Artigo de método

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

DOI:

10.3791/61776

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6 de maio de 2022

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1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.

Introdução

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A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinase A (PKA), Ca2+/calmodulin-dependent protein quinase II (CaMKII), FK506 proteínas vinculantes (FKBPs), calsequestrin (CSQ), tqdinria, tqdinria, tq e junctina1,2,3,4,5,6 . A expressão humana anormal e as mutações nessas proteínas podem levar à fisiologia patológica, como arritmias7 e proliferação oncogênica8,9.

FKBPs regulam a liberação de cálcio do reticular endoplasmico (ER) por RyRs. Este processo é essencial para o mecanismo de contração e, portanto, responsável por todo o movimento mecânico gerado pela contração miosina-actina através da liberação de cálcio induzida pelo cálcio, juntamente com ryRs1,2 embrionário. Nos modelos de mouse, a falta de RyR2 e seu regulador FKBP12/Calstabin é invariavelmente letal, seja durante o desenvolvimento embrionário ou no período pós-natal inicial10,11,12. Os camundongos eliminados FKBP12/Calstabin apresentam defeitos cardíacos críticos com acoplamento irregular de excitação- contração (CE) e edema cerebral durante o desenvolvimento embrionário. Isso indica que o FKBP12/Calstabin desempenha um papel essencial na regulação da expressão do canal RyR2, o que é importante tanto para o desenvolvimento cardíaco quanto cerebral10.

As faíscas de cálcio conduzidas pelo RyR foram inicialmente descobertas na fase de formação de zigotos de ovos Medaka fertilizados13,14. No entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a função da sinalização de cálcio no desenvolvimento embrionário precoce. Em Drosophila melanogaster, os resultados obtidos dos mutantes DmFKBP12 S107 fornecem fortes evidências que sustentam a importância desse gene para o desenvolvimento larval e uma vida útil saudável, que é atribuída à sua função contra o estresse oxidativo15,16. Recentemente, identificamos a localização dinâmica da proteína FKBP12/Calstabin e do RNA mensageiro durante o desenvolvimento inicial de Drosophila melanogaster17. Utilizando as abordagens descritas nesta metodologia, pudemos rastrear a expressão de FKBP12/Calstabin em D. melanogaster durante o blastoderm sincicial (0-2 h), blastoderm celular (2-3 h), gastrula precoce (3-12 h) e gastrula tardia (12-24 h). Neste artigo, apresentamos os protocolos detalhados de todas as abordagens do estudo anterior, incluindo incorporação pré-embrionária para secção clássica de parafina, tratamento de slides pré-revestimento para seções embrionárias, coloração de histoquímica e imunostaining, e hibridização mRNA in-situ para identificação da expressão genética.

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Protocolo

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1. Preparação de pratos de ágar de suco de uva

  1. Adicione 5 g de ágar e 5 g de sacarose a 150 mL de água destilada. Ferva-o usando um micro-ondas até que o ágar e a sacarose estejam totalmente dissolvidos. Misture 50 mL de suco de uva 100% e a solução em conjunto.
  2. Adicione 1 mL de ácido 100% propiônico para fazer a concentração final a 0,5% de ácido propínico. Despeje 25 mL da solução preparada em cada placa. Depois que o ágar se solidificar, armazene a mídia em 4 °C.

