Summary
Denna artikel ger en detaljerad metod för vävnadsdissociation och cellulär fraktioneringsmetoder som möjliggör anrikning av livskraftiga epitelceller från proximala och distala regioner i den mänskliga lungan. Häri tillämpas dessa tillvägagångssätt för funktionell analys av lungepitelceller genom användning av 3D-organoider odlingsmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller fungerar som värdefulla verktyg för att studera den grundläggande biologin i ett organsystem och för sjukdomsmodellering. När de odlas som organoider kan epiteliala stamceller självförnya och generera differentierande avkomma som uppvisar cellulära funktioner som liknar deras in vivo-motsvarigheter . Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för att isolera regionspecifika förfäder från mänsklig lunga och generera 3D-organoidkulturer som ett experimentellt och valideringsverktyg. Vi definierar proximala och distala regioner i lungan med målet att isolera regionspecifika stamceller. Vi använde en kombination av enzymatisk och mekanisk dissociation för att isolera totala celler från lungan och luftstrupen. Specifika stamceller fraktionerades sedan från de proximala eller distala ursprungscellerna med hjälp av fluorescensassocierad cellsortering (FACS) baserat på celltypspecifika ytmarkörer, såsom NGFR för sortering av basalceller och HTII-280 för sortering av alveolära typ II-celler. Isolerade basala eller alveolära typ II-förfäder användes för att generera 3D-organoidkulturer. Både distala och proximala förfäder bildade organoider med en kolonibildande effektivitet på 9-13% i distal region och 7-10% i proximal region när de pläterades 5000 celler / brunn på dag 30. Distala organoider upprätthöll HTII-280+ alveolära typ II-celler i odling medan proximala organoider differentierades till cilierade och sekretoriska celler vid dag 30. Dessa 3D-organoidkulturer kan användas som ett experimentellt verktyg för att studera cellbiologin för lungepitel och epitelial mesenkymala interaktioner, samt för utveckling och validering av terapeutiska strategier riktade mot epitelial dysfunktion i en sjukdom.
Introduction
Luftrum i det mänskliga andningsorganen kan i stort sett delas in i ledande och andningszoner som förmedlar transport av gaser och deras efterföljande utbyte över den epitel-mikrovaskulära barriären. De ledande luftvägarna inkluderar luftstrupen, bronkierna, bronkiolerna och terminala bronkioler, medan andningsluftutrymmen inkluderar andningsbronkioler, alveolära kanaler och alveoler. Epitelfodret i dessa luftrum förändras i sammansättning längs den proximo-distala axeln för att tillgodose de unika kraven i varje funktionellt distinkt zon. Det pseudostratifierade epitelet av trakeo-bronkial luftvägar består av tre huvudcelltyper, basala, sekretoriska och cilierade, förutom de mindre rikliga celltyperna inklusive borste, neuroendokrin och jonocyt 1,2,3. Bronchiolar airways har morfologiskt liknande epitelcelltyper, även om det finns skillnader i deras överflöd och funktionella egenskaper. Till exempel är basala celler mindre rikliga i bronkiolära luftvägar, och sekretoriska celler inkluderar en större andel klubbceller jämfört med serösa och bägare celler som dominerar i trakeo-bronkial luftvägar. Epitelceller i andningszonen innefattar en dåligt definierad kuboid celltyp i respiratoriska bronkioler, förutom alveolära typ I (ATI) och typ II (ATII) celler av alveolära kanaler och alveoler 1,4.
