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Biology

ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए मानव फेफड़े उपकला पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव और संवर्धन

Published: July 21, 2020 doi: 10.3791/61541
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

यह लेख ऊतक पृथक्करण और सेलुलर विभाजन दृष्टिकोण के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है जो मानव फेफड़ों के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों से व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है। इसमें इन दृष्टिकोणों को 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति मॉडल के उपयोग के माध्यम से फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया जाता है।

Abstract

उपकला ऑर्गेनोइड मॉडल एक अंग प्रणाली के मूल जीव विज्ञान का अध्ययन करने और रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान उपकरण के रूप में काम करते हैं। जब ऑर्गेनोइड के रूप में उगाया जाता है, तो उपकला पूर्वज कोशिकाएं स्वयं को नवीनीकृत कर सकती हैं और विभेदक संतान उत्पन्न कर सकती हैं जो विवो समकक्षों के समान सेलुलर कार्यों को प्रदर्शित करती हैं। यहां हम मानव फेफड़ों से क्षेत्र-विशिष्ट पूर्वजों को अलग करने और एक प्रयोगात्मक और सत्यापन उपकरण के रूप में 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम क्षेत्र-विशिष्ट पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लक्ष्य के साथ फेफड़ों के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों को परिभाषित करते हैं। हमने फेफड़ों और श्वासनली से कुल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंजाइमी और यांत्रिक पृथक्करण के संयोजन का उपयोग किया। विशिष्ट पूर्वज कोशिकाओं को तब समीपस्थ या डिस्टल मूल कोशिकाओं से सेल प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के आधार पर प्रतिदीप्ति संबद्ध सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके विभाजित किया गया था, जैसे बेसल कोशिकाओं को छांटने के लिए एनजीएफआर और वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं को छांटने के लिए एचटीआईआई -280। पृथक बेसल या वायुकोशीय प्रकार द्वितीय पूर्वजों का उपयोग 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। डिस्टल और समीपस्थ दोनों पूर्वजों ने डिस्टल क्षेत्र में 9-13% और समीपस्थ क्षेत्र में 7-10% की कॉलोनी बनाने वाली दक्षता के साथ ऑर्गेनोइड का गठन किया, जब 30 दिन 5000 सेल / डिस्टल ऑर्गेनोइड्स ने संस्कृति में एचटीआईआई -280+ वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं को बनाए रखा, जबकि समीपस्थ ऑर्गेनोइड 30 दिन तक सिलिएटेड और स्रावी कोशिकाओं में विभेदित हो गए। इन 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग फेफड़ों के उपकला और उपकला मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के साथ-साथ एक बीमारी में उपकला शिथिलता को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों के विकास और सत्यापन के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

मानव श्वसन प्रणाली के हवाई क्षेत्रों को मोटे तौर पर संचालन और श्वसन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है जो क्रमशः उपकला-माइक्रोवास्कुलर बाधा में गैसों के परिवहन और उनके बाद के आदान-प्रदान की मध्यस्थता करते हैं। संचालन वायुमार्ग में श्वासनली, ब्रांकाई, ब्रोंकिओल्स और टर्मिनल ब्रोंकिओल्स शामिल हैं, जबकि श्वसन वायु रिक्त स्थान में श्वसन ब्रोंकिओल्स, वायुकोशीय नलिकाएं और एल्वियोली शामिल हैं। प्रत्येक कार्यात्मक रूप से अलग क्षेत्र की अनूठी आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए इन हवाई क्षेत्रों का उपकला अस्तर प्रॉक्सिमो-डिस्टल अक्ष के साथ संरचना में बदलता है। ट्रेकियो-ब्रोन्कियल वायुमार्ग का छद्म स्तरीकृत उपकला ब्रश, न्यूरोएंडोक्राइन और आयनोसाइट 1,2,3 सहित कम प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के अलावा तीन प्रमुख सेल प्रकारों, बेसल, स्रावी और सिलिएटेड से बना है। ब्रोंकिओलर वायुमार्ग रूपात्मक रूप से समान उपकला कोशिका प्रकारों को बंद करते हैं, हालांकि उनकी बहुतायत और कार्यात्मक गुणों में भेद हैं। उदाहरण के लिए, बेसल कोशिकाएं ब्रोंकिओलर वायुमार्ग के भीतर कम प्रचुर मात्रा में होती हैं, और स्रावी कोशिकाओं में क्लब कोशिकाओं बनाम सीरस और गोबलेट कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात शामिल होता है जो ट्रेकियो-ब्रोन्कियल वायुमार्ग में प्रबल होते हैं।  श्वसन क्षेत्र की उपकला कोशिकाओं में वायुकोशीय प्रकार I (ATI) और वायुकोशीय नलिकाओं और एल्वियोली 1,4 के प्रकार II (एटीआईआई) कोशिकाओं के अलावा श्वसनब्रोंकिओल्स में एक खराब परिभाषित घनाभ कोशिका प्रकार शामिल है।

उपकला स्टेम और पूर्वज सेल प्रकारों की पहचान जो प्रत्येक क्षेत्र में उपकला के रखरखाव और नवीकरण में योगदान करती है, अपूर्ण रूप से वर्णित है और बड़े पैमाने पर पशु मॉडल 5,6,7,8 में अध्ययन से अनुमान लगाया गया है। चूहों में अध्ययन से पता चला है कि या तो छद्म स्तरीकृत वायुमार्ग की बेसल कोशिकाएं, या ब्रोंकिओलर वायुमार्ग की क्लब कोशिकाएं या वायुकोशीय उपकला की एटीआईआई कोशिकाएं, असीमित आत्म-नवीकरण और मल्टीपोटेंट भेदभाव 7,9,10,11,12 की क्षमता के आधार पर उपकला स्टेम कोशिकाओं के रूप में काम करती हैं . मानव फेफड़ों के उपकला कोशिका प्रकारों की स्टेमनेस का आकलन करने के लिए आनुवंशिक वंश अनुरेखण अध्ययन करने में असमर्थता के बावजूद, उपकला स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं की कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए ऑर्गेनोइड-आधारित संस्कृति मॉडल की उपलब्धता माउस और मानव 13,14,15,16,17 के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक उपकरण प्रदान करती है।

