/ml Liberase und 25 μg/mL DNase in steriles HBSS in einem 50 mL konischen Röhrchen geben.
- Übertragen Sie ca. 2-3 g gehacktes Gewebe in eine neue 50 ml konische Röhre mit 25 ml HBSS, die Liberase und DNase enthält. Inkubieren Sie für 40-60 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem auf 900 U / min eingestellten Mischer. Nach 30 Minuten Inkubation verdauen Sie das verdaute Gewebe mit einer 30-ml-Spritze ohne Nadel, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden und mit der Inkubation fortzufahren.
HINWEIS: Die Inkubationszeit mit den Enzymen kann je nach Art oder Zustand des Gewebes variieren. Zum Beispiel dauert die enzymatische Verdauung von normalem Gewebe ungefähr 45 Minuten. Fibrotisches Gewebe aus idiopathischen Lungenfibroseproben kann jedoch eine längere Inkubationszeit von bis zu 60 min erfordern. Überwachen Sie daher das Gewebe während dieses Schritts sorgfältig, um Schäden an den Oberflächenmarkern zu vermeiden, was für FACS von entscheidender Bedeutung ist.
- Einzelzellen-Isolierung
- Trituieren Sie das Gewebe, indem Sie 5x durch eine 16-G-Nadel ziehen, die an einer 30-ml-Spritze angebracht ist. Ziehen Sie die Gewebesuspension in eine Breitrohrpipette und durchlaufen Sie eine Reihe von Zellsieben (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) unter Vakuumdruck. Waschen Sie das Sieb mit 20 ml HBSS + -Puffer, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Das Rezept für HBSS+ Puffer finden Sie in der Tabelle der Materialien.
- Fügen Sie dem Filtrat nach 45 Minuten ein gleiches Volumen HBSS + -Puffer hinzu, um die Liberase-Aktivität zu hemmen und eine Überverdauung zu verhindern.
- Zentrifugenfiltrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 1 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC) zum Pellet hinzu, schaukeln Sie das Rohr vorsichtig, um das Pellet zu entfernen, und inkubieren Sie es 1 min lang auf Eis.
HINWEIS: Die Menge und Zeit in der RBC-Lyselösung hängt von der Größe des Pellets ab. Es ist wichtig, die Zellen auf Eis zu halten und die Zeit in RBC-Lyselösung sorgfältig zu überwachen, um die Lyse der Zielzellen zu verhindern. Wenn die RBC-Lyse nicht ausreicht, wiederholen Sie den Schritt. - Fügen Sie 10-20 ml HBSS + -Puffer hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren. Zentrifugenfiltrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Wenn lysierte rote Blutkörperchen (Geisterzellen) eine trüben Schicht über dem Zellpellet bilden, resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml HBSS + -Puffer und belasten Sie die Suspension durch 70 μm-Zellsieb, um die Geisterzellen zu eliminieren. Das Filtrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und mit weiteren Schritten fortfahren.
- Erschöpfung von Immunzellen und Endothelzellen (optionaler Schritt)
- Erschöpfen Sie CD31+ Endothelzellen und CD45+ Immunzellen aus dem Pool der Gesamtzellen unter Verwendung der CD31 & CD45 Mikrokügelchen, die an monoklonale antihumane CD31- und CD45-Antikörper (Isotyp-Maus IgG1) und LS-Säulen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials) konjugiert sind.
- Sammeln Sie den Durchfluss, der hauptsächlich aus Epithel- und Stromazellen besteht, in einem frischen sterilen Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Führen Sie eine Zellzählung durch, um die Gesamtzahl der Zellen im Durchfluss zu ermitteln.
- Zelloberflächenfärbung für fluoreszenzassoziierte Zellsortierung (FACS)
- Resuspendieren Sie 1 x 107 Zellen pro 1 ml HBSS + -Puffer. Fügen Sie primäre Antikörper in der erforderlichen Konzentration hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 4 °C im Dunkeln. In dieser Studie wurden fluorophorkonjugierte primäre Antikörper verwendet, sofern nicht anders angegeben. Details zu Antikörperquellen und Titern sind in der Materialtabelle beschrieben.