Identiteten hos epitelstam- och stamcellstyper som bidrar till underhåll och förnyelse av epitel i varje zon beskrivs ofullständigt och härleds till stor del från studier i djurmodeller 5,6,7,8. Studier på möss har visat att antingen basala celler i pseudostratifierade luftvägar eller klubbceller i bronkiolära luftvägar eller ATII-celler i det alveolära epitelet fungerar som epitelstamceller baserat på kapacitet för obegränsad självförnyelse och multipotent differentiering 7,9,10,11,12 . Trots oförmågan att utföra genetiska härstamningsspårningsstudier för att bedöma stamheten hos humana lungepitelcelltyper, ger tillgången till organoidbaserade odlingsmodeller för att bedöma den funktionella potentialen hos epitelstam- och stamceller ett verktyg för jämförande studier mellan mus och människa 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder för isolering av epitelcelltyper från olika regioner i den mänskliga lungan och deras odling med hjälp av ett 3D-organoidsystem för att rekapitulera de regionala celltyperna. Liknande metoder har utvecklats för funktionell analys och sjukdomsmodellering av epitelceller från andra organsystem 18,19,20,21. Dessa metoder ger en plattform för identifiering av regionala epiteliala stamceller, för att utföra mekanistiska studier som undersöker deras reglering och mikromiljö och för att möjliggöra sjukdomsmodellering och läkemedelsupptäckt. Även om studier av lungepitelceller utförda i djurmodeller kan dra nytta av analysen, antingen in vivo eller in vitro, har insikter om identiteten hos humana lungepitelceller till stor del varit beroende av extrapolering från modellorganismer. Som sådan ger dessa metoder en bro för att relatera identiteten och beteendet hos humana lungepitelcelltyper med sina studier som undersöker reglering av stam- / stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänsklig lungvävnad erhölls från avlidna vävnadsdonatorer i enlighet med samtyckesförfaranden som utvecklats av International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) och godkänts av Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Vävnadsbehandling för isolering av lungceller från antingen trakeo-bronkial eller små luftvägs-/parenkymala (små luftvägar och alveoler) regioner
- Förbered och autoklavera alla dissektionsinstrument, glas och lämpliga lösningar en dag före cellisolering.
- Vid mottagande av lungvävnad, identifiera och separera de proximala och distala regionerna. Luftstrupen och bronkierna anses vara "proximala". Vid tillämpningen av detta protokoll disected luftstrupen och de första 2-3 generationerna av bronkier och används för isolering av "proximalt" luftvägsepitel. Små luftvägar med en diameter på högst 2 mm och omgivande parenkymvävnad betraktas vid tillämpningen av detta protokoll som "distalt" lungepitel (figur 1A).
OBS: Alla procedurer som involverar bearbetning av mänsklig lungvävnad bör utföras i ett biosäkerhetsskåp med användning av lämplig personlig skyddsutrustning.
2. Anrikning och subsetting av små luftvägs- och alveolära epitelceller från distal lungvävnad
- Distal vävnadsberedning
- Placera den distala lungvävnaden i en steril petriskål (150 x 15 mm). Tärna vävnad i ca 1 cm3 stycken och placera i ett rent 50 ml rör.
- Tvätta vävnaden 3x med kyld HBSS, kassera HBSS-tvätt varje gång för att avlägsna blod och epitelfodervätska.
- Placera vävnaden i en ny petriskål och torka med sterila anti-lintservetter. Använd pincett och sax, ta bort så mycket visceral pleura (ett känsligt transparent membran som täcker lungans yta) som möjligt.
- Använd sax för att hacka vävnad i bitar med en diameter på cirka 2 mm. Överför malet vävnad till en ren petriskål och hacka vidare genom att hugga den till en ungefärlig storlek på 1 mm med ett sterilt ensidigt rakblad.
- Enzym matsmältning
OBS: Liberase stamlösning är 5 mg / ml (100x) och DNase lager är 2,5 mg / ml (100x) (materialtabell).- Tillsätt 50 μg/ml Liberase och 25 μg/ml DNas i sterilt HBSS i ett 50 ml koniskt rör.
- Överför cirka 2-3 g malet vävnad till ett nytt 50 ml koniskt rör med 25 ml HBSS, innehållande Liberase och DNase. Inkubera i 40-60 min vid 37 °C med kontinuerlig skakning med en mixer inställd på 900 rpm. Efter 30 minuters inkubation smälte triturat vävnad med en 30 ml spruta utan nål för att undvika klumpbildning och fortsätt med inkubationen.
OBS: Inkubationstiden med enzymerna kan variera beroende på vävnadens typ eller tillstånd. Till exempel tar enzymatisk matsmältning av normal vävnad cirka 45 minuter. Fibrotisk vävnad från idiopatiska lungfibrosprover kan dock kräva en längre inkubationstid på upp till 60 min. Övervaka därför vävnaden noggrant under detta steg för att förhindra skador på ytmarkörerna, vilket är avgörande för FACS.
- Isolering av en cell
- Triturera vävnaden genom att dra 5x genom en 16 G nål monterad på en 30 ml spruta. Dra vävnadssuspensionen i en bredborrad pipett och passera genom en serie cellsilar (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtryck. Tvätta silen med 20 ml HBSS+-buffert för att samla upp återstående celler. Receptet på HBSS+ buffert finns i Materialtabell.