हम क्षेत्रीय सेल प्रकारों को पुन: प्राप्त करने के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड सिस्टम का उपयोग करके मानव फेफड़ों और उनकी संस्कृति के विभिन्न क्षेत्रों से उपकला कोशिका प्रकारों के अलगाव के तरीकों का वर्णन करते हैं। इसी तरह के तरीकों को अन्य अंग प्रणालियों 18,19,20,21 से उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण और रोग मॉडलिंग के लिए विकसित किया गया है। ये विधियां क्षेत्रीय उपकला पूर्वज कोशिकाओं की पहचान के लिए एक मंच प्रदान करती हैं, उनके विनियमन और सूक्ष्म वातावरण की जांच करने वाले यंत्रवत अध्ययन करने के लिए, और रोग मॉडलिंग और दवा की खोज को सक्षम करने के लिए। भले ही पशु मॉडल में किए गए फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं के अध्ययन से विश्लेषण से लाभ हो सकता है, या तो विवो या इन विट्रो में, मानव फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं की पहचान में अंतर्दृष्टि काफी हद तक मॉडल जीवों से एक्सट्रपलेशन पर निर्भर रही है। पूर्वज कोशिकाओं के विनियमन की जांच करने वाले अपने अध्ययन के साथ मानव फेफड़ों के उपकला कोशिका प्रकारों की पहचान और व्यवहार से संबंधित एक पुल प्रदान करते हैं।

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Protocol

मानव फेफड़ों के ऊतकों को इंटरनेशनल इंस्टीट्यूट फॉर द एडवांसमेंट ऑफ मेडिसिन (आईआईएएम) द्वारा विकसित सहमति प्रक्रियाओं के अनुपालन में मृत ऊतक दाताओं से प्राप्त किया गया था और देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

पैरेन्काइमल (छोटे वायुमार्ग और एल्वियोली) क्षेत्रों से फेफड़ों की कोशिकाओं के अलगाव के लिए ऊतक प्रसंस्करण

  1. सेल अलगाव से एक दिन पहले सभी विच्छेदन उपकरणों, कांच के बने पदार्थ और उपयुक्त समाधान तैयार करें और आटोक्लेव करें।
  2. फेफड़ों के ऊतकों को प्राप्त करने पर, समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों की पहचान करें और अलग करें। श्वासनली और ब्रांकाई को "समीपस्थ" माना जाता है। इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, श्वासनली और ब्रांकाई की पहली 2-3 पीढ़ियों को विघटित किया जाता है और "समीपस्थ" वायुमार्ग उपकला के अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है। व्यास में 2 मिमी या उससे कम के छोटे वायुमार्ग और आसपास के पैरेन्काइमल ऊतक, इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए, "डिस्टल" फेफड़े उपकला (चित्रा 1 ए) के रूप में माना जाता है।
    नोट: मानव फेफड़ों के ऊतकों के प्रसंस्करण से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के उपयोग के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

2. डिस्टल फेफड़ों के ऊतकों से छोटे वायुमार्ग और वायुकोशीय उपकला पूर्वज कोशिकाओं का संवर्धन और सबसेटिंग

