Summary
Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.
Abstract
Modelos organoides epiteliais servem como ferramentas valiosas para estudar a biologia básica de um sistema de órgãos e para modelagem de doenças. Quando cultivadas como organoides, as células progenitoras epiteliais podem se auto-renovar e gerar progêneres diferenciais que exibem funções celulares semelhantes às de suas contrapartes in vivo . Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar progenitores específicos da região do pulmão humano e gerar culturas organoides 3D como uma ferramenta experimental e de validação. Definimos regiões proximais e distais do pulmão com o objetivo de isolar células progenitoras específicas da região. Utilizamos uma combinação de dissociação enzimática e mecânica para isolar células totais do pulmão e da traqueia. Células progenitoras específicas foram então fracionadas das células de origem proximal ou distal usando fluorescência de classificação celular associada (FACS) com base em marcadores de superfície específicos do tipo celular, como NGFR para classificação de células basais e HTII-280 para classificação de células alveolares tipo II. Progenitores basais isolados ou alveolares tipo II foram utilizados para gerar culturas organoides 3D. Tanto progenitores distal quanto proximal formaram organoides com uma colônia formando eficiência de 9-13% na região distal e 7-10% na região proximal quando banhados 5000 células/poços no dia 30. Organoides distais mantiveram células alveolares tipo II HTII-280+ na cultura, enquanto organoides proximais se diferenciaram em células ciliadas e secretary até o dia 30. Essas culturas organoides 3D podem ser utilizadas como uma ferramenta experimental para estudar a biologia celular das interações mesenquimais pulmonares e epiteliais, bem como para o desenvolvimento e validação de estratégias terapêuticas voltadas à disfunção epitelial em uma doença.
Introduction
Os espaços aéreos do sistema respiratório humano podem ser amplamente divididos em zonas de condução e respiratória que mediam o transporte de gases e sua subsequente troca através da barreira epitelial-microvascular, respectivamente. As vias aéreas condutoras incluem traqueia, brônquios, brônquios e brônquios terminais, enquanto os espaços de ar respiratório incluem brônquios respiratórios, dutos alveolares e alvéolos. O revestimento epitelial desses espaços aéreos muda na composição ao longo do eixo proximo-distal para acomodar os requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. O epitélio pseudoesstratificado das vias aéreas traqueo-brônquico é composto por três tipos de células principais, basal, secreto e ciliado, além dos tipos celulares menos abundantes, incluindo escova, neuroendócrina e ionócito 1,2,3. As vias aéreas bronquiolares abrigam tipos de células epiteliais morfologicamente semelhantes, embora haja distinções em suas propriedades abundantes e funcionais. Por exemplo, as células basais são menos abundantes dentro das vias aéreas bronquiolares, e as células secretas incluem uma maior proporção de células de clube versus células de cálice e cálice que predominam nas vias aéreas traqueo-brônquicas. As células epiteliais da zona respiratória incluem um tipo de célula cuboidal mal definida em brônquios respiratórios, além de células alveolares tipo I (ATI) e tipo II (ATII) de dutos alveolares e alveoli 1,4.
A identidade dos tipos de células epiteliais e progenitoras que contribuem para a manutenção e renovação da epitelial em cada zona são incompletamente descritas e em grande parte inferidas a partir de estudos em modelos animais 5,6,7,8. Estudos em camundongos têm mostrado que ou células basais de vias aéreas pseudoestratificadas, ou células de clubes de vias aéreas bronquiolares ou células ATII do epitélio alveolar, servem como células-tronco epiteliais baseadas na capacidade de autoconexação ilimitada e diferenciação multipotente 7,9,10,11,12 . Apesar da incapacidade de realizar estudos de rastreamento de linhagem genética para avaliar a origem dos tipos de células epiteliais pulmonares humanas, a disponibilidade de modelos de cultura baseados em organoides para avaliar o potencial funcional das células-tronco epiteliais e progenitoras fornece uma ferramenta para estudos comparativos entre camundongos ehumanos 13,14,15,16,17.