- Tillsätt en lika stor volym HBSS+-buffert efter 45 minuter till filtratet för att hämma Liberase-aktivitet och förhindra överuppslutning.
- Centrifugera filtrat vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) till pelleten, gunga försiktigt röret för att lossa pelleten och inkubera på is i 1 min.
OBS: Mängden och tiden i RBC-lyslösningen beror på pelletens storlek. Det är viktigt att hålla cellerna på is och övervaka tiden i RBC-lyslösning noggrant för att förhindra lys av målceller. Om RBC-lysen är otillräcklig, upprepa steget. - Tillsätt 10-20 ml HBSS+ buffert för att neutralisera RBC-lysbufferten. Centrifugera filtrat vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Om lyserade röda blodkroppar (spökceller) bildar ett grumligt lager ovanför cellpelleten, resuspendera pelleten i 10 ml HBSS + -buffert och sil suspensionen genom 70 μm cellsil för att eliminera spökcellerna. Centrifugera filtratet vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och fortsätt med ytterligare steg.
- Utarmning av immunceller och endotelceller (valfritt steg)
- Töm CD31 + endotelceller och CD45 + immunceller från poolen av totala celler med hjälp av CD31 & CD45-mikropärlor konjugerade till monoklonala anti-humana CD31- och CD45-antikroppar (isotypmus IgG1) och LS-kolumner i enlighet med tillverkarens protokoll (materialtabell).
- Samla upp flödet genom, som huvudsakligen består av epitel- och stromaceller, i ett nytt sterilt rör och centrifugera det vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Utför en cellräkning för att fastställa det totala antalet celler i flödet igenom.
- Cellytefärgning för fluorescensassocierad cellsortering (FACS)
- Resuspendera 1 x 107 celler per 1 ml HBSS+ buffert. Tillsätt primära antikroppar i önskad koncentration och inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C i mörker. I denna studie användes fluoroforkonjugerade primära antikroppar om inget annat anges. Detaljer om antikroppskällor och titrar beskrivs i materialtabellen.
OBS: HTII-280 är för närvarande den bästa ytreaktiva antikroppen som möjliggör subsetting av distala lungceller i övervägande luftväg (HTII-280-) och alveolära typ 2 (HTII-280+) cellfraktioner. En varning för denna strategi är att AT1-celler inte färgas med denna metod och är dåligt representerade på grund av deras bräcklighet. AT1-celler är emellertid dåligt representerade i distala lungförberedelser, förmodligen på grund av deras bräcklighet och förlust under urval av livskraftiga celler av FACS och representerar därför endast en sällsynt förorening av luftvägscellfraktionen. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 3 ml HBSS+-buffert och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Om du använder okonjugerade primära antikroppar, tillsätt erforderlig koncentration av en lämplig fluoroforkonjugerad sekundär antikropp och inkubera i 30 minuter på is. Tvätta bort överflödig sekundär antikropp genom att tillsätta 3 ml HBSS+-buffert och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återsuspendcellerna i HBSS+ buffert per 1 x 107 celler/ ml. Filtrera celler i 5 ml polystyrenrör genom ett sillock för att säkerställa bildandet av en enda cellsuspension. Tillsätt DAPI (1 μg/ml) för att fläcka permeabla (döda) celler.
OBS: Det är viktigt att använda lämpliga enfärgade och fluorescens minus en (FMO) kontroller (dvs. antikroppsfärgningscocktail minus en antikropp vardera) för att minimera falska positiva resultat under FACS. I denna studie användes positiva och negativa selektionspärlor för empirisk kompensation för överlappning av emissionsspektra mellan fluoroforer (Materialtabell). FACS berikar celltyper av intresse. Livskraftiga epitelceller berikas baserat på deras CD45-negativa, CD31-negativa, CD236-positiva cellytefenotyp och negativa färgning för DAPI. Denna epitelcellfraktion kan subsetteras ytterligare baserat på färgning för celltypspecifika ytmarkörer, såsom specifik färgning för HTII-280-positiva celler som är berikade för AT2-celler. Däremot tillåter negativt urval för HTII-280 anrikning av små luftvägsepitelceller såsom klubb- och cilierade celler (Figur 2).