  1. डिस्टल ऊतक की तैयारी
    1. एक बाँझ पेट्री डिश (150 x 15 मिमी) में डिस्टल फेफड़ों के ऊतकों को रखें। लगभग 1 सेमी3 टुकड़ों में पासा ऊतक और एक साफ 50 एमएल ट्यूब में जगह है।
    2. ठंडा एचबीएसएस के साथ ऊतक 3 एक्स धो लें, रक्त और उपकला अस्तर तरल पदार्थ को हटाने के लिए हर बार एचबीएसएस धोने को त्याग दें।
    3. ऊतक को एक नए पेट्री डिश में रखें और बाँझ एंटी-लिंट वाइप्स के साथ सूखा धब्बा दें। संदंश और कैंची का उपयोग करके, जितना संभव हो उतना आंत का फुस्फुस (एक नाजुक पारदर्शी झिल्ली जो फेफड़ों की सतह को कवर करता है) को हटा दें।
    4. लगभग 2 मिमी व्यास के टुकड़ों में ऊतक कीमा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। एक साफ पेट्री डिश में कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण और एक बाँझ एकतरफा रेजर ब्लेड के साथ 1 मिमी के अनुमानित आकार में इसे काटकर आगे कीमा बनाएं।
  2. एंजाइम पाचन
    नोट: लाइबेरेज़ स्टॉक समाधान 5 मिलीग्राम / एमएल (100 एक्स) है और डीएनए स्टॉक 2.5 मिलीग्राम / एमएल (100 एक्स) (सामग्री की तालिका) है।
    1. एमएल लिबेरेस और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ एचबीएसएस में 25 μg / एमएल डीएनएस जोड़ें।
    2. एचबीएसएस के 25 मिलीलीटर के साथ एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक के लगभग 2-3 ग्राम स्थानांतरित करें, जिसमें लिबेरेज़ और डीनेस शामिल हैं। 900 आरपीएम पर एक मिक्सर सेट का उपयोग कर निरंतर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 40-60 मिनट के लिए सेते हैं। इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, गुच्छों के गठन से बचने और इनक्यूबेशन के साथ जारी रखने के लिए सुई के बिना 30 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके पचाने वाले ऊतक को ट्राइट्यूरेट करें।
      नोट: एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन समय ऊतक के प्रकार या स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, सामान्य ऊतक के एंजाइमी पाचन में लगभग 45 मिनट लगते हैं। हालांकि, अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस नमूनों से फाइब्रोटिक ऊतक को 60 मिनट तक के लंबे इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए, सतह मार्करों को नुकसान को रोकने के लिए इस चरण के दौरान ऊतक की सावधानीपूर्वक निगरानी करें, जो एफएसीएस के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. एकल कोशिका अलगाव
    1. एक 30 मिलीलीटर सिरिंज के लिए फिट एक 16 जी सुई के माध्यम से 5x ड्राइंग द्वारा ऊतक ट्राइट्यूरेट। एक विस्तृत बोर पिपेट में ऊतक निलंबन ड्रा और वैक्यूम दबाव के तहत सेल छलनी (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) की एक श्रृंखला के माध्यम से पारित करें। शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एचबीएसएस + बफर के 20 मिलीलीटर के साथ छलनी को धो लें। एचबीएसएस + बफर के लिए नुस्खा सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।
    2. एचबीएसएस + बफर की एक समान मात्रा जोड़ें, लिबेरेस गतिविधि को बाधित करने और अति-पाचन को रोकने के लिए छानना करने के लिए 45 मिनट के बाद।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र निस्पंदन। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें। गोली के लिए लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे गोली को हटाने और 1 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं करने के लिए ट्यूब रॉक।
      नोट: आरबीसी लिसिस समाधान में राशि और समय गोली के आकार पर निर्भर करता है। बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखना और लक्ष्य कोशिकाओं के लसीका को रोकने के लिए आरबीसी लाइसिस समाधान में समय की सावधानीपूर्वक निगरानी करना महत्वपूर्ण है। यदि आरबीसी लाइसिस अपर्याप्त है, तो चरण दोहराएं।
    4. आरबीसी लाइसिस बफर को बेअसर करने के लिए एचबीएसएस + बफर के 10-20 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र निस्पंदन।
    5. यदि लाल रक्त कोशिकाएं (भूत कोशिकाएं) सेल गोली के ऊपर एक बादल परत बनाती हैं, तो एचबीएसएस + बफर के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और भूत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए 70 μm सेल छलनी के माध्यम से निलंबन को तनाव दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर छानना अपकेंद्रित्र और आगे के चरणों के साथ आगे बढ़ें।
  4. प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंडोथेलियल सेल की कमी (वैकल्पिक चरण)
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार मोनोक्लोनल एंटी-ह्यूमन सीडी 31 और सीडी 45 एंटीबॉडी (आइसोटाइप माउस आईजीजी 1) और एलएस कॉलम के लिए संयुग्मित सीडी 31 और सीडी 45 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके कुल कोशिकाओं के पूल से सीडी 31 + एंडोथेलियल कोशिकाओं और सीडी 45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कम करें।
    2. एक ताजा बाँझ ट्यूब में मुख्य रूप से उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं से मिलकर प्रवाह ले लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। के माध्यम से प्रवाह में कोशिकाओं की कुल संख्या का पता लगाने के लिए एक सेल गिनती प्रदर्शन करें।
  5. प्रतिदीप्ति से जुड़े सेल छँटाई (एफएसीएस) के लिए सेल सतह धुंधला
    1. एचबीएसएस + बफर के 1 एमएल प्रति 1 एक्स 107 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आवश्यक एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। इस अध्ययन में, फ्लोरोफोर संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग तब तक किया गया था जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया था। एंटीबॉडी स्रोतों और टाइटर्स का विवरण सामग्री की तालिका में वर्णित है।
      नोट: एचटीआईआई -280 वर्तमान में सबसे अच्छी सतह प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी है जो मुख्य रूप से वायुमार्ग (एचटीआईआई -280-) और वायुकोशीय प्रकार 2 (एचटीआईआई -280+) सेल अंशों में डिस्टल फेफड़ों की कोशिकाओं के सबसेटिंग की अनुमति देता है। इस रणनीति के लिए एक चेतावनी यह है कि एटी 1 कोशिकाओं को इस विधि का उपयोग करके दाग नहीं दिया जाता है और उनकी नाजुकता के कारण खराब प्रतिनिधित्व किया जाता है। हालांकि, एटी 1 कोशिकाओं को डिस्टल फेफड़ों के प्रेप्स में खराब प्रतिनिधित्व किया जाता है, संभवतः एफएसीएस द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं के चयन के दौरान उनकी नाजुकता और हानि के कारण और इस प्रकार केवल वायुमार्ग सेल अंश के दुर्लभ संदूषक का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    2. एचबीएसएस + बफर के 3 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    3. यदि असंयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो एक उपयुक्त फ्लोरोफोर संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यक एकाग्रता जोड़ें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। एचबीएसएस + बफर के 3 एमएल और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र जोड़कर अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को धो लें।
    4. एमएल प्रति एचबीएसएस + बफर में सतह पर तैरनेवाला और पुन: निलंबितकोशिकाओं को त्यागें। एक एकल सेल निलंबन के गठन को सुनिश्चित करने के लिए एक छलनी टोपी के माध्यम से 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों में कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। पारगम्य (मृत) कोशिकाओं को दागने के लिए डीएपीआई (1 μg / एमएल) जोड़ें।
      नोट: एफएसीएस के दौरान झूठी सकारात्मकता को कम करने के लिए उपयुक्त एकल-रंग और प्रतिदीप्ति माइनस एक (एफएमओ) नियंत्रण (यानी, एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल माइनस एक एंटीबॉडी प्रत्येक) का उपयोग करना आवश्यक है। इस अध्ययन में, फ्लोरोफोरस (सामग्री की तालिका) के बीच उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के ओवरलैप के लिए अनुभवजन्य मुआवजे के लिए सकारात्मक और नकारात्मक चयन मोतियों का उपयोग किया गया था। एफएसीएस सेल प्रकार की रुचि को समृद्ध करता है। व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं को उनके सीडी 45-नकारात्मक, सीडी 31-नकारात्मक, सीडी 236-सकारात्मक सेल सतह फेनोटाइप और डीएपीआई के लिए नकारात्मक धुंधला होने के आधार पर समृद्ध किया जाता है। इस उपकला सेल अंश को सेल प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के लिए धुंधला होने के आधार पर आगे बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि एचटीआईआई -280-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट धुंधला जो एटी 2 कोशिकाओं के लिए समृद्ध हैं। इसके विपरीत, एचटीआईआई -280 के लिए नकारात्मक चयन क्लब और सिलिएटेड कोशिकाओं (चित्रा 2) जैसे छोटे वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है।