Descrevemos métodos para o isolamento de tipos de células epiteliais de diferentes regiões do pulmão humano e sua cultura usando um sistema organoide 3D para recapitular os tipos de células regionais. Métodos semelhantes foram desenvolvidos para a análise funcional e modelagem de doenças de células epiteliais de outros sistemas de órgãos 18,19,20,21. Esses métodos fornecem uma plataforma para a identificação de células progenitoras epiteliais regionais, para realizar estudos mecanicistas investigando sua regulação e microambiente, e para permitir a modelagem de doenças e descoberta de medicamentos. Embora estudos de células progenitoras epiteliais pulmonares realizados em modelos animais possam se beneficiar da análise, seja in vivo ou in vitro, insights sobre a identidade das células progenitoras epiteliais pulmonares humanas têm sido em grande parte dependentes da extrapolação de organismos modelo. Como tal, esses métodos fornecem uma ponte para relacionar a identidade e o comportamento dos tipos de células epiteliais pulmonares humanas com seus estudos investigando a regulação de células-tronco/progenitoras.
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Protocol
O tecido pulmonar humano foi obtido de doadores de tecidos falecidos em conformidade com os procedimentos de consentimento desenvolvidos pelo International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) e aprovados pelo Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Processamento de tecidos para isolamento de células pulmonares das regiões traqueo-brônquica ou pequenas vias aéreas/parenchymal (pequenas vias aéreas e alvéolos)
- Prepare e autoclave todos os instrumentos de dissecção, vidros e as soluções apropriadas um dia antes do isolamento celular.
- Ao receber tecido pulmonar, identifique e separe as regiões proximais e distais. A traqueia e os brônquios são considerados "proximais". Para efeitos deste protocolo, a traqueia e as primeiras 2-3 gerações de brônquios são disected e usadas para o isolamento do epitélio das vias aéreas "proximal". Pequenas vias aéreas de 2 mm ou menos de diâmetro e tecido parenchímal circundante são, para efeitos deste protocolo, considerados como epitélio pulmonar "distal" (Figura 1A).
NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o processamento do tecido pulmonar humano devem ser realizados em um armário de biossegurança com uso de equipamentos de proteção individual adequados.
2. Enriquecimento e subseção de pequenas vias aéreas e células progenitoras epiteliais alveolares do tecido pulmonar distal
- Preparação do tecido distal
- Coloque o tecido pulmonar distal em uma placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Coloque o tecido em aproximadamente 1 cm3 pedaços e coloque em um tubo limpo de 50 mL.
- Lave o tecido 3x com HBSS refrigerado, descartando a lavagem do HBSS cada vez para remover o sangue e o fluido do revestimento epitelial.
- Coloque o tecido em uma nova placa de Petri e enxugue com lenços anti-fiapos estéreis. Usando fórceps e tesouras, remova o máximo de pleura visceral (uma delicada membrana transparente que cobre a superfície do pulmão) possível.
- Use uma tesoura para picar tecido em pedaços de aproximadamente 2 mm de diâmetro. Transfira tecido picado em uma placa de Petri limpa e pique ainda mais cortando-o para um tamanho aproximado de 1 mm com uma lâmina de barbear estéril.
- Digestão enzimápica
NOTA: A solução de estoque liberase é de 5 mg/mL (100x) e o estoque da DNase é de 2,5 mg/mL (100x) (Tabela de Materiais).- Adicione 50 μg/mL Liberase e 25 μg/mL DNase em HBSS estérei em um tubo cônico de 50 mL.
- Transfira aproximadamente 2-3 g de tecido picado para um novo tubo cônico de 50 mL com 25 mL de HBSS, contendo Liberase e DNase. Incubar por 40-60 min a 37 °C com agitação contínua usando um conjunto de batedeira a 900 rpm. Após 30 minutos de incubação, triturate tecido digerido usando uma seringa de 30 mL sem agulha para evitar a formação de aglomerados e continuar com a incubação.
NOTA: O tempo de incubação com as enzimas pode variar dependendo do tipo ou condição do tecido. Por exemplo, a digestão enzimática do tecido normal leva aproximadamente 45 minutos. No entanto, o tecido fibroso de amostras de fibrose pulmonar idiopática pode exigir um tempo de incubação mais longo de até 60 minutos. Portanto, monitore cuidadosamente o tecido durante esta etapa para evitar danos aos marcadores de superfície, o que é crucial para o FACS.
- Isolamento de célula única
- Triturar o tecido desenhando 5x através de uma agulha de 16 G instalada em uma seringa de 30 mL. Desenhe a suspensão do tecido em uma pipeta de furo largo e passe por uma série de filtros celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sob pressão de vácuo. Lave o coador com 20 mL de tampão HBSS+ para coletar células restantes. A receita do tampão HBSS+ pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
- Adicione um volume igual de tampão HBSS+, após 45 minutos ao filtrado para inibir a atividade liberase e evitar a digestão excessiva.