HINWEIS: HTII-280 ist derzeit der beste oberflächenreaktive Antikörper, der es ermöglicht, distale Lungenzellen in überwiegend Atemwegs- (HTII-280-) und alveoläre Typ-2- (HTII-280+) Zellfraktionen zu unterteilen. Ein Vorbehalt zu dieser Strategie ist, dass AT1-Zellen mit dieser Methode nicht gefärbt werden und aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit schlecht vertreten sind. AT1-Zellen sind jedoch in distalen Lungenpräparaten schlecht vertreten, vermutlich aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und ihres Verlustes bei der Selektion lebensfähiger Zellen durch FACS und stellen somit nur eine seltene Verunreinigung der Atemwegszellfraktion dar. - Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml HBSS+-Puffer und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Wenn Sie nicht konjugierte primäre Antikörper verwenden, fügen Sie die erforderliche Konzentration eines geeigneten fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten auf Eis. Waschen Sie überschüssigen sekundären Antikörper ab, indem Sie 3 ml HBSS+-Puffer und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.
- Verwerfen Sie die überstehenden und resuspendierten Zellen im HBSS+-Puffer pro 1 x 107 Zellen/ml. Filtern Sie Zellen durch eine Siebkappe in 5-ml-Polystyrolröhrchen, um die Bildung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen. DAPI (1 μg/ml) hinzufügen, um durchlässige (tote) Zellen zu färben.
HINWEIS: Es ist wichtig, geeignete einfarbige und Fluoreszenz-abzüglich eins (FMO) -Kontrollen (dh Antikörper-Färbe-Cocktail minus jeweils einen Antikörper) zu verwenden, um Fehlalarme während des FACS zu minimieren. In dieser Studie wurden positive und negative Selektionsperlen zur empirischen Kompensation der Überlappung von Emissionsspektren zwischen Fluorophoren verwendet (Table of Materials). FACS reichern Zelltypen von Interesse an. Lebensfähige Epithelzellen werden basierend auf ihrem CD45-negativen, CD31-negativen, CD236-positiven Zelloberflächenphänotyp und ihrer negativen Färbung für DAPI angereichert. Diese Epithelzellfraktion kann basierend auf der Färbung für zelltypspezifische Oberflächenmarker, wie z.B. spezifische Färbung für HTII-280-positive Zellen, die für AT2-Zellen angereichert sind, weiter unterteilt werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht die negative Selektion für HTII-280 die Anreicherung kleiner Epithelzellen der Atemwege wie Keulen- und Flimmerzellen (Abbildung 2).
- Resuspendieren Sie 1 x 107 Zellen pro 1 ml HBSS + -Puffer. Fügen Sie primäre Antikörper in der erforderlichen Konzentration hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 4 °C im Dunkeln. In dieser Studie wurden fluorophorkonjugierte primäre Antikörper verwendet, sofern nicht anders angegeben. Details zu Antikörperquellen und Titern sind in der Materialtabelle beschrieben.
3. Anreicherung und Subsetting von epithelialen Vorläuferzellen aus tracheo-bronchialen Atemwegen
- Gewebepräparation
- Sezieren Sie proximale Atemwege (Luftröhre/Bronchien) aus der Lunge heraus. Öffnen Sie die Atemwege entlang ihrer Länge mit einer Schere, um das Lumen freizulegen, und fügen Sie 50 μg / ml Liberase hinzu, um das Gewebe vollständig abzudecken.
- Inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem Thermomischer, der auf 900 U / min eingestellt ist.
- Entfernen Sie die proximalen Atemwege aus dem Zentrifugenröhrchen und legen Sie es in eine sterile Petrischale (150 x 15 mm). Schaben Sie vorsichtig die Oberfläche der Atemwege mit einem Skalpell, um luminale Epithelzellen vollständig aus dem Gewebe zu entfernen.
- Waschen Sie die Petrischale mit 5 ml sterilem HBSS+-Puffer, um alle gelösten luminalen Epithelzellen zu sammeln und die gelösten Zellen in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Trituieren Sie die Suspension, indem Sie 5x bis 16 G Nadel und 18 G Nadel auf eine 10 ml Spritze setzen, um Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Zentrifen Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendiert das Pellet in frischem HBSS+-Puffer und lagert diese leuchtenden Atemwegszellen auf Eis, bereit, in den kommenden Schritten mit der Einzelzellsuspension kombiniert zu werden, die aus den gehackten proximalen Atemwegen erzeugt wird.