3. ट्रेकियो-ब्रोन्कियल वायुमार्ग से उपकला पूर्वज कोशिकाओं का संवर्धन और सबसेटिंग

  1. ऊतक की तैयारी
    1. फेफड़ों से समीपस्थ वायुमार्ग (श्वासनली / ब्रांकाई) को विच्छेदित करें। लुमेन को बेनकाब करने के लिए कैंची का उपयोग करके उनकी लंबाई के साथ वायुमार्ग खोलें और ऊतक को पूरी तरह से कवर करने के लिए 50 μg /
    2. 900 आरपीएम पर एक थर्मो मिक्सर सेट का उपयोग कर निरंतर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. अपकेंद्रित्र ट्यूब से समीपस्थ वायुमार्ग निकालें और इसे एक बाँझ पेट्री डिश (150 x 15 मिमी) में रखें। धीरे ऊतक से ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं को पूरी तरह से पट्टी करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करके वायुमार्ग की सतह को खुरचें।
    4. सभी विस्थापित ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में विस्थापित कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए बाँझ एचबीएसएस + बफर के 5 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश को धो लें। एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 16 जी सुई और 18 जी सुई के माध्यम से 5x ड्राइंग करके निलंबन को ट्राइट्यूरेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र। ताजा एचबीएसएस + बफर में गोली को फिर से निलंबित करें और इन ल्यूमिनल वायुमार्ग कोशिकाओं को बर्फ पर स्टोर करें, जो आगामी चरणों में कीमा बनाया हुआ समीपस्थ वायुमार्ग से उत्पन्न एकल सेल निलंबन के साथ संयुक्त होने के लिए तैयार हैं।
    6. कैंची का उपयोग करके, ऊतक की छोटी स्ट्रिप्स उत्पन्न करने के लिए अपने छल्ले के साथ शेष ट्रेकियो-ब्रोन्कियल ऊतक को काट लें, और स्ट्रिप्स को एक ताजा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। छोटे टुकड़े बनाने के लिए एक तरफा रेजर ब्लेड का उपयोग करके ऊतक स्ट्रिप्स को कीमा बनाएं।
      नोट: चूंकि समीपस्थ वायुमार्ग कार्टिलाजिनस हैं, इसलिए उन्हें डिस्टल फेफड़ों के ऊतकों के रूप में बारीक नहीं किया जा सकता है।
    7. कीमा बनाया हुआ ऊतक को सी ट्यूबों में स्थानांतरित करें, ट्यूब में 2 मिलीलीटर लाइबेरेज़ जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऊतक जलमग्न है। स्वचालित पृथक्करण पर सी ट्यूब लोड करें और यांत्रिक रूप से ऊतक को और अलग करने के लिए मानव फेफड़े प्रोटोकॉल -2 चलाएं।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त विघटनकारी इस विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए मानव फेफड़े प्रोटोकॉल -2 नामक एक अनुकूलित कार्यक्रम प्रदान करता है (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एंजाइम पाचन और एकल कोशिका अलगाव
    1. प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में सी ट्यूब से कीमा बनाया हुआ समीपस्थ ऊतक के लगभग 2 ग्राम स्थानांतरण और प्रत्येक ट्यूब के लिए 50 μg /
      नोट: कुशल पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूबों को 30 एमएल निशान से परे नहीं भरा जाना चाहिए।
    2. 900 आरपीएम पर एक मिक्सर सेट का उपयोग कर निरंतर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक सेते हैं।
    3. ऊपर वर्णित वैक्यूम दबाव के तहत सेल छलनी (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) की एक श्रृंखला के माध्यम से पृथक ऊतक निलंबन पास करें और प्रवाह को इकट्ठा करें। शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एचबीएसएस + बफर के 20 मिलीलीटर के साथ छलनी को धो लें।
      नोट: चूंकि समीपस्थ ऊतक डिस्टल ऊतक की तुलना में कार्टिलाजिनस और भारी है, इसलिए फिल्टर के क्लॉगिंग की अधिक संभावना है। एक फ़नल का उपयोग करने से छलनी से गुजरते समय तरल के अतिप्रवाह को रोकने में मदद मिल सकती है।
    4. लिबेरेस गतिविधि को बाधित करने और अति-पाचन को रोकने के लिए छानना में एचबीएसएस + बफर की एक समान मात्रा जोड़ें। इस चरण में सेल निलंबन के लिए 3.1.5 से पृथक ल्यूमिनल समीपस्थ वायुमार्ग कोशिकाओं को जोड़ें।
    5. 10 मिनट के लिए 500 x g पर संयुक्त सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एचबीएसएस + बफर में सेल धोने को दोहराएं। सीडी 45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं और सीडी 31 + एंडोथेलियल कोशिकाओं की कमी करें जैसा कि 2.4 (वैकल्पिक चरण) में ऊपर उल्लेख किया गया है।
    6. धुंधला करने के तरीके डिस्टल फेफड़ों के ऊतकों के समान हैं, 2.5 में चरणों का पालन करें। डीएपीआई के लिए उनके सीडी 45-नकारात्मक, सीडी 31-नकारात्मक, सीडी 236-सकारात्मक सेल सतह फेनोटाइप और नकारात्मक धुंधला के आधार पर व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं को समृद्ध करें।
    7. एनजीएफआर जैसे सेल प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के लिए धुंधला होने के आधार पर उपकला सेल अंश को सबसेट करें, बेसल (एनजीएफआर पॉजिटिव) और गैर-बेसल (एनजीएफआर नकारात्मक; स्रावी, सिलिएटेड, न्यूरोएंडोक्राइन) सेल प्रकार (चित्रा 3) के संवर्धन की अनुमति देता है।

4. ऑर्गेनोइड संस्कृति

  1. 5,000 जोड़ें (इस संख्या को उपकला ऑर्गेनोइड के वांछित घनत्व को उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया जा सकता है) 7.5 x 104 एमआरसी -5 कोशिकाओं (मानव फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन) के साथ बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए समीपस्थ या डिस्टल उपकला कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। पूर्वज कोशिकाओं के विस्तार के लिए उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन महत्वपूर्ण हैं।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: सटीकता ऑर्गेनोइड कॉलोनी बनाने की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए सॉर्टर से प्राप्त सेल गिनती की मैन्युअल रूप से पुष्टि करना महत्वपूर्ण है।
  3. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटाने और त्यागें और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बर्फ-ठंडे मीडिया के 50 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  4. शीशी के लिए बर्फ ठंडा 1x विकास कारक समाप्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम के 50 μL जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए बर्फ पर निलंबन विंदुक।
    नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के समय से पहले पोलीमराइजेशन से बचने के लिए बर्फ ठंडे मीडिया का उपयोग करना और बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
  5. हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, एक 24 अच्छी तरह से प्लेट (1.4 x 10 4 कोशिकाओं / सेमी2) में0.4 μm ताकना आकार सेल संस्कृति डालने पर सेल निलंबन स्थानांतरण।
  6. मैट्रिक्स को जमने की अनुमति देने के लिए 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व गर्म विकास माध्यम के 600 μL जोड़ें।
    नोट: मीडिया को एंटीमाइकोटिक एजेंटों (0.4%) और पेन स्ट्रेप (1%) के साथ बोने के बाद पहले 24 घंटे के लिए पूरक किया गया था और पहले 72 घंटे के लिए 10 μM रो किनेज अवरोधक।
  8. 30 दिनों के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, जिसके दौरान मीडिया को हर 48 घंटे में बदलना चाहिए।
    नोट: संस्कृति की अवधि प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर बदला जा सकता है। भेदभाव का अध्ययन करने के लिए लंबे समापन बिंदुओं का उपयोग किया जाता है जबकि 7 दिनों, 14 दिनों आदि के छोटे समापन बिंदुओं का उपयोग किया जा सकता है यदि प्रयोग का उद्देश्य पूर्ण भेदभाव प्राप्त करना नहीं है।
  9. प्रोलिफेरेटिव चरण में कोशिकाओं को बनाए रखने और फाइब्रोब्लास्ट्स के अतिवृद्धि को दबाने के लिए 15 दिनों के लिए संस्कृति मीडिया में 10 μM TGFβ अवरोधक जोड़ें।
    नोट: परिणाम परख के लिए इस्तेमाल संस्कृति माध्यम के अनुसार भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, यहां दिखाए गए परिणाम न्यूमैकल्ट-एएलआई मीडियम का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप डिस्टल फेफड़ों से बड़े ऑर्गेनोइड, समीपस्थ फेफड़ों से अच्छी तरह से विभेदित और बड़े ऑर्गेनोइड की पीढ़ी होती है।