- Filtragem centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente e descarte o supernaspe. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) à pelota, balance suavemente o tubo para desalojar a pelota e incubar no gelo por 1 min.
NOTA: A quantidade e o tempo na solução de lise RBC depende do tamanho da pelota. É importante manter as células no gelo e monitorar o tempo na solução de lise RBC cuidadosamente para prevenir a lise das células-alvo. Se a lise RBC for insuficiente, repita o passo. - Adicione 10-20 mL de tampão HBSS+ para neutralizar o buffer de lise RBC. Filtragem centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C.
- Se as células vermelhas (células fantasmas) formarem uma camada nublada acima da pelota celular, resuspende a pelota em 10 mL de tampão HBSS+ e coe a suspensão através de um coador de células de 70 μm para eliminar as células fantasmas. Centrifugar o filtrado a 500 x g por 5 min a 4 °C e proceder com outras etapas.
- Esgotamento das células imunes e células endoteliais (passo opcional)
- Despojar células endoteliais CD31+ e células imunes CD45+ da piscina de células totais usando as microesferas CD31 & CD45 conjugadas a anticorpos anti-humanos monoclonais CD31 e CD45 (igG1) e colunas LS de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais).
- Colete o fluxo através, consistindo principalmente de células epiteliais e estromas, em um tubo estéril fresco e centrífuga-lo a 500 x g por 5 min a 4 °C. Realize uma contagem de células para verificar o número total de células no fluxo.
- Coloração da superfície celular para classificação celular associada à fluorescência (FACS)
- Resuspend 1 x 107 células por 1 mL de tampão HBSS+. Adicione anticorpos primários na concentração necessária e incubar as células por 30 minutos a 4 °C no escuro. Neste estudo, foram utilizados anticorpos primários conjugados fluoróforos, a menos que declarados em contrário. Detalhes de fontes de anticorpos e títulos são descritos na Tabela de Materiais.
NOTA: O HTII-280 é atualmente o melhor anticorpo reativo de superfície que permite a subsetting de células pulmonares distais em frações de células predominantemente aéreas (HTII-280-) e alveolares tipo 2 (HTII-280+). Uma ressalva a essa estratégia é que as células AT1 não estão manchadas usando este método e são mal representadas devido à sua fragilidade. No entanto, as células AT1 são mal representadas em preparações pulmonares distais, presumivelmente devido à sua fragilidade e perda durante a seleção de células viáveis pela FACS e, portanto, representam apenas um contaminante raro da fração celular das vias aéreas. - Lave as células adicionando 3 mL de tampão HBSS+ e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C.
- Se usar anticorpos primários não conjugados, adicione a concentração necessária de um anticorpo secundário conjugado fluorohore apropriado e incubar por 30 minutos no gelo. Lave o excesso de anticorpo secundário adicionando 3 mL de tampão HBSS+ e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte as células supernascidas e resuspendas no buffer HBSS+ por 1 x 107 células/mL. Filtrar células em tubos de poliestireno de 5 mL através de uma tampa de coador para garantir a formação de uma única suspensão celular. Adicione DAPI (1 μg/mL) para manchar células permeáveis (mortas).
NOTA: É essencial usar controles apropriados de cor única e fluorescência menos um (FMO) (ou seja, coquetel de coloração de anticorpos menos um anticorpo cada), para minimizar falsos positivos durante o FACS. Neste estudo, foram utilizadas contas de seleção positivas e negativas para compensação empírica por sobreposição de espectros de emissões entre fluoroforos (Tabela de Materiais). FACS enriquecem tipos de interesse celular. As células epiteliais viáveis são enriquecidas com base em seu fenótipo de superfície celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo e coloração negativa para DAPI. Esta fração de célula epitelial pode ser ainda mais subsettada com base na coloração de marcadores de superfície específicos do tipo celular, como coloração específica para células HTII-280-positivas que são enriquecidas para células AT2. Em contraste, a seleção negativa para HTII-280 permite o enriquecimento de pequenas células epiteliais das vias aéreas, como o clube e as células ciliadas (Figura 2).
- Resuspend 1 x 107 células por 1 mL de tampão HBSS+. Adicione anticorpos primários na concentração necessária e incubar as células por 30 minutos a 4 °C no escuro. Neste estudo, foram utilizados anticorpos primários conjugados fluoróforos, a menos que declarados em contrário. Detalhes de fontes de anticorpos e títulos são descritos na Tabela de Materiais.