- Resuspendera 1 x 107 celler per 1 ml HBSS+ buffert. Tillsätt primära antikroppar i önskad koncentration och inkubera cellerna i 30 minuter vid 4 °C i mörker. I denna studie användes fluoroforkonjugerade primära antikroppar om inget annat anges. Detaljer om antikroppskällor och titrar beskrivs i materialtabellen.
3. Anrikning och subsetting av epiteliala stamceller från trakeo-bronkial luftvägar
- Vävnadsberedning
- Dissekera proximala luftvägar (luftstrupen/luftrör) från lungorna. Öppna luftvägarna längs deras längd med sax för att exponera lumen och tillsätt 50 μg / ml Liberase för att helt täcka vävnaden.
- Inkubera i 20 min vid 37 °C med kontinuerlig skakning med en termoblandare inställd på 900 rpm.
- Ta bort den proximala luftvägen från centrifugröret och placera den i en steril petriskål (150 x 15 mm). Skrapa försiktigt ytan på luftvägarna med en skalpell för att helt ta bort luminala epitelceller från vävnaden.
- Tvätta petriskålen med 5 ml steril HBSS+-buffert för att samla upp alla lossnade luminala epitelceller och överföra de lossnade cellerna till 50 ml koniskt centrifugrör. Triturera suspensionen genom att dra 5x genom 16 G nål och 18 G nål monterad på en 10 ml spruta för att få encellssuspension.
- Centrifugera suspensionen vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Resuspendera pelleten i färsk HBSS+ buffert och förvara dessa luminala luftvägsceller på is, redo att kombineras med encellssuspensionen som genereras från de malet proximala luftvägarna i de kommande stegen.
- Skär återstående trakeo-bronkialvävnad längs ringarna med sax för att generera små vävnadsremsor och överför remsorna till en ny petriskål. Hacka vävnadsremsorna med ett ensidigt rakblad för att göra mindre bitar.
OBS: Eftersom de proximala luftvägarna är broskiga kan de inte hakas lika fint som den distala lungvävnaden. - Överför den malet vävnaden till C-rören, tillsätt 2 ml Liberase till röret så att vävnaden är nedsänkt. Ladda C-röret på den automatiska dissociatorn och kör Human Lung Protocol-2 för att mekaniskt dissociera vävnad ytterligare.
OBS: Dissociatorn som används i detta protokoll erbjuder ett optimerat program som kallas humant lungprotokoll-2 för denna specifika applikation (se materialtabell).
- Enzymsmältning och encellsisolering
- Överför cirka 2 g malet proximal vävnad från C-röret till varje 50 ml koniskt centrifugrör och tillsätt 50 μg/ml Liberase och 25 μg/ml DNase-lösning till varje rör.
OBS: För att säkerställa effektiv dissociation bör rören inte fyllas utöver 30 ml-märket. - Inkubera den maleta vävnaden i 45 minuter vid 37 °C med kontinuerlig skakning med en mixer inställd på 900 rpm.
- För den dissocierade vävnadssuspensionen genom en serie cellsilar (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtryck som nämnts ovan och samla upp flödet genom. Tvätta silen med 20 ml HBSS+-buffert för att samla upp återstående celler.
OBS: Eftersom proximal vävnad är broskig och skrymmande jämfört med den distala vävnaden, finns det en högre risk för igensättning av filtren. Att använda en tratt kan hjälpa till att förhindra överflöd av vätskan när den passerar genom silarna. - Tillsätt en lika stor volym HBSS+-buffert till filtratet för att hämma Liberase-aktivitet och förhindra överfrysning. Lägg till de isolerade luminala proximala luftvägscellerna från 3.1.5 till cellsuspensionen i detta steg.
- Centrifugera den kombinerade cellsuspensionen vid 500 x g i 10 min. Ta bort supernatanten och upprepa celltvätten i HBSS+-buffert. Utför utarmning av CD45 + immunceller och CD31 + endotelceller som nämnts ovan i 2.4 (valfritt steg).
- Metoder för färgning liknar distal lungvävnad, följ stegen i 2.5. Berika livskraftiga epitelceller baserat på deras CD45-negativa, CD31-negativa, CD236-positiva cellytefenotyp och negativa färgning för DAPI.
- Vidare delmängd epitelcellfraktionen baserad på färgning för celltypspecifika ytmarkörer, såsom NGFR, vilket möjliggör anrikning av basala (NGFR-positiva) och icke-basala (NGFR-negativa; sekretoriska, cilierade, neuroendokrina) celltyper (Figur 3).