5. ऑर्गेनोइड धुंधला होना

  1. ऑर्गेनोइड का फिक्सिंग और एम्बेडिंग
    1. ऊपरी और निचले ट्रांसमेम्ब्रेन दोनों से एस्पिरेट मीडिया कक्षों को सम्मिलित करें और गर्म पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें।
    2. डालने में पीएफए (2% डब्ल्यू / वी) के 300 μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कुएं में 500 μL रखकर संस्कृतियों को ठीक करें। बेसमेमेम झिल्ली मैट्रिक्स प्लग को हटाने के लिए ध्यान रखने वाले गर्म पीबीएस के साथ फिक्सेटिव निकालें और कुल्ला करें।
      नोट: फिक्स्ड ऑर्गेनोइड को आगे के कदम शुरू करने से पहले एक से दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में जलमग्न संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. एस्पिरेट पीबीएस, डालने को उल्टा करें और इसकी परिधि के चारों ओर डालने वाली झिल्ली को सावधानीपूर्वक काटें। संदंश का उपयोग कर, ट्रांसवेल झिल्ली को हटा दें, मैट्रिक्स प्लग को परेशान न करने का ध्यान रखें।
    4. पेट्री डिश में, मैट्रिक्स प्लग को पुनर्प्राप्त करने के लिए सम्मिलित करें टैप करें।
    5. मैट्रिक्स प्लग में हिस्टोगेल (37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया) जैसे नमूना प्रसंस्करण जेल की एक बूंद जोड़ें और जेल जमने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    6. प्लग को एम्बेडिंग कैसेट में स्थानांतरित करें, इथेनॉल (70, 90 और 100%) की बढ़ती सांद्रता के माध्यम से निर्जलीकरण करें, जाइलीन में स्पष्ट और पैराफिन मोम में एम्बेड करें।
    7. एक माइक्रोटोम पर 7 μm वर्गों में कटौती और सकारात्मक चार्ज स्लाइड पर इकट्ठा.
  2. ऑर्गेनोइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना
    1. डीवैक्स करने के लिए 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड रखें।
    2. इथेनॉल की घटती सांद्रता के माध्यम से जाइलीन और पुनर्जलीकरण में विसर्जन करके वर्गों को डिपराफिनाइज करें।
    3. एंटीजन अनमास्किंग समाधान में उच्च तापमान एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें, साइट्रिक एसिड बेस 15 मिनट (सामग्री की तालिका) के लिए समाधान में स्लाइड डुबोकर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिट्रीवर का उपयोग करके।
    4. पैप पेन का उपयोग करके एक हाइड्रोफोबिक बाधा के साथ ऊतक को घेरें।
    5. ब्लॉक बफर में इनक्यूबेटिंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी और ऊतक के बीच गैर-विशिष्ट धुंधला ब्लॉक करें।
    6. एक आर्द्र कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता में वर्गों सेते हैं।
    7. एक धोने बफर के साथ कमरे के तापमान पर अनुभागों 3x कुल्ला।
    8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फ्लोरोक्रोम संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता में सेते हैं।
    9. 0.1% ट्वीन 20-टीबीएस के साथ कमरे के तापमान पर अनुभाग 3 एक्स कुल्ला डीएपीआई (1 μg / एमएल) में 5 मिनट के लिए अनुभागों सेते हैं। 0.1% ट्वीन 20 के साथ टीबीएस (ट्रिस-बफर खारा) में एक बार अनुभागों कुल्ला, एक बढ़ते समाधान (चित्रा 4 और चित्रा 5) में सूखा और माउंट।
      नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के स्रोत और इष्टतम कामकाजी कमजोर पड़ने को सामग्री की तालिका में शामिल किया गया है।

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Representative Results

स्रोत फेफड़ों के ऊतक
श्वासनली और एक्स्ट्रापल्मोनरी ब्रोंकस (चित्रा 1 ए) समीपस्थ वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के अलगाव और समीपस्थ ऑर्गेनोइड की बाद की पीढ़ी के लिए स्रोत ऊतक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डिस्टल फेफड़ों के ऊतक जिसमें पैरेन्काइमा और व्यास में 2 मिमी से कम के छोटे वायुमार्ग दोनों शामिल हैं (चित्रा 1 ए) का उपयोग छोटे वायुमार्ग और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (डिस्टल फेफड़े उपकला) के अलगाव और छोटे वायुमार्ग या वायुकोशीय ऑर्गेनोइड की पीढ़ी के लिए किया गया था। एक छद्म स्तरीकृत उपकला द्वारा पंक्तिबद्ध समीपस्थ वायुमार्ग में प्रचुर मात्रा में बेसल पूर्वज कोशिकाएं शामिल हैं जो झिल्ली प्रोटीन एनजीएफआर (चित्रा 1बी, सी) के लिए प्रतिरक्षात्मक हैं। इसके विपरीत, एल्वियोली अस्तर उपकला कोशिकाओं में एचटीआईआई -280 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एपिकल झिल्ली इम्यूनोरेक्टिविटी दिखाने वाला एक सबसेट शामिल था, जो उनके वायुकोशीय प्रकार 2 सेल (एटी 2) पहचान (चित्रा 1बी, डी) का विचारोत्तेजक था। इन सतह मार्करों का उपयोग समीपस्थ या डिस्टल क्षेत्रों से पृथक उपकला कोशिकाओं के एकल कोशिका निलंबन को सबसेट करने के लिए किया गया था।