3. Enriquecimento e subsequimento de células progenitoras epiteliais das vias aéreas traqueo-brônquica
- Preparação tecidual
- Disseca as vias aéreas proximais (traqueia/bronchi) dos pulmões. Abra as vias aéreas ao longo de seu comprimento usando uma tesoura para expor o lúmen e adicione 50 μg/mL Liberase para cobrir totalmente o tecido.
- Incubar por 20 min a 37 °C com agitação contínua usando uma mistura térmica fixada a 900 rpm.
- Retire as vias aéreas proximais do tubo centrífuga e coloque-a em uma placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Raspe suavemente a superfície das vias aéreas usando um bisturi para retirar completamente as células epiteliais luminais do tecido.
- Lave a placa de Petri com 5 mL de tampão HBSS+ estéril para coletar todas as células epiteliais luminais desalojadas e transfira as células desalojadas para tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Triturar a suspensão desenhando agulha de 5x a 16 G e agulha de 18 G instalada em uma seringa de 10 mL para obter suspensão de célula única.
- Centrifugar a suspensão a 500 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenque a pelota em tampão HBSS+ fresco e armazene essas células das vias aéreas luminal no gelo, prontas para serem combinadas com a suspensão de célula única gerada das vias aéreas proximais picadas nos próximos passos.
- Usando uma tesoura, corte o tecido traqueo-brônquico restante ao longo de seus anéis para gerar pequenas tiras de tecido, e transfira as tiras para uma placa de Petri fresca. Pique as tiras de tecido usando uma única lâmina de barbear lateral para fazer pedaços menores.
NOTA: Uma vez que as vias aéreas proximais são cartilaginosas, elas não podem ser picadas tão finamente quanto o tecido pulmonar distal. - Transfira o tecido picado para os tubos C, adicione 2 mL de Liberase ao tubo garantindo que o tecido esteja submerso. Carregue o tubo C no dissociador automatizado e execute o Protocolo pulmonar humano-2 para dissociar o tecido mecanicamente ainda mais.
NOTA: O dissociador utilizado neste protocolo oferece um programa otimizado chamado protocolo pulmonar humano-2 para esta aplicação específica (ver Tabela de Materiais).
- Digestão enzimápica e isolamento celular único
- Transfira aproximadamente 2 g de tecido proximal picado do tubo C para cada tubo de centrífuga cônica de 50 mL e adicione 50 μg/mL Liberase e 25 μg/mL DNase solução para cada tubo.
NOTA: Para garantir uma dissociação eficiente, os tubos não devem ser preenchidos além da marca de 30 mL. - Incubar o tecido picado por 45 min a 37 °C com agitação contínua usando um conjunto de batedeira a 900 rpm.
- Passe a suspensão do tecido dissociado através de uma série de cepas celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sob pressão de vácuo como mencionado acima e coletar o fluxo através. Lave o coador com 20 mL de tampão HBSS+ para coletar células restantes.
NOTA: Como o tecido proximal é cartilaginoso e volumoso em comparação com o tecido distal, há maior possibilidade de entupimento dos filtros. O uso de um funil pode ajudar a evitar o transbordamento do líquido enquanto passa pelos filtros. - Adicione um volume igual de tampão HBSS+ ao filtrado para inibir a atividade liberase e evitar a digestão excessiva. Adicione as células proximais proximais isoladas de 3.1.5 à suspensão celular nesta etapa.
- Centrifugar a suspensão combinada da célula a 500 x g por 10 min. Remova o supernatante e repita a lavagem celular no buffer HBSS+. Realize o esgotamento das células imunes CD45+ e células endoteliais CD31+ como mencionado acima em 2.4 (etapa opcional).
- Os métodos de coloração são semelhantes ao tecido pulmonar distal, seguem os passos em 2,5. Enriqueça células epiteliais viáveis com base em seu fenótipo de superfície celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo e coloração negativa para DAPI.
- Subconjunte ainda a fração de célula epitelial com base na coloração de marcadores de superfície específicos do tipo celular, como NGFR, permitindo o enriquecimento de tipos de células basais (NGFR positivo) e não basais (NGFR negativo; secretory, ciliado, neuroendócrino) (Figura 3).
- Transfira aproximadamente 2 g de tecido proximal picado do tubo C para cada tubo de centrífuga cônica de 50 mL e adicione 50 μg/mL Liberase e 25 μg/mL DNase solução para cada tubo.