- Schneiden Sie mit einer Schere das restliche Luftröhren-Bronchialgewebe entlang seiner Ringe ab, um kleine Gewebestreifen zu erzeugen, und übertragen Sie die Streifen in eine frische Petrischale. Zerkleinern Sie die Gewebestreifen mit einer einseitigen Rasierklinge, um kleinere Stücke herzustellen.
HINWEIS: Da die proximalen Atemwege knorpelig sind, können sie nicht so fein zerkleinert werden wie das distale Lungengewebe. - Übertragen Sie das gehackte Gewebe in die C-Röhren, fügen Sie 2 ml Liberase in die Röhre hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe untergetaucht wird. Laden Sie den C-Schlauch auf den automatisierten Dissoziator und führen Sie das Human Lung Protocol-2 aus, um das Gewebe mechanisch weiter zu dissoziieren.
HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Dissoziator bietet ein optimiertes Programm namens Human Lung Protocol-2 für diese spezielle Anwendung (siehe Materialverzeichnis).
- Enzymverdauung und Einzelzellisolierung
- Übertragen Sie etwa 2 g gehacktes proximales Gewebe aus dem C-Rohr in jedes konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 50 μg/ml Liberase und 25 μg/ml DNase-Lösung zu jeder Tube hinzu.
HINWEIS: Um eine effiziente Dissoziation zu gewährleisten, sollten Röhrchen nicht über die 30-ml-Marke hinaus gefüllt werden. - Inkubieren Sie das gehackte Gewebe für 45 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem Mischer, der auf 900 U / min eingestellt ist.
- Führen Sie die dissoziierte Gewebesuspension durch eine Reihe von Zellsieben (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) unter Vakuumdruck, wie oben erwähnt, und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie das Sieb mit 20 ml HBSS + -Puffer, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.
HINWEIS: Da proximales Gewebe im Vergleich zum distalen Gewebe knorpelig und sperrig ist, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass die Filter verstopfen. Die Verwendung eines Trichters kann dazu beitragen, das Überlaufen der Flüssigkeit beim Passieren der Siebe zu verhindern. - Fügen Sie dem Filtrat ein gleiches Volumen an HBSS + -Puffer hinzu, um die Liberase-Aktivität zu hemmen und eine Überverdauung zu verhindern. In diesem Schritt werden die isolierten luminalen proximalen Atemwegszellen aus 3.1.5 zur Zellsuspension hinzugefügt.
- Zentrifen Sie die kombinierte Zellsuspension bei 500 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zellwäsche im HBSS+-Puffer. Führen Sie eine Erschöpfung von CD45+ Immunzellen und CD31+ Endothelzellen durch, wie oben in 2.4 erwähnt (optionaler Schritt).
- Methoden zur Färbung ähneln distalem Lungengewebe, folgen Sie den Schritten in 2.5. Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen basierend auf ihrem CD45-negativen, CD31-negativen, CD236-positiven Zelloberflächenphänotyp und negativer Färbung für DAPI.
- Weiter unterteilt die Epithelzellfraktion basierend auf der Färbung für zelltypspezifische Oberflächenmarker wie NGFR, was die Anreicherung von basalen (NGFR-positiven) und nicht-basalen (NGFR-negativ; sekretorischen, bewimperten, neuroendokrinen) Zelltypen ermöglicht (Abbildung 3).
- Übertragen Sie etwa 2 g gehacktes proximales Gewebe aus dem C-Rohr in jedes konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 50 μg/ml Liberase und 25 μg/ml DNase-Lösung zu jeder Tube hinzu.
4. Organoide Kultur
- Fügen Sie 5.000 (diese Zahl kann angepasst werden, um die gewünschte Dichte von Epithelorganoiden zu erhalten) sortierte proximale oder distale Epithelzellen zu sterilen 1,5 ml Röhrchen zusammen mit 7,5 x 104 MRC-5-Zellen (menschliche Lungenfibroblastenzelllinie) hinzu. Epithel-mesenchymale Interaktionen sind entscheidend für die Expansion von Vorläuferzellen.
- Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Es ist wichtig, die vom Sortierer erhaltene Zellzahl manuell zu bestätigen, um die Genauigkeit der Organoidkoloniebildung zu gewährleisten. - Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL eiskaltem Medium, ergänzt mit Antibiotika. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
- Geben Sie 50 μL eiskaltes 1x Wachstumsfaktor-abgereichertes Basalmembranmatrixmedium in die Durchstechflasche und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig auf Eis, um sie zu mischen.
HINWEIS: Es ist wichtig, eiskalte Medien zu verwenden und Zellen auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation des Basalmembranmatrixmediums zu vermeiden. - Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen porengroßen Zellkultureinsatz von 0,4 μm in einer 24-Well-Platte (1,4 x 104 Zellen/cm2) und achten Sie darauf, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
- 30-45 min bei 37 °C inkubieren, damit sich die Matrix verfestigen kann.
- 600 μL vorerwärmtes Wachstumsmedium in die Vertiefung geben.
HINWEIS: Media wurde in den ersten 24 h nach der Aussaat mit Antimykotika (0,4%) und Pen-Streptokokken (1%) und den ersten 72 h mit 10 μM Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt. - Kultur bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 30 Tage, während dieser Zeit sollten die Medien alle 48 h gewechselt werden.
HINWEIS: Die Kulturdauer kann je nach Zweck des Experiments geändert werden. Längere Endpunkte werden verwendet, um die Differenzierung zu untersuchen, während kürzere Endpunkte von 7 Tagen, 14 Tagen usw. verwendet werden können, wenn der Zweck des Experiments nicht darin besteht, eine vollständige Differenzierung zu erreichen. - 10 μM TGFβ-Inhibitor für 15 Tage in die Kulturmedien geben, um die Zellen in der proliferativen Phase zu erhalten und das Überwachsen von Fibroblasten zu unterdrücken.
HINWEIS: Die Ergebnisse unterscheiden sich je nach Kulturmedium, das für den Assay verwendet wird. Zum Beispiel wurden die hierin gezeigten Ergebnisse mit Pneumacult-ALI-Medium erzeugt, was zur Erzeugung großer Organoide aus distaler Lunge, gut differenzierten und größeren Organoiden aus der proximalen Lunge führt.
5. Organoide Färbung
- Fixierung und Einbettung von Organoiden
- Aspirieren Sie Medien sowohl aus der oberen als auch aus der unteren Transmembraneinlagekammer und spülen Sie sie einmal mit warmem PBS ab.
- Fixieren Sie die Kulturen, indem Sie 300 μL PFA (2% w/v) in den Einsatz und 500 μL in den Brunnen für 1 Stunde bei 37 °C geben. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie es mit warmem PBS ab, wobei Sie darauf achten, den Basememt-Membranmatrixstopfen nicht zu entfernen.
HINWEIS: Feste Organoide können ein bis zwei Wochen unter Wasser in PBS bei 4 °C gelagert werden, bevor weitere Schritte eingeleitet werden. - Aspirieren Sie PBS, drehen Sie den Einsatz um und schneiden Sie die Wendeschneidplattenmembran vorsichtig um ihre Peripherie herum. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Transwell-Membran und achten Sie darauf, den Matrixstopfen nicht zu stören.
- Tippen Sie in einer Petrischale auf den Einsatz, um den Matrixstopfen wiederherzustellen.
- Fügen Sie einen Tropfen Probenverarbeitungsgel wie Histogel (bei 37 ° C) zum Matrixstopfen hinzu und halten Sie ihn bei 4 ° C, bis das Gel erstarrt.
- Den Stecker auf eine Einbettungskassette geben, durch zunehmende Konzentrationen von Ethanol (70, 90 und 100%), klar in Xylol dehydrieren und in Paraffinwachs einbetten.
- Schneiden Sie 7 μm-Schnitte auf einem Mikrotom und sammeln Sie auf positiv geladenen Objektträgern.
- Immunfluoreszenzfärbung von Organoiden
- Platzieren Sie die Dias bei 65 °C für 30 Minuten zum Entwachsen.
- Deparaffinisieren Sie die Abschnitte durch Eintauchen in Xylol und rehydrieren Sie durch abnehmende Konzentrationen von Ethanol.