ऊतक पृथक्करण और कोशिका विभाजन
कुल कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन मानव फेफड़ों के ऊतकों के समीपस्थ या डिस्टल क्षेत्रों से अलग किए गए थे और समृद्ध उपकला सेल आबादी (चित्रा 2 और चित्रा 3) उपज के लिए चुंबकीय मनका और एफएसीएस दोनों का उपयोग करके विभाजित थे। लाल रक्त कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित प्रचुर मात्रा में दूषित कोशिका प्रकारों को क्रमशः सीडी 235 ए, सीडी 45 और सीडी 31 के एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया था, इसके बाद फेफड़ों की कोशिकाओं के कुल पूल से इन सेल प्रकारों की कमी के लिए चुंबकीय से जुड़े सेल सॉर्टिंग के बाद। परिणामी "समाप्त" सेल निलंबन एफएसीएस दक्षता में इसी वृद्धि के साथ डिस्टल (चित्रा 2 ई) और समीपस्थ (चित्रा 3 ई) ऊतक नमूनों दोनों में उपकला सेल आबादी के लिए काफी समृद्ध थे।  सीडी 45 और सीडी 31 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके सीडी 235 ए / सीडी 45 / सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं की कमी के बाद सीडी 31- / सीडी 45 - / सीडी 235 ए का प्रतिशत - 14% (चित्रा 2ए, बी) से 51.7% (चित्रा 2ई, एफ) तक बढ़ गया। इसके अलावा सीडी 235 ए, सीडी 45 या सीडी 31 के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं की एफएसीएस कमी, डीएपीआई के लिए सकारात्मक धुंधला के साथ कोशिकाओं का उन्मूलन और उपकला सेल सतह मार्कर सीडी 326 के लिए सकारात्मक चयन, एक अत्यधिक समृद्ध डिस्टल सेल आबादी का नेतृत्व किया जो 7% (चित्रा 2ए, सी) की तुलना में 33.5% (चित्रा 2ई, जी) के लिए जिम्मेदार है ) नकारात्मक जनसंख्या की कमी से पहले। डिस्टल उपकला सेल आबादी के आगे सबसेटिंग क्रमशः एचटीआईआई -280 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (चित्रा 2डी, एच) के साथ सतह धुंधला होने के आधार पर विभाजन द्वारा प्राप्त किया गया था। तदनुसार, डिस्टल फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं में 4.3% एचटीआईआई -280+ और 2.6% एचटीआईआई -280- सबसेट (सीडी 31 / सीडी 45 / सीडी 235 ए की कमी के बिना चित्रा 2 डी) और 30% एचटीआईआई -280 + और 3.6% एचटीआईआई -280- सबसेट (सीडी 31 / सीडी 45 / सीडी 235 की कमी के बाद चित्रा 2 एच) शामिल थे।

समीपस्थ क्षेत्र से पृथक कुल कोशिकाओं को सीडी 45 और सीडी 31 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके सीडी 235 ए / सीडी 45 / सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए समाप्त कर दिया गया था और सीडी 31- / सीडी 45 - / सीडी 235 ए का प्रतिशत 17% (चित्रा 3ए, बी) से 56.6% (चित्रा 3ई, एफ) तक बढ़ गया था। समीपस्थ क्षेत्र से पृथक कोशिकाओं में उपकला सेल सतह मार्कर सीडी 326 के लिए सकारात्मक चयन, एक अत्यधिक समृद्ध समीपस्थ सेल आबादी है कि क्रमशः नकारात्मक आबादी की कमी के बिना 9.3% (चित्रा 3 ए, सी) की तुलना में कुल फेफड़ों की कोशिका अंशों के 38% (चित्रा 3 ई, जी) के लिए जिम्मेदार है करने के लिए नेतृत्व किया। समीपस्थ उपकला सेल आबादी के आगे सबसेटिंग क्रमशः एनजीएफआर (चित्रा 3डी, एच) के एंटीबॉडी के साथ सतह धुंधला के आधार पर विभाजन द्वारा प्राप्त किया गया था। तदनुसार, समीपस्थ फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं में 2.7% एनजीएफआर + और 6.5% एनजीएफआर- सबसेट (सीडी 31/ सीडी 45 / सीडी 235 ए की कमी के बिना चित्रा 3 डी) और 13% एनजीएफआर + और 25% एनजीएफआर- (सीडी 31 / सीडी 45 / सीडी 235 ए की कमी के बाद चित्रा 3 एच) शामिल थे।

फेफड़े के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों
डिस्टल फेफड़े के उपकला ऑर्गेनोइड को मीडिया में विकास-कारक समाप्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर सुसंस्कृत किया गया था जिसे ऑर्गेनोइड विकास और भेदभाव के लिए अनुकूलित करने के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया गया था। न्यूमाकल्ट-एएलआई माध्यम, छोटे वायुमार्ग उपकला कोशिका विकास माध्यम (एसएईसीजी माध्यम) और माउस बेसल माध्यम सहित तीन अलग-अलग मीडिया का मूल्यांकन किया गया था। इष्टतम ऑर्गेनोइड विकास न्यूमाकल्ट-एएलआई माध्यम का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जिसे आगे के अध्ययन के लिए चुना गया था। एचटीआईआई -280 + डिस्टल फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं की संस्कृतियों ने 10% (चित्रा 4ए, बी) की औसत कॉलोनी बनाने की दक्षता के साथ तेजी से विस्तार करने वाले ऑर्गेनोइड का उत्पादन किया। एचटीआईआई -280 और एसपीसी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके दिन 30 संस्कृतियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से मुख्य रूप से एचटीआईआई -280 + और एसपीसी + डिस्टल फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं (चित्रा 4सी, सी 'और चित्रा 4 डी, डी') से बने लुमेन युक्त ऑर्गेनोइड का पता चला। डिस्टल फेफड़ों के उपकला एचटीआईआई -280- कोशिकाओं की संस्कृतियों ने ऑर्गेनोइड का उत्पादन किया जो छोटे वायुमार्ग (नहीं दिखाया गया) के समान एक छद्म स्तरीकृत उपकला से बने थे।

समीपस्थ फेफड़ों के उपकला ऑर्गेनोइड को एनजीएफआर + कोशिकाओं से मैट्रिगेल में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से सुसंस्कृत किया गया था और न्यूमाकल्ट-एएलआई माध्यम में 30 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। बड़े लुमेन युक्त ऑर्गेनोइड 7.8% (चित्रा 5ए, बी, सी) की औसत कॉलोनी बनाने की दक्षता के साथ (चित्रा 5 डी, ई, एफ) देखे गए थे। ऑर्गेनोइड्स एक छद्म स्तरीकृत उपकला से बने थे जो स्व-नवीनीकरण केआरटी 5 + और एनजीएफआर + बेसल कोशिकाओं (चित्रा 5 डी, 5 ई) और फॉक्सजे 1 + सिलिएटेड कोशिकाओं और एमयूसी 5 एसी + स्रावी कोशिकाओं (चित्रा 5डी, ई) सहित विभेदित ल्यूमिनल सेल प्रकारों से बना था।