4. Cultura organoide
- Adicione 5.000 (este número pode ser ajustado para produzir a densidade desejada de organoides epiteliais) células proximais ou distais classificadas para tubo estéril de 1,5 mL juntamente com 7,5 x 104 células MRC-5 (linha celular do fibroblasto pulmonar humano). Interações epiteliais-mesenquimais são fundamentais para a expansão das células progenitoras.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C.
NOTA: É importante confirmar manualmente a contagem de células obtida do classificador, a fim de garantir a precisão da colônia organoide formando eficiência. - Remova e descarte cuidadosamente o supernasal e resuspenque a pelota celular em 50 μL de mídia gelada complementada com antibióticos. Mantenha a suspensão celular no gelo.
- Adicione 50 μL de gelo frio 1x fator de crescimento esgotado membrana de membrana de porão médio ao frasco e tubo suavemente a suspensão no gelo para misturar.
NOTA: É importante usar a mídia gelada e manter células no gelo para evitar a polimerização prematura do meio da matriz da membrana do porão. - Transfira a suspensão celular para uma inserção de cultura celular do tamanho de um poro de 0,4 μm em uma placa de 24 poços (1,4 x 104 células/cm2), tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar.
- Incubar a 37 °C por 30-45 min para permitir que a matriz se solidifique.
- Adicione 600 μL de meio de crescimento pré-aquecido ao poço.
NOTA: A mídia foi complementada com agentes antimicocópticos (0,4%) e estreptococos de caneta (1%) nas primeiras 24h após a semeadura e 10 μM Rho kinase inibidor para as primeiras 72 h. - Cultura a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% por 30 dias, período durante o qual a mídia deve ser alterada a cada 48 h.
NOTA: A duração da cultura pode ser alterada com base no propósito do experimento. Pontos finais mais longos são usados para estudar diferenciação, enquanto pontos finais mais curtos de 7 dias, 14 dias etc., podem ser usados se o objetivo do experimento não for alcançar a completa diferenciação. - Adicione 10 μM inibidor de TGFβ aos meios de cultura por 15 dias para manter as células na fase proliferativa e suprimir o crescimento excessivo de fibroblastos.
NOTA: Os resultados diferem de acordo com o meio de cultura utilizado para o ensaio. Por exemplo, os resultados aqui apresentados foram gerados utilizando-se pneumacult-ALI Medium, o que resulta na geração de organoides grandes a partir de pulmão distal, organoides bem diferenciados e maiores do pulmão proximal.
5. Mancha organoide
- Fixação e incorporação de organoides
- Aspirar a mídia das câmaras de inserção transmembrana superior e inferior e enxaguar uma vez com PBS quente.
- Fixar as culturas colocando 300 μL de PFA (2% c/v) na pastilha e 500 μL no poço por 1hr a 37°C. Remova fixativo e enxágue com PBS quente tomando cuidado para não desalojar o plug da matriz de membrana demico-base.
NOTA: Os organoides fixos podem ser armazenados submersos em PBS a 4 °C durante uma a duas semanas antes de iniciar mais etapas. - Aspirar PBS, inverter a pastilha e cortar cuidadosamente a membrana de inserção ao redor de sua periferia. Usando fórceps, remova a membrana transwell, tomando cuidado para não perturbar o plugue de matriz.
- Em uma placa de Petri, toque na pastilha para recuperar o plugue de matriz.
- Adicione uma gota de gel de processamento de espécimes como o Histogel (mantido a 37 °C) ao plugue da matriz e mantenha a 4 °C até que o gel se solidifique.
- Transfira o plugue para um de incorporação, desidrate-se através de concentrações crescentes de etanol (70, 90 e 100%), limpe em xileno e incorpore em cera de parafina.
- Corte seções de 7 μm em um microtome e colete em slides carregados positivamente.
- Coloração de imunofluorescência de organoides
- Coloque slides a 65 °C por 30 min para desapor.
- Desparafinar as seções por imersão no xileno e reidratar através da diminuição das concentrações de etanol.
- Realize a recuperação de antígeno de alta temperatura em solução de unmasking de antígeno, base de ácido cítrico usando um retriever comercialmente disponível mergulhando slides na solução por 15 min (Tabela de Materiais).
- Cerque o tecido com uma barreira hidrofóbica usando uma caneta pap.
- Bloqueie a coloração não específica entre os anticorpos primários e o tecido, incubando no buffer de bloqueio.
- Incubar seções na concentração adequada de anticorpos primários diluídos em solução de incubação durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
- Enxágüe seções 3x à temperatura ambiente com um tampão de lavagem.