- Führen Sie Hochtemperatur-Antigenabruf in Antigen-Demaskierungslösung, Zitronensäure-Base mit einem handelsüblichen Retriever durch, indem Sie Objektträger für 15 Minuten in die Lösung tauchen (Materialtabelle).
- Umgeben Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Pap-Stift.
- Blockieren Sie die unspezifische Färbung zwischen den primären Antikörpern und dem Gewebe, indem Sie im Blocking-Puffer inkubieren.
- Inkubieren Sie Abschnitte in geeigneter Konzentration von primären Antikörpern, die in Inkubationslösung verdünnt wurden, über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
- Abschnitte 3x bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer abspülen.
- Inkubieren Sie in der entsprechenden Konzentration an fluorochromkonjugierten Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
- Abschnitte 3x bei Raumtemperatur mit 0,1% Tween 20-TBS abspülen. Inkubieren Sie Abschnitte für 5 min in DAPI (1 μg/ml). Abschnitte einmal in TBS (Tris-buffered saline) mit 0,1% Tween 20 spülen, trocknen und in einer Montagelösung montieren (Abbildung 4 und Abbildung 5).
HINWEIS: Quelle und optimale Arbeitsverdünnung von primären und sekundären Antikörpern, die für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden, sind in der Materialtabelle enthalten.
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Representative Results
Quelle Lungengewebe
Die Luftröhre und der extrapulmonale Bronchus (Abbildung 1A) wurden als Quellgewebe für die Isolierung proximaler Atemwegsepithelzellen und die anschließende Erzeugung proximaler Organoide verwendet. Distales Lungengewebe, das sowohl Parenchym als auch kleine Atemwege mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm umfasst (Abbildung 1A), wurde zur Isolierung kleiner Atemwegs- und Alveolarepithelzellen (distales Lungenepithel) und zur Erzeugung von entweder kleinen Atemwegs- oder Alveolarorganoiden verwendet. Proximale Atemwege, die von einem pseudostratifizierten Epithel ausgekleidet sind, umfassen reichlich basale Vorläuferzellen, die für das Membranprotein NGFR immunreaktiv sind (Abbildung 1B, C). Im Gegensatz dazu enthielten Epithelzellen, die die Alveolen auskleiden, eine Untergruppe, die eine apikale Membranimmunreaktivität mit dem monoklonalen HTII-280-Antikörper zeigte, was auf ihre alveoläre Typ-2-Zellidentität (AT2) hindeutet (Abbildung 1B, D). Diese Oberflächenmarker wurden verwendet, um Einzelzellsuspensionen von Epithelzellen zu unterteilen, die entweder aus proximalen oder distalen Regionen isoliert wurden.
Gewebedissoziation und Zellfraktionierung
Einzelzellsuspensionen von Gesamtzellen wurden entweder aus proximalen oder distalen Regionen des menschlichen Lungengewebes isoliert und sowohl mit magnetischer Perle als auch mit FACS fraktioniert, um angereicherte Epithelzellpopulationen zu erhalten (Abbildung 2 und Abbildung 3). Reichlich kontaminierende Zelltypen, einschließlich roter Blutkörperchen, Immunzellen und Endothelzellen, wurden mit Antikörpern gegen CD235a, CD45 bzw. CD31 gefärbt, gefolgt von einer magnetisch assoziierten Zellsortierung zur Erschöpfung dieser Zelltypen aus dem Gesamtpool der Lungenzellen. Die resultierenden "erschöpften" Zellsuspensionen wurden für Epithelzellpopulationen sowohl in distalen (Abbildung 2E) als auch in proximalen (Abbildung 3E) Gewebeproben signifikant angereichert, mit entsprechender Steigerung der FACS-Effizienz. Nach der Erschöpfung der CD235a/CD45/CD31-positiven Zellen mit CD45- und CD31-Mikrokügelchen stieg der Prozentsatz der CD31-/CD45-/CD235a- in der distalen Bevölkerung von 14% (Abbildung 2 A,B) auf 51,7% (Abbildung 2E,F). Weitere FACS-Erschöpfung von Zellen, die entweder für CD235a, CD45 oder CD31 positiv färbten, Eliminierung von Zellen mit positiver Färbung für DAPI und positiver Selektion für den Epithelzelloberflächenmarker CD326, führten zu einer hochangereicherten distalen Zellpopulation, die 33,5% (Abbildung 2 E,G) im Vergleich zu 7% (Abbildung 2A,C ) vor der Erschöpfung der negativen Bevölkerung. Eine weitere Untersetzung der distalen Epithelzellpopulationen wurde durch Fraktionierung auf der Grundlage der Oberflächenfärbung mit dem monoklonalen HTII-280-Antikörper (Abbildung 2D, H) erreicht. Dementsprechend umfassten distale Lungenepithelzellen 4,3% HTII-280+ und 2,6% HTII-280- Untergruppen (Abbildung 2D ohne Erschöpfung von CD31/CD45/CD235a) und 30% HTII-280+ und 3,6% HTII-280- Untergruppen (Abbildung 2H nach Erschöpfung von CD31/CD45/CD235a).