Figure 1
चित्रा 1: मानव फेफड़ों के ऊतकों का नमूना। (ए) सेल अलगाव के लिए समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों के नमूने के लिए रणनीति दिखाते हुए मानव फेफड़ों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) फेफड़ों के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों के एच एंड ई धुंधला हो जाना। (सी, डी) "ब्रोन्कियल वायुमार्ग के तहखाने झिल्ली पर एनजीएफआर + बेसल पूर्वज कोशिकाओं (लाल) और एल्वियोली में एचटीआईआई -280 + वायुकोशीय प्रकार द्वितीय पूर्वजों (हरे) को दिखाते हुए संबंधित क्षेत्रों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना". स्केल बार = 50 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डिस्टल फेफड़ों की कोशिकाओं के लिए प्रतिनिधि छँटाई रणनीति। (ए, ई) एक जैविक नमूने से फेफड़ों के डिस्टल क्षेत्रों में सीडी 31 और सीडी 45 चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके सीडी 45 + और सीडी 31 + आबादी की कमी से पहले और बाद में विभिन्न सेल आबादी का प्रतिशत। (बी, एफ) सीडी 31/सीडी45-/सीडी235ए पॉजिटिव पॉपुलेशन (सी, जी) ईपकैम+ आबादी की कमी से पहले और बाद में डिस्टल सीडी31-/सीडी45-/सीडी235ए पॉजिटिव पॉपुलेशन की कमी से पहले और बाद में पॉपुलेशन की गेटिंग स्ट्रैटेजी दिखाते हुए एफएसीएस प्लॉट की प्रतिनिधि छवि। (डी, एच) सीडी 31/सीडी45/सीडी235ए पॉजिटिव कोशिकाओं की कमी से पहले और बाद में एचटीआईआई-280+/- जनसंख्या। पैनल ए-डी एक ही जैविक नमूने से हैं और पैनल ई-एच एक ही जैविक नमूने से हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए, ई) फेफड़ों के समीपस्थ क्षेत्रों में सीडी 31 और सीडी 45 चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके सीडी 45 + और सीडी 31 + आबादी की कमी से पहले और बाद में विभिन्न सेल आबादी का प्रतिशत। (बी, एफ) सीडी 31/सीडी45-/सीडी235ए पॉजिटिव पॉपुलेशन (सी, जी) ईपकैम+ आबादी की कमी से पहले और बाद में सीडी31/सीडी45/सीडी235ए पॉजिटिव पॉपुलेशन की कमी से पहले और बाद में पोटेंशियल सीडी31-/सीडी45-/सीडी235ए पॉजिटिव पॉपुलेशन की गेटिंग स्ट्रैटेजी दिखाते हुए एफएसीएस प्लॉट की प्रतिनिधि छवि। (डी, एच) सीडी 31/सीडी 45/सीडी 235 ए पॉजिटिव कोशिकाओं की कमी से पहले और बाद में एनजीएफआर +/- जनसंख्या। पैनल ए-डी और ई-एच दो अलग-अलग जैविक नमूनों से तैयार किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डिस्टल फेफड़ों के ऑर्गेनोइड की विशेषता। (ए) न्यूमाकल्ट-एएलआई माध्यम (2 एक्स आवर्धन) में सुसंस्कृत मानव डिस्टल ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवि। (बी) कॉलोनी बनाने की दक्षता (% सीएफई) की गणना दो अलग-अलग जैविक नमूनों से प्राप्त ऑर्गेनोइड के ट्रिप्लिकेट कुओं पर की गई थी। (सी, सी') "एचटीआईआई -280+ एटी 2 कोशिकाओं (हरे) को दिखाते हुए एएलआई माध्यम में सुसंस्कृत संबंधित डिस्टल ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना". (डी, डी') इस अध्ययन में एटी 2 कोशिकाओं के अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर, एचटीआईआई -280 कॉस्टेन (हरा) एक और अच्छी तरह से विशेषता एटी 2 सेल मार्कर, एसपीसी (लाल) के लिए। स्केल बार = 50 um। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मानव समीपस्थ फेफड़े से समीपस्थ ऑर्गेनोइड की विशेषता। (ए, बी) न्यूमाकल्ट-एएलआई मध्यम पैमाने की पट्टी 50 μm में सुसंस्कृत मानव समीपस्थ ऑर्गेनोइड की प्रतिनिधि छवि (सी) प्रतिशत कॉलोनी बनाने की दक्षता (% सीएफई) की गणना दो अलग-अलग जैविक नमूनों से प्राप्त ऑर्गेनोइड के ट्रिप्लिकेट कुओं पर की गई थी। (डी) केआरटी 5 + बेसल कोशिकाओं (हरा), फॉक्सजे 1 + सिलिएटेड कोशिकाओं (लाल) (ई) केआरटी 5 + बेसल कोशिकाओं (हरा) और एमयूसी 5 एसी + गोबलेट कोशिकाओं (लाल) के साथ 30 दिन में विभेदित समीपस्थ ऑर्गेनोइड के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। (एफ) इस अध्ययन में बेसल कोशिकाओं के अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर, एनजीएफआर (हरे) अच्छी तरह से विशेषता वाले बेसल सेल मार्कर, केआरटी 5 (लाल) के लिए सह-दाग। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण और रोग मॉडलिंग के लिए मानव फेफड़ों के ऊतकों से फेफड़ों की कोशिकाओं की परिभाषित उप-आबादी के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं। विधियों के महत्वपूर्ण तत्वों में सतह एपिटोप्स के संरक्षण के साथ ऊतक पृथक्करण प्राप्त करने की क्षमता शामिल है, जो ताजा पृथक कोशिकाओं के एंटीबॉडी-मध्यस्थता संवर्धन की अनुमति देती है, और क्षेत्र-विशिष्ट उपकला ऑर्गेनोइड की कुशल पीढ़ी के लिए संस्कृति विधियों का अनुकूलन करती है। हम तीन आयामी संस्कृति में स्ट्रोमल समर्थन कोशिकाओं के साथ पुन: संयोजित होने पर ऑर्गेनोइड बनाने में सक्षम उपकला पूर्वज कोशिकाओं की वसूली और संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। भले ही हमने इन संस्कृतियों में ऑर्गेनोइड की क्लोनालिटी को परिभाषित नहीं किया था, पृथक माउस फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं का उपयोग करके किए गए इसी तरह के अध्ययनों को अलग-अलग फ्लोरोसेंटरिपोर्टरों 22,23 को आश्रय देने वाली कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृतियों के उपयोग पर आधारित दिखाया गया था।