- Incubar na concentração adequada de anticorpo secundário conjugado fluorocromo por 1h à temperatura ambiente.
- Enxágüe seções 3x à temperatura ambiente com 0,1% Tween 20-TBS. Incubar seções por 5 min em DAPI (1 μg/mL). Enxágüe seções uma vez em TBS (soro fisiológico tamponado por tris) com 0,1% Tween 20, seca e montagem em uma solução de montagem (Figura 4 e Figura 5).
NOTA: A diluição de trabalho de origem e ideal dos anticorpos primários e secundários utilizados para a coloração da imunofluorescência estão incluídas na Tabela de Materiais.
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Representative Results
Tecido pulmonar de origem
A traqueia e o brônquio extrapulmonar (Figura 1A) foram usados como tecido fonte para o isolamento de células epiteliais das vias aéreas proximais e posterior geração de organoides proximais. O tecido pulmonar distal que inclui tanto o parenchyma quanto as pequenas vias aéreas com menos de 2 mm de diâmetro (Figura 1A) foram utilizados para o isolamento de pequenas vias aéreas e células epiteliais alveolares (epitélio pulmonar distal) e geração de pequenas vias aéreas ou organoides alveolares. As vias aéreas proximais forradas por um epitélio pseudoesstratificado incluem abundantes células progenitoras basais que são imunoreativas para a proteína da membrana NGFR (Figura 1B,C). Em contraste, as células epiteliais que revestem os alvéolos incluíram um subconjunto mostrando imunoreatividade de membrana apical com o anticorpo monoclonal HTII-280, sugestivo de sua identidade alveolar tipo 2 (AT2) (Figura 1B,D). Estes marcadores de superfície foram usados para subconjuntar suspensões de células únicas de células epiteliais isoladas de regiões proximais ou distais.
Dissociação tecidual e fracionamento celular
As suspensões celulares únicas das células totais foram isoladas de regiões proximais ou distais do tecido pulmonar humano e fracionadas usando contas magnéticas e FACS para produzir populações de células epiteliais enriquecidas (Figura 2 e Figura 3). Tipos abundantes de células contaminantes, incluindo glóbulos vermelhos, células imunes e células endoteliais foram manchadas usando anticorpos para CD235a, CD45 e CD31, respectivamente, seguidas pela classificação celular associada a magnético para o esgotamento desses tipos de células do conjunto total de células pulmonares. As suspensões celulares "esgotadas" resultantes foram significativamente enriquecidas para populações de células epiteliais em amostras de tecidos distal (Figura 2E) e proximais (Figura 3E), com aumento correspondente na eficiência do FACS. Após o esgotamento das células positivas CD235a/CD45/CD31 utilizando microesferas CD45 & CD31, a porcentagem de CD31-/CD45-/CD235a passou de 14% (Figura 2A,B) para 51,7% (Figura 2E,F) em população distal. O esgotamento ainda facs das células que mancham positivamente tanto para CD235a, CD45 ou CD31, eliminação de células com coloração positiva para DAPI e seleção positiva para o marcador de superfície celular epitelial CD326, levou a uma população de células distais altamente enriquecida que representou 33,5% (Figura 2E,G) em comparação com 7% (Figura 2A,C ), antes do esgotamento da população negativa. A subseção adicional das populações de células epiteliais distal foi alcançada por fracionamento baseado na coloração superficial com o anticorpo monoclonal HTII-280 (Figura 2D,H), respectivamente. Assim, as células epiteliais pulmonares distal incluíram subconjuntos de pulmão distal (Figura 2D sem esgotamento de CD31/CD45/CD 235a) e 30% HTII-280+ e 3,6% subconjuntos HTII-280-280 (Figura 2H após esgotamento de CD31/CD45/CD235a).
As células totais isoladas da região proximal foram esgotadas para células positivas CD235a/CD45/CD31 utilizando microesferas CD45 & CD31 e a porcentagem de CD31-/CD45-/CD235a- aumentou de 17% (Figura 3A,B) para 56,6% (Figura 3E,F). A seleção positiva para o marcador de superfície da célula epitelial CD326 em células isoladas da região proximal, levou a uma população de células proximais altamente enriquecidas que representava 38% (Figura 3E,G) de frações totais de células pulmonares em comparação com 9,3% (Figura 3A,C) sem esgotamento da população negativa, respectivamente. A subseção adicional das populações proximais de células epiteliais foi alcançada por fracionamento baseado na coloração superficial com anticorpos para NGFR (Figura 3D,H), respectivamente. Assim, as células epiteliais pulmonares proximais incluíram subconjuntos de NGFR+ e 6,5% de NGFR (Figura 3D sem esgotamento de CD31/CD45/CD235a) e 13% NGFR+ e 25% NGFR- (Figura 3H após esgotamento de CD31/CD45/CD235a).