Die Gesamtzahl der aus der proximalen Region isolierten Zellen war für CD235a/CD45/CD31-positive Zellen unter Verwendung von CD45- und CD31-Mikrokügelchen erschöpft, und der Prozentsatz an CD31-/CD45-/CD235a- stieg von 17% (Abbildung 3 A,B) auf 56,6% (Abbildung 3E,F). Die positive Selektion für den Epithelzell-Oberflächenmarker CD326 in Zellen, die aus der proximalen Region isoliert wurden, führte zu einer hochangereicherten proximalen Zellpopulation, die 38% (Abbildung 3 E,G) der gesamten Lungenzellfraktionen ausmachte, verglichen mit 9,3% (Abbildung 3A,C) ohne Erschöpfung der negativen Population. Eine weitere Untersetzung proximaler Epithelzellpopulationen wurde durch Fraktionierung auf der Grundlage der Oberflächenfärbung mit Antikörpern gegen NGFR (Abbildung 3D, H) erreicht. Dementsprechend umfassten proximale Lungenepithelzellen 2,7% NGFR+ und 6,5% NGFR- Teilmengen (Abbildung 3D ohne Erschöpfung von CD31/CD45/CD235a) und 13% NGFR+ und 25% NGFR- (Abbildung 3H nach Erschöpfung von CD31/CD45/CD235a).
Organoid-Kulturen der Lunge
Distale Lungenepithelorganoide wurden innerhalb der Wachstumsfaktor-erschöpften Basalmembranmatrix in Medien kultiviert, die empirisch getestet wurden, um das Wachstum und die Differenzierung von Organoiden zu optimieren. Drei verschiedene Medien wurden untersucht, darunter PneumaCult-ALI-Medium, kleines Epithelzellwachstumsmedium (SAEKG-Medium) und Basalmedium der Maus. Ein optimales Organoidwachstum wurde mit PneumaCult-ALI-Medium erreicht, das für weitere Studien ausgewählt wurde. Kulturen von distalen HTII-280+ Lungenepithelzellen ergaben schnell expandierende Organoide mit einer durchschnittlichen koloniebildenden Effizienz von 10% (Abbildung 4A,B). Die Immunfluoreszenzfärbung von Tag-30-Kulturen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers HTII-280 und SPC ergab lumenhaltige Organoide, die überwiegend aus distalen HTII-280+- und SPC+-Lungenepithelzellen bestehen (Abbildung 4 C,C' und Abbildung 4D,D'). Kulturen von distalen Lungenepithel-HTII-280-Zellen ergaben Organoide, die aus einem pseudostratifizierten Epithel bestanden, das dem der kleinen Atemwege ähnelte (nicht gezeigt).
Proximale Lungenepithelorganoide wurden aus NGFR+-Zellen kultiviert, die in Matrigel eingesät und 30 Tage lang in PneumaCult-ALI-Medium kultiviert wurden. Es wurden große lumenhaltige Organoide (Abbildung 5 D,E,F) mit einer durchschnittlichen koloniebildenden Effizienz von 7,8% beobachtet (Abbildung 5A,B,C). Organoide bestanden aus einem pseudostratifizierten Epithel, das aus selbsterneuernden Krt5+- und NGFR+-Basalzellen (Abbildung 5D, 5E) und differenzierten luminalen Zelltypen einschließlich FoxJ1+-Flimmerzellen und MUC5AC+-Sekretionszellen (Abbildung 5D,E) bestand.