- Överför cirka 2 g malet proximal vävnad från C-röret till varje 50 ml koniskt centrifugrör och tillsätt 50 μg/ml Liberase och 25 μg/ml DNase-lösning till varje rör.
4. Organoid kultur
- Lägg till 5 000 (detta antal kan justeras för att ge önskad densitet av epitelorganoider) sorterade proximala eller distala epitelceller till sterilt 1,5 ml rör tillsammans med 7,5 x 104 MRC-5-celler (human lungfibroblast cellinje). Epitelial-mesenkymala interaktioner är avgörande för expansionen av stamceller.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Det är viktigt att manuellt bekräfta cellantalet som erhållits från sorteraren för att säkerställa noggrannhet organoidkolonibildande effektivitet. - Ta försiktigt bort och kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 50 μL iskallt medium kompletterat med antibiotika. Håll cellsuspensionen på is.
- Tillsätt 50 μL iskallt 1x tillväxtfaktor utarmat källarmembranmatrismedium till injektionsflaskan och pipettera försiktigt suspensionen på is för att blanda.
OBS: Det är viktigt att använda iskalla medier och underhålla celler på is för att undvika för tidig polymerisation av källarmembranmatrismediet. - Överför cellsuspensionen till 0,4 μm cellodlingsinsats i porstorlek i en 24-brunnsplatta (1,4 x 104 celler/cm2), var noga med att undvika införande av luftbubblor.
- Inkubera vid 37 °C i 30–45 minuter så att matrisen stelnar.
- Tillsätt 600 μl förvärmt tillväxtmedium till brunnen.
OBS: Media kompletterades med antimykotiska medel (0,4%) och Pen strep (1%) under de första 24 timmarna efter sådd och 10 μM Rho-kinashämmare under de första 72 timmarna. - Kultur vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 30 dagar, under vilken tid mediet ska bytas var 48: e timme.
OBS: Kulturens varaktighet kan ändras baserat på syftet med experimentet. Längre slutpunkter används för att studera differentiering medan kortare slutpunkter på 7 dagar, 14 dagar etc. kan användas om syftet med experimentet inte är att uppnå fullständig differentiering. - Tillsätt 10 μM TGFβ-hämmare till odlingsmediet i 15 dagar för att bibehålla cellerna i den proliferativa fasen och undertrycka överväxt av fibroblaster.
OBS: Resultaten skiljer sig åt beroende på det odlingsmedium som används för analysen. Till exempel genererades resultaten som visas häri med hjälp av Pneumacult-ALI Medium, vilket resulterar i generering av stora organoider från distal lunga, väl differentierade och större organoider från proximal lunga.
5. Organoid färgning
- Fixering och inbäddning av organoider
- Aspirera media från både de övre och nedre transmembraningskamrarna och skölj en gång med varm PBS.
- Fixera kulturerna genom att placera 300 μl PFA (2% w/v) i skäret och 500 μl i brunnen i 1 timme vid 37 °C. Ta bort fixeringsmedlet och skölj med varm PBS, var noga med att inte lossa basmemtmembranmatrispluggen.
OBS: Fasta organoider kan förvaras nedsänkt i PBS vid 4 °C i en till två veckor innan ytterligare steg påbörjas. - Aspirera PBS, invertera insatsen och skär försiktigt insatsmembranet runt dess periferi. Använd pincett, ta bort transwellmembranet, var noga med att inte störa matrispluggen.
- I en petriskål trycker du på insatsen för att återställa matrispluggen.
- Tillsätt en droppe provbehandlingsgel såsom Histogel (bibehållen vid 37 °C) till matrispluggen och håll den vid 4 °C tills gelén stelnar.
- Överför kontakten till en inbäddningskassett, dehydrera genom ökande koncentrationer av etanol (70, 90 och 100%), klar i xylen och bädda in i paraffinvax.
- Skär 7 μm sektioner på en mikrotom och samla på positivt laddade bilder.
- Immunofluorescensfärgning av organoider
- Placera diabilderna vid 65 °C i 30 min för att avvaxa.
- Deparaffinera sektionerna genom nedsänkning i xylen och rehydrera genom minskande koncentrationer av etanol.
- Utför hämtning av antigen vid hög temperatur i antigenavmaskeringslösning, citronsyrabas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig retriever genom att doppa objektglas i lösningen i 15 minuter (materialtabell).