Culturas organoides pulmonares
Organoides epiteliais do pulmão distal foram cultivados dentro da matriz de membrana do porão esgotada pelo fator de crescimento em meios que foram testados empiricamente para otimizar o crescimento organoide e a diferenciação. Três mídias diferentes foram avaliadas, incluindo médio PneumaCult-ALI, meio de crescimento de células epiteliais de pequenas vias aéreas (meio SAECG) e meio basal do rato. O crescimento organoide ideal foi obtido utilizando-se o meio PneumaCult-ALI, selecionado para estudos posteriores. Culturas de células epiteliais pulmonares distais HTII-280+ produziram organoides em rápida expansão com uma eficiência média de formação de colônias de 10% (Figura 4A,B). A coloração da imunofluorescência das culturas do dia 30 usando o anticorpo monoclonal HTII-280 e SPC revelou organoides contendo lúmen compostos predominantemente de células epiteliais pulmonares distal HTII-280+ e SPC+ (Figura 4C, C' e Figura 4D,D'). Culturas de epiteliais pulmonares distal HTII-280- células produziram organoides que eram compostos de um epitélio pseudoesstratificado semelhante ao de pequenas vias aéreas (não mostradas).
Organoides epiteliais proximais pulmonares foram cultivados a partir de células NGFR+ semeadas em Matrigel e cultivadas por 30 dias no meio PneumaCult-ALI. Grandes organoides contendo lúmen foram observados (Figura 5D,E,F) com uma eficiência média de formação de colônias de 7,8% (Figura 5A,B,C). Os organoides eram compostos por um epitélio pseudoestratificado composto por células basais KRT5+ e NGFR+ auto-renovadora (Figura 5D, 5E) e tipos de células luminais diferenciadas, incluindo células ciliadas FoxJ1+ e células secretas MUC5AC+ (Figura 5D,E).
Figura 1: Amostragem de tecido pulmonar humano. (A) Representação esquemática do pulmão humano mostrando estratégia para amostragem de regiões proximais e distais para o isolamento celular. (B) Mancha de H&E das regiões proximais e distais do pulmão. (C,D) Manchas imunofluorescentes de regiões correspondentes mostrando células progenitoras basais NGFR+ (vermelhas) na membrana do porão das vias aéreas brônquicas e progenitores do tipo Alveolar II (verde) no alveoli. barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de classificação representativa para células pulmonares distais. (A,E) Percentual de várias populações celulares antes e depois do esgotamento da população CD45+ e CD31+ usando contas magnéticas CD31 e CD45 em regiões distais do pulmão a partir de uma amostra biológica. (B,F) Imagem representativa da trama FACS mostrando estratégia de gating da população distal CD31-/CD45-/CD235a antes e depois do esgotamento da população positiva CD31/CD45/CD235a (C,G) Epcam+ antes e depois do esgotamento da população cd31/CD45/CD235a positiva. (D,H) População HTII-280+/- população antes e depois do esgotamento das células positivas CD31/CD45/CD235a. Os painéis A-D são da mesma amostra biológica e os painéis E-H são da mesma amostra biológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estratégia representativa de classificação para células pulmonares proximais. (A,E) Percentual de várias populações celulares antes e depois do esgotamento da população CD45+ e CD31+ utilizando contas magnéticas CD31 e CD45 em regiões proximais do pulmão. (B,F) Imagem representativa da trama FACS mostrando estratégia gating da população proximal CD31-/CD45-/CD235a antes e depois do esgotamento da população cd31/CD45/CD235a positiva (C,G) população Epcam+ antes e depois do esgotamento da população CD31/CD45/CD235a positiva. (D,H) NGFR+/- população antes e depois do esgotamento das células positivas CD31/CD45/CD235a. Os painéis A-D e E-H foram preparados a partir de duas amostras biológicas diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização de organoides pulmonares distais. (A) Imagem representativa dos organoides distais humanos cultivados no meio PneumaCult-ALI (ampliação 2x). (B) A Colônia formando eficiência (%CFE) foi calculada sobre poços triplicados de organoides derivados de duas amostras biológicas diferentes. (C, C') Coloração imunofluorescente de organoides distais correspondentes cultivados em meio ALI mostrando células AT2 HTII-280+ (verde). (D, D') O marcador utilizado para o isolamento de células AT2 neste estudo, HTII-280 costains (verde) para outro marcador celular AT2 bem caracterizado, SPC (vermelho). Barra de escala = 50um. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caracterização de organoides proximais do pulmão proximal humano. (A,B) Imagem representativa dos organoides proximais humanos cultivados em barra de média escala PneumaCult-ALI 50 μm. (C) A colônia percentual formando eficiência (%CFE) foi calculada sobre poços triplicados de organoides derivados de duas amostras biológicas diferentes. Coloração imunofluorescente de organoides proximais diferenciados no dia 30 com células basais (D) Krt5+ (verde), células ciliadas FoxJ1+ (vermelhas) (E) células basais Krt5+ (verde) e células de cálice MUC5AC+ (vermelha). (F) O marcador utilizado para o isolamento de células basais neste estudo, NGFR (verde) co-manchas para o marcador de células basais bem caracterizados, Krt5 (vermelho). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos um método confiável para o isolamento de subpopulações definidas de células pulmonares do tecido pulmonar humano para análise molecular ou funcional e modelagem de doenças. Elementos críticos dos métodos incluem a capacidade de alcançar a dissociação tecidual com a preservação de epítopos superficiais, que permitem o enriquecimento mediado por anticorpos de células recém-isoladas, e a otimização de métodos culturais para a geração eficiente de organoides epiteliais específicos da região. Focamos na recuperação e enriquecimento de células progenitoras epiteliais capazes de formar organoides quando recombinadas com células de suporte estromamal na cultura tridimensional. Embora não tenhamos definido a clonalidade dos organoides nessas culturas, estudos semelhantes realizados usando células progenitoras pulmonares isoladas do pulmão mostraram-se clonalmente baseadas no uso de culturas mistas de células que abrigam repórteres fluorescentes distintos22,23.
Os métodos descritos aqui incluem adaptações destinadas a melhorar a recuperação celular do tecido pulmonar digestado. As amostras digeridas são passadas através de uma agulha de calibre 16 para interromper ainda mais qualquer aglomerado não digerido e para obter uma suspensão celular homogênea. A agregação celular causada pelo DNA genômico extrudado foi atenuada pela adição de DNase I, que produziu uma preparação celular homogênea que fornece um fluxo fluido ininterrupto durante o isolamento FACS. Juntas, essas modificações simples aumentam a recuperação das populações de células-alvo e evitam atrasos devido ao agrupamento durante o enriquecimento do FACS.
Protocolos anteriores exigem a digestão tecidual com Elastase, despase e tripsina/2 mM EDTA para produzir uma única suspensão celular antes do isolamentocelular 4,5. No entanto, essa combinação de proteases leva à perda de proteínas superficiais e exige que as células sejam cultivadas durante a noite em pratos de cultura revestidos de purcol para reexpressão de proteínas superficiais antes da coloração de anticorpos e FACS. Em contraste, a combinação de liberase e agitação mecânica para interromper suavemente o tecido pulmonar fornece um protocolo de dissociação mais eficiente, porém mais suave, que pode ser realizado mais rapidamente, preservando epítopos superficiais para coloração de anticorpos e enriquecimento FACS. Assim, o tempo total de processamento do tecido é condensado e o isolamento FACS pode ser realizado imediatamente após a dissociação do tecido.
Esses métodos permitem o isolamento e a cultura in vitro de células progenitoras epiteliais que produzem progênero especializado representativo de sua região de origem. No entanto, esses métodos podem ser aplicados da mesma forma à identificação e enriquecimento de outras populações celulares, como tipos de células imunes, vasculares e estromais. Isso pode ser particularmente aplicável ao desenvolvimento de sistemas regionais de epitélio-on-chip pulmonar que permitem a modelagem de compartimentos vasculares e epiteliais e a introdução de outros tipos celulares, como células imunes 24,25,26. Em um estudo recente, utilizamos culturas organoides 3D de epitélio alveolar gerados utilizando essa metodologia foram utilizadas como ferramenta para estudar a modelagem COVID 19 do pulmão e para testar alvos terapêuticos contra a infecção pelo SARS-CoV-2. 27
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio de Mizuno Takako para a coloração do IFC e H e E, Vanessa Garcia para seção de tecidos e Anika S Chandrasekaran por ajudar na preparação do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) e Consórcio Celgene IDEAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
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