Abbildung 1: Probenahme von menschlichem Lungengewebe. (A) Schematische Darstellung der menschlichen Lunge, die eine Strategie für die Probenahme proximaler und distaler Regionen zur Zellisolierung zeigt. (B) H & E-Färbung der proximalen und distalen Regionen der Lunge. (C,D) Immunfluoreszierende Färbung entsprechender Regionen mit NGFR + basalen Vorläuferzellen (rot) an der Basalmembran der Bronchialatemwege und HTII-280+ alveolären Typ-II-Vorläufern (grün) in den Alveolen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Sortierstrategie für distale Lungenzellen. (A,E) Prozentsatz verschiedener Zellpopulationen vor und nach der Erschöpfung der CD45+ und CD31+ Population unter Verwendung von CD31 und CD45 Magnetkügelchen in distalen Regionen der Lunge aus einer biologischen Probe. B,F Repräsentatives Bild des FACS-Diagramms, das die Gating-Strategie der distalen CD31-/CD45-/CD235a-Population vor und nach der Erschöpfung der CD31/CD45/CD235a-positiven Population (C,G) Epcam+-Population vor und nach der Erschöpfung der positiven Population von CD31/CD45/CD235a zeigt. (D,H) HTII-280+/- Population vor und nach dem Abbau von CD31/CD45/CD235a-positiven Zellen. Die Paneele A-D stammen aus derselben biologischen Probe und die Paneele E-H aus derselben biologischen Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Sortierstrategie für proximale Lungenzellen. (A,E) Prozentsatz der verschiedenen Zellpopulationen vor und nach der Erschöpfung der CD45+ und CD31+ Population unter Verwendung von CD31 und CD45 Magnetkügelchen in proximalen Regionen der Lunge. B,F Repräsentatives Bild des FACS-Diagramms, das die Gating-Strategie der proximalen CD31-/CD45-/CD235a-Population vor und nach der Erschöpfung der CD31/CD45/CD235a-positiven Population (C,G) Epcam+-Population vor und nach der Erschöpfung der positiven Population von CD31/CD45/CD235a zeigt. (D,H) NGFR+/- Population vor und nach dem Abbau von CD31/CD45/CD235a-positiven Zellen. Die Paneele A-D und E-H wurden aus zwei verschiedenen biologischen Proben hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Charakterisierung von distalen Lungenorganoiden. (A) Repräsentatives Bild der menschlichen distalen Organoide, die im Medium PneumaCult-ALI kultiviert sind (2-fache Vergrößerung). (B) Die Koloniebildungseffizienz (%CFE) wurde an dreifachen Vertiefungen von Organoiden berechnet, die aus zwei verschiedenen biologischen Proben gewonnen wurden. (C, C') Immunfluoreszierende Färbung entsprechender distaler Organoide, die in ALI-Medium kultiviert wurden und HTII-280+ AT2-Zellen zeigen (grün). (D, D') Der in dieser Studie verwendete Marker für die Isolierung von AT2-Zellen, HTII-280 costains (grün) für den anderen gut charakterisierten AT2-Zellmarker, SPC (rot). Maßstabsleiste = 50um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Charakterisierung proximaler Organoide aus der menschlichen proximalen Lunge. (A,B) Repräsentatives Bild der humanen proximalen Organoide, die in PneumaCult-ALI medium scale bar 50 μm kultiviert werden. (C) Die prozentuale Koloniebildungseffizienz (%CFE) wurde an dreifachen Vertiefungen von Organoiden berechnet, die aus zwei verschiedenen biologischen Proben gewonnen wurden. Immunfluoreszenzfärbung von differenzierten proximalen Organoiden am Tag 30 mit (D) Krt5+ Basalzellen (grün), FoxJ1+ Flimmerzellen (rot) (E) Krt5+ Basalzellen (grün) und MUC5AC+ Becherzellen (rot). (F) Der in dieser Studie für die Isolierung von Basalzellen verwendete Marker NGFR (grün) kofärbt für den gut charakterisierten Basalzellmarker Krt5 (rot). Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung definierter Subpopulationen von Lungenzellen aus menschlichem Lungengewebe für die molekulare oder funktionelle Analyse und Krankheitsmodellierung. Kritische Elemente der Methoden sind die Fähigkeit, eine Gewebedissoziation unter Konservierung von Oberflächenepitopen zu erreichen, die eine Antikörper-vermittelte Anreicherung frisch isolierter Zellen ermöglichen, und die Optimierung von Kulturmethoden für die effiziente Erzeugung von regionsspezifischen Epithelorganoiden. Wir konzentrieren uns auf die Wiederherstellung und Anreicherung von epithelialen Vorläuferzellen, die in der Lage sind, Organoide zu bilden, wenn sie mit stromalen Stützzellen in dreidimensionaler Kultur rekombiniert werden. Obwohl wir die Klonalität von Organoiden in diesen Kulturen nicht definiert haben, wurde gezeigt, dass ähnliche Studien, die mit isolierten Lungenepithel-Vorläuferzellen der Maus durchgeführt wurden, klonal auf der Verwendung von Mischkulturen von Zellen basieren, die unterschiedliche fluoreszierende Reporter beherbergen 22,23.