यहां वर्णित विधियों में पचने वाले फेफड़ों के ऊतकों से सेल रिकवरी में सुधार करने के उद्देश्य से अनुकूलन शामिल हैं। पचे हुए नमूनों को किसी भी शेष अपचित गुच्छों को और बाधित करने और एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 16-गेज सुई के माध्यम से पारित किया जाता है। एक्सट्रूडेड जीनोमिक डीएनए के कारण सेल एकत्रीकरण को डीएनएएसई आई को जोड़कर कम किया गया था, जिसने एक सजातीय सेल तैयारी का उत्पादन किया जो एफएसीएस अलगाव के दौरान एक निर्बाध द्रव प्रवाह प्रदान करता है। साथ में ये सरल संशोधन लक्ष्य सेल आबादी की वसूली को बढ़ाते हैं और एफएसीएस संवर्धन के दौरान क्लंपिंग के कारण देरी से बचते हैं।

पिछला प्रोटोकॉल सेल अलगाव 4,5 से पहले एक एकल सेल निलंबन उपज के लिए इलास्टेज, डिस्पेज और ट्रिप्सिन / 2 एमएम ईडीटीए के साथ ऊतक पाचन के लिए कहते हैं। हालांकि, प्रोटीज के इस संयोजन से सतह प्रोटीन का नुकसान होता है और इसके लिए आवश्यक है कि एंटीबॉडी धुंधला और एफएसीएस से पहले सतह प्रोटीन की पुन: अभिव्यक्ति के लिए परकोल लेपित संस्कृति व्यंजनों पर कोशिकाओं को रात भर सुसंस्कृत किया जाए। इसके विपरीत, फेफड़ों के ऊतकों को धीरे-धीरे बाधित करने के लिए लिबेरेज़ और यांत्रिक आंदोलन का संयोजन एक अधिक कुशल, फिर भी हल्का, पृथक्करण प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसे एंटीबॉडी धुंधला और एफएसीएस संवर्धन के लिए सतह एपिटोप्स को संरक्षित करते समय अधिक तेजी से किया जा सकता है। इस प्रकार कुल ऊतक प्रसंस्करण समय संघनित है और एफएसीएस अलगाव ऊतक पृथक्करण के तुरंत बाद किया जा सकता है।

ये विधियां उपकला पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो संस्कृति की अनुमति देती हैं जो उनके मूल क्षेत्र के विशेष संतान प्रतिनिधि पैदा करती हैं। हालांकि, इन विधियों को प्रतिरक्षा, संवहनी और स्ट्रोमल सेल प्रकारों जैसे अन्य सेल आबादी की पहचान और संवर्धन के लिए समान रूप से लागू किया जा सकता है। यह विशेष रूप से क्षेत्रीय फेफड़ों के उपकला-ऑन-चिप सिस्टम के विकास पर लागू हो सकता है जो संवहनी और उपकला डिब्बों के मॉडलिंग और प्रतिरक्षा कोशिकाओं24,25,26 जैसे अन्य सेल प्रकारों की शुरूआत की अनुमति देता है। हाल के एक अध्ययन में, हमने इस पद्धति का उपयोग करके उत्पन्न वायुकोशीय उपकला की 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों का उपयोग फेफड़ों के कोविड-19 मॉडलिंग का अध्ययन करने और सार्स-सीओवी-2 संक्रमण के खिलाफ चिकित्सीय लक्ष्यों की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया था। 27

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम आईएफसी और एच और ई धुंधला के लिए मिज़ुनो ताकाको, ऊतक सेक्शनिंग के लिए वैनेसा गार्सिया और पांडुलिपि तैयार करने में मदद करने के लिए अनिका एस चंद्रशेखरन से समर्थन की सराहना करते हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (5आरओ 1 एचएल 135163-04, पीओ 1 एचएल 108793-08) और सेल्जीन आदर्श कंसोर्टियम द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip Fisher scientific BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip VWR BD302832
Biohazard bags VWR 89495-440
Biohazard bags VWR 89495-440
connecting ring Pluriselect 41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) sigma Aldrich DN25-1G
Disposable Petri dishes Corning/Falcon 25373-187
Funnel Pluriselect 42-50000
HBSS Corning 21-023
Liberase TM Research Grade sigma Aldrich 5401127001
needle 16G VWR 305198
needle 18G VWR 305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50070-51
Razor blades VWR 55411-050
Red Blood Cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand** Miltenyi Biotech 130-042-303
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free Thermo fisher scientific AM9260G 500µl
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml VWR 45000-456 500ml bottle
HEPES (1 M) Thermo fisher scientific 15630080 5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody BioLegend 369820 1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set Fisher Scientific BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935 20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801 20µl/ 107 total cells
DAPI Sigma Aldrich D9542-10MG 1:10000
FITC anti-human CD235a BioLegend 349104 1:100
FITC anti-human CD31 BioLegend 303104 1:100
FITC anti-human CD45 BioLegend 304054 1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Mouse IgM anti human HT2-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 1:300
PE anti-human CD271(NGFR) BioLegend 345106 1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5 ATCC CCL-171
PneumaCult -ALI Medium Stemcell Technologies 5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium PromoCell C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile Greiner Bio-One 662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) Stemcell Technologies 72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 50 µl
DMEM/F-12, HEPES ThermoFisher scientific 11330032 50 ml
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) ThermoFisher scientific 41400045 500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) Stem cell 72234 5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based Vector H-3300 937 µl in 100ml water
Histogel Thermo Scientific HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280 Terracebiotech TB-27AHT2-280 1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) Thermo Fisher Scientific 14-9965-82 1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody R and D systems MAB4218 1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] Biolegend 905901 1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) Thermo Fisher Scientific MA5-12178 1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) LifeSpan Biosciences LS-C143022-100 1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin BD biosciences 610182 1:1000
Sox-2 Antibody Santa Cruz biotechnologies sc-365964 1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-21113 1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21121 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21131 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21134 1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21144 1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution TBS with 0.1% Tween 20

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References

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जीव विज्ञान अंक 161 फेफड़े उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृति रोग मॉडलिंग वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं एफएसीएस
ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए मानव फेफड़े उपकला पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव और संवर्धन
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Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, … More

Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, S., Israely, E., Stripp, B. R. Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture. J. Vis. Exp. (161), e61541, doi:10.3791/61541 (2020).

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