- Omge vävnaden med en hydrofob barriär med en pappenna.
- Blockera icke-specifik färgning mellan de primära antikropparna och vävnaden genom att inkubera i Blockerande buffert.
- Inkubera sektioner i lämplig koncentration av primära antikroppar utspädda i inkubationslösning över natten vid 4 °C i en fuktad kammare.
- Skölj sektionerna 3x vid rumstemperatur med en tvättbuffert.
- Inkubera i lämplig koncentration av fluorokromkonjugerad sekundär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur.
- Skölj sektionerna 3x vid rumstemperatur med 0,1% Tween 20-TBS. Inkubera sektioner i 5 min i DAPI (1 μg / ml). Skölj sektionerna en gång i TBS (Tris-buffrad saltlösning) med 0,1% Tween 20, torka och montera i en monteringslösning (figur 4 och figur 5).
OBS: Källa och optimal arbetsutspädning av primära och sekundära antikroppar som används för immunofluorescensfärgning ingår i materialförteckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Källa lungvävnad
Luftstrupen och extrapulmonella bronkus (figur 1A) användes som källvävnad för isolering av proximala luftvägsepitelceller och efterföljande generering av proximala organoider. Distal lungvävnad som inkluderar både parenkym och små luftvägar med mindre än 2 mm i diameter (figur 1A) användes för isolering av små luftvägar och alveolära epitelceller (distal lungepitel) och generering av antingen små luftvägar eller alveolära organoider. Proximala luftvägar kantade av ett pseudostratifierat epitel inkluderar rikliga basala stamceller som är immunreaktiva för membranproteinet NGFR (figur 1B,C). Däremot inkluderade epitelceller som fostrade alveoler en delmängd som visade apikal membranimmunreaktivitet med den monoklonala antikroppen HTII-280, vilket tyder på deras alveolära typ 2-cell (AT2) identitet (Figur 1B,D). Dessa ytmarkörer användes för att delmängd encellssuspensioner av epitelceller isolerade från antingen proximala eller distala regioner.
Vävnadsdissociation och cellfraktionering
Encellssuspensioner av totalt antal celler isolerades från antingen proximala eller distala regioner i mänsklig lungvävnad och fraktionerades med både magnetisk pärla och FACS för att ge berikade epitelcellpopulationer (figur 2 och figur 3). Rikliga förorenande celltyper inklusive röda blodkroppar, immunceller och endotelceller färgades med antikroppar mot CD235a, CD45 respektive CD31, följt av magnetisk associerad cellsortering för utarmning av dessa celltyper från den totala poolen av lungceller. De resulterande "utarmade" cellsuspensionerna berikades signifikant för epitelcellpopulationer i både distala (figur 2E) och proximala (figur 3E) vävnadsprover, med motsvarande ökning av FACS-effektiviteten. Efter utarmning av CD235a / CD45 / CD31 positiva celler med CD45 & CD31 mikropärlor ökade andelen CD31-/ CD45-/ CD235a- från 14% (Figur 2A, B) till 51,7% (Figur 2E, F) i distal population. Ytterligare FACS-utarmning av celler som färgar positivt för antingen CD235a, CD45 eller CD31, eliminering av celler med positiv färgning för DAPI och positivt urval för epitelcellytans markör CD326, ledde till en mycket berikad distal cellpopulation som stod för 33,5% (figur 2E,G) jämfört med 7% (figur 2A,C ) före utarmning av negativ befolkning. Ytterligare subsetting av distala epitelcellpopulationer uppnåddes genom fraktionering baserat på ytfärgning med HTII-280 monoklonal antikropp (figur 2D,H). Följaktligen inkluderade distala lungepitelceller 4,3% HTII-280+ och 2,6% HTII-280- delmängder (figur 2D utan utarmning av CD31 / CD45 / CD235a) och 30% HTII-280+ och 3,6% HTII-280- delmängder (figur 2H efter utarmning av CD31 / CD45 / CD235a).