Die hierin beschriebenen Verfahren umfassen Anpassungen zur Verbesserung der Zellerholung aus verdautem Lungengewebe. Verdaute Proben werden durch eine 16-Gauge-Nadel geführt, um verbleibende unverdaute Klumpen weiter zu stören und eine homogene Zellsuspension zu erreichen. Die durch extrudierte genomische DNA verursachte Zellaggregation wurde durch Zugabe von DNase I gemildert, wodurch eine homogene Zellpräparation erzeugt wurde, die während der FACS-Isolierung einen ununterbrochenen Fluidikstrom liefert. Zusammen verbessern diese einfachen Modifikationen die Wiederherstellung der Zielzellpopulationen und vermeiden Verzögerungen durch Verklumpungen während der FACS-Anreicherung.
Bisherige Protokolle sehen eine Gewebeverdauung mit Elastase, Dispase und Tripsin/2 mM EDTA vor, um vor der Zellisolierung eine Einzelzellsuspension zu erhalten 4,5. Diese Kombination von Proteasen führt jedoch zum Verlust von Oberflächenproteinen und erfordert, dass Zellen über Nacht auf mit Purcol beschichteten Kulturschalen kultiviert werden, um Oberflächenproteine vor der Antikörperfärbung und FACS wieder zu exprimieren. Im Gegensatz dazu bietet die Kombination von Liberase und mechanischer Bewegung zur sanften Störung des Lungengewebes ein effizienteres, aber milderes Dissoziationsprotokoll, das schneller durchgeführt werden kann, während Oberflächenepitope für die Antikörperfärbung und FACS-Anreicherung erhalten bleiben. Dadurch wird die gesamte Gewebeverarbeitungszeit verkürzt und die FACS-Isolierung kann unmittelbar nach der Gewebedissoziation durchgeführt werden.
Diese Methoden ermöglichen die Isolierung und In-vitro-Kultur von epithelialen Vorläuferzellen, die spezialisierte Nachkommen hervorbringen, die für ihre Herkunftsregion repräsentativ sind. Diese Methoden können jedoch in ähnlicher Weise auf die Identifizierung und Anreicherung anderer Zellpopulationen wie Immun-, Gefäß- und Stromazelltypen angewendet werden. Dies könnte insbesondere auf die Entwicklung regionaler Lungenepithel-on-Chip-Systeme anwendbar sein, die die Modellierung von Gefäß- und Epithelkompartimenten und die Einführung anderer Zelltypen wie Immunzellenermöglichen 24,25,26. In einer kürzlich durchgeführten Studie verwendeten wir 3D-Organoidkulturen des Alveolarepithels, die mit dieser Methodik erzeugt wurden, als Werkzeug zur Untersuchung der COVID-19-Modellierung der Lunge und zum Screening therapeutischer Ziele gegen SARS-CoV-2-Infektionen. 27
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Disclosures
Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir schätzen die Unterstützung von Mizuno Takako für die IFC- und H- und E-Färbung, Vanessa Garcia für die Gewebeschnitte und Anika S Chandrasekaran für die Unterstützung bei der Manuskriptvorbereitung. Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) und dem Celgene IDEAL Consortium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
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