Totalt antal celler isolerade från den proximala regionen utarmades för CD235a / CD45 / CD31 positiva celler med CD45 & CD31 mikropärlor och andelen CD31-/ CD45-/ CD235a- ökade från 17% (Figur 3A, B) till 56,6% (Figur 3E, F). Positivt urval för epitelcellsytemarkören CD326 i celler isolerade från den proximala regionen ledde till en mycket berikad proximal cellpopulation som stod för 38% (figur 3E,G) av de totala lungcellfraktionerna jämfört med 9,3% (figur 3A,C) utan utarmning av negativ population. Ytterligare subsetting av proximala epitelcellpopulationer uppnåddes genom fraktionering baserat på ytfärgning med antikroppar mot NGFR (figur 3D,H). Följaktligen inkluderade proximala lungepitelceller 2,7% NGFR + och 6,5% NGFR- delmängder (figur 3D utan utarmning av CD31 / CD45 / CD235a) och 13% var NGFR + och 25% NGFR- (Figur 3H efter utarmning av CD31 / CD45 / CD235a).
Lungorganoidkulturer
Distala lungepitelorganoider odlades inom tillväxtfaktorutarmad källarmembranmatris i media som empiriskt testades för att optimera för organoid tillväxt och differentiering. Tre olika medier utvärderades inklusive PneumaCult-ALI medium, small airway epitelial cell growth medium (SAECG medium) och mouse Basal medium. Optimal organoidtillväxt erhölls med användning av PneumaCult-ALI-medium, som valdes för vidare studier. Kulturer av HTII-280+ distala lungepitelceller gav snabbt expanderande organoider med en genomsnittlig kolonibildande effektivitet på 10% (Figur 4A,B). Immunofluorescensfärgning av dag 30-kulturer med användning av HTII-280 och SPC monoklonala antikroppar avslöjade lumeninnehållande organoider som huvudsakligen består av HTII-280+ och SPC+ distala lungepitelceller (figur 4C, C 'och figur 4D, D '). Kulturer av distala lungepitel HTII-280-celler gav organoider som bestod av ett pseudostratifierat epitel som liknar det hos små luftvägar (visas inte).
Proximala lungepitelorganoider odlades från NGFR+ celler såddes i Matrigel och odlades i 30 dagar i PneumaCult-ALI-medium. Stora lumeninnehållande organoider observerades (figur 5D,E,F) med en genomsnittlig kolonibildande effektivitet på 7,8% (figur 5A,B,C). Organoider bestod av ett pseudostratifierat epitel bestående av självförnyande Krt5+ och NGFR+ basalceller (Figur 5D, 5E) och differentierade luminala celltyper inklusive FoxJ1+ cilierade celler och MUC5AC+ sekretoriska celler (Figur 5D,E).
Figur 1: Provtagning av mänsklig lungvävnad. (A) Schematisk representation av den mänskliga lungan som visar strategi för provtagning av proximala och distala regioner för cellisolering. (B) H&E-färgning av lungans proximala och distala regioner. (C,D) Immunofluorescerande färgning av motsvarande regioner som visar NGFR+ basala stamceller (röda) vid källarmembranet i bronkial luftvägarna och HTII-280+ alveolära typ II-förfäder (gröna) i alveolerna. skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ sorteringsstrategi för distala lungceller. (A,E) Procentandel av olika cellpopulationer före och efter utarmning av CD45 + och CD31 + -population med CD31 och CD45 magnetiska pärlor i distala regioner i lungan från ett biologiskt prov. (B,F) Representativ bild av FACS-plot som visar gatingstrategi för distal CD31-/CD45-/CD235a- population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiv population (C,G) Epcam+ population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiv population. (D,H) HTII-280+/- population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiva celler. Panelerna A-D är från samma biologiska prov och panelerna E-H är från samma biologiska prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ sorteringsstrategi för proximala lungceller (A,E) Procentandel av olika cellpopulationer före och efter utarmning av CD45 + och CD31 + -population med CD31 och CD45 magnetiska pärlor i proximala regioner i lungan. (B,F) Representativ bild av FACS-plot som visar gatingstrategi för proximal CD31-/CD45-/CD235a- population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiv population (C,G) Epcam+ population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiv population. (D,H) NGFR+/- population före och efter utarmning av CD31/CD45/CD235a positiva celler. Panelerna A-D och E-H framställdes från två olika biologiska prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av distala lungorganoider. (A) Representativ bild av de humana distala organoiderna odlade i PneumaCult-ALI-medium (2x förstoring). (B) Den kolonibildande effektiviteten (% CFE) beräknades på tredubbla brunnar av organoider härledda från två olika biologiska prover. (C, C') Immunofluorescerande färgning av motsvarande distala organoider odlade i ALI-medium som visar HTII-280+ AT2-celler (grön). (D, D') Markören som används för isolering av AT2-celler i denna studie, HTII-280 costainer (grön) för en annan väl karakteriserad AT2-cellmarkör , SPC (röd). Skalstreck = 50um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Karakterisering av proximala organoider från den humana proximala lungan. (A,B) Representativ bild av de humana proximala organoiderna odlade i PneumaCult-ALI medelskala bar 50 μm. (C) Den procentuella kolonibildande effektiviteten (% CFE) beräknades på tredubbla brunnar av organoider härledda från två olika biologiska prover. Immunofluorescerande färgning av differentierade proximala organoider vid dag 30 med (D) Krt5+ basalceller (grön), FoxJ1+ cilierade celler (röd) (E) Krt5+ basalceller (grön) och MUC5AC+ bägare celler (röd). (F) Den markör som används för isolering av basala celler i denna studie, NGFR (grön) samfläckar för den väl karakteriserade basalcellsmarkören, Krt5 (röd). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en tillförlitlig metod för isolering av definierade subpopulationer av lungceller från mänsklig lungvävnad för antingen molekylär eller funktionell analys och sjukdomsmodellering. Kritiska element i metoder inkluderar förmågan att uppnå vävnadsdissociation med bevarande av ytepitoper, vilket möjliggör antikroppsmedierad anrikning av nyligen isolerade celler och optimering av odlingsmetoder för effektiv generering av regionspecifika epitelorganoider. Vi fokuserar på återhämtning och anrikning av epiteliala stamceller som kan bilda organoider när de rekombineras med stromala stödceller i tredimensionell odling. Även om vi inte definierade klonaliteten hos organoider i dessa kulturer, visades liknande studier utförda med isolerade lungepitelceller från möss vara klonalt baserade på användning av blandade kulturer av celler som hyser distinkta fluorescerande reportrar22,23.
Metoder som beskrivs här inkluderar anpassningar avsedda att förbättra cellåtervinning från smält lungvävnad. Rötprover leds genom en 16-gauge nål för att ytterligare störa eventuella kvarvarande osmälta klumpar och för att uppnå en homogen cellsuspension. Cellaggregering orsakad av extruderat genomiskt DNA mildrades genom tillsats av DNase I, som producerade ett homogent cellpreparat som ger en oavbruten fluidikström under FACS-isolering. Tillsammans förbättrar dessa enkla modifieringar återhämtningen av målcellpopulationerna och undviker förseningar på grund av klumpning under FACS-anrikning.
Tidigare protokoll kräver vävnadsuppslutning med elastas, dispas och tripsin/2 mM EDTA för att ge en enda cellsuspension före cellisolering 4,5. Denna kombination av proteaser leder emellertid till förlust av ytproteiner och kräver att celler odlas över natten på purkolbelagda odlingsrätter för återuttryck av ytproteiner före antikroppsfärgning och FACS. Däremot ger kombinationen av Liberase och mekanisk omrörning för att försiktigt störa lungvävnaden ett effektivare, men mildare, dissociationsprotokoll som kan utföras snabbare samtidigt som ytepitoper bevaras för antikroppsfärgning och FACS-anrikning. Således kondenseras den totala vävnadsbehandlingstiden och FACS-isolering kan utföras omedelbart efter vävnadsdissociation.
Dessa metoder möjliggör isolering och in vitro-odling av epiteliala stamceller som ger specialiserad avkomma som är representativ för deras ursprungsregion. Dessa metoder kan emellertid på liknande sätt tillämpas på identifiering och anrikning av andra cellpopulationer såsom immun-, vaskulära och stromala celltyper. Detta kan vara särskilt tillämpligt på utvecklingen av regionala lungepitel-på-chip-system som möjliggör modellering av vaskulära och epiteliala fack och införande av andra celltyper såsom immunceller 24,25,26. I en nyligen genomförd studie använde vi 3D-organoidkulturer av alveolära epitel som genererades med hjälp av denna metod användes som ett verktyg för att studera COVID 19-modellering av lungan och för att screena terapeutiska mål mot SARS-CoV-2-infektion. 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar stöd från Mizuno Takako för IFC- och H- och E-färgning, Vanessa Garcia för vävnadssektionering och Anika S Chandrasekaran för att hjälpa till med manuskriptberedning. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) och Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C.
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