2. Slides de revestimento

  1. Deslizes pré-tratados com detergente. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada. Em seguida, seque as lâminas em um forno de 45 °C por 2 h.
  2. Mergulhe os slides em cerca de 450 mL de solução de ácido sulfúrico de potássio (20 g de dicromato de potássio, 40 mL de água destilada e 400 mL de ácido sulfúrico concentrado) por 24 horas. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada.
    1. Seque as lâminas em um forno de 45 °C por duas horas. Mergulhe em 95% de etanol por mais de 2h.
  3. Adicione 0,5 g de sulfato de potássio de cromo e 5 g de gelatina a 1 L de água destilada. Dissolva-se em um banho de água de 60 °C antes de usar. A gelatina cromada pode ser armazenada a 4 °C por longos períodos.
  4. Solte 10 μL da gelatina cromada no slide e cubra de forma completa e uniforme toda a superfície do slide com a solução. Coloque o slide com o lado da gelatina para cima em um forno a 42 °C por 48 h. Os slides preparados podem ser armazenados a 4 °C para uso posterior.
    NOTA: Este é um passo crítico. O revestimento completo é necessário. Para mosca de fruta e seu embrião, esta abordagem de revestimento deslizante parece mais eficiente do que o revestimento de poli-liseina.

3. Embrião de Drosophila

  1. Coleção de embriões de Drosophila
    NOTA: Coletamos embriões de Drosophila em quatro períodos de 0-2 horas (blastoderm sincicial), 2-3 horas (blastoderm celular), 3-12 horas (gastrula precoce) e 12-24 horas (gastrula tardia)18. A proporção dos principais tipos de embriões em cada período é mostrada na Tabela 1.
    1. Coloque 400-500 moscas em uma garrafa de coleta de plástico e cubra a garrafa com a placa de ágar de suco de uva contendo extrato de levedura. Embriões de drosophila são colocados no ágar de suco de uva à temperatura ambiente.
    2. Colete quatro períodos de embriões, adicionando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flutuar os embriões. Transfira cerca de 200 embriões para um tubo centrífuga de 50 mL e mantenha-o no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões.
  2. Pré-incorporação
    1. Transfira 200 embriões de Drosophila para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões e, em seguida, descarte o sobrenatante com pipeta cuidadosamente. Adicione 1 mL de alvejante de 50% no tubo e agite-o suavemente por 2 minutos.
      NOTA: O alvejante deve preparar fresco, e a quantidade do alvejante pode variar dependendo da quantidade de embriões coletados.
    2. Colete suavemente embriões por despeje em papel filtro e lave-os 3 vezes com 1 mL de PBS a cada vez.
    3. Transfira os embriões com papel filtro para cerca de 5 mL de n-heptane.
    4. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mL. Adicione 1 mL de metanol e agite delicadamente. Coletar embriões após a sedimentação.
    5. Remova o supernaspe e lave os embriões em 1 mL de PBS 3-5 vezes.
    6. Fixar os embriões com 400 μL da solução de Bouin (ácido picrico saturado 71%, 24% de formalina, 5% ácido acético) por 30 min. Lave os embriões fixos 3 vezes em 1 mL de PBS por 5 minutos cada vez.
    7. Para agregar embriões, transfira as amostras para uma rolha de borracha e remova o PBS.
    8. Prepare 1,2% de solução agarose-PBS e mantenha a solução a 60 °C. Adicione 200 μL de solução agarose-PBS de 1,2% aos embriões para corrigi-los em um bloco de ágar.
    9. Tire o bloco da rolha e armazene o bloco na PBS.
      NOTA: Durante a abordagem pré-incorporação, o pró-aquecimento é fundamental para o sucesso. Sugerimos fortemente que os tubos centrífugas e as pontas de micropipette, que serão usados nesta etapa, devem ser completamente pré-aquecidos antes de operar.
  3. Incorporação de parafina
    1. Mergulhe o bloco de ágar pré-incorporado em 35% de etanol, 50% de etanol, 75% de etanol e 85% de etanol por 15 minutos cada. Em seguida, caia 2 vezes em 95% de etanol e 100% etanol.
      NOTAs: Cerca de 5-10x de volume de bloco de cada seguido por um fixador classificado por 15-30 minutos é necessário dependendo do número de embriões no bloco.
    2. Mergulhe o bloco de embriões em solução 100% etanol e xileno (proporção 1:1) por 15 min.
    3. Transfira o bloco para xileno por 1 min para tornar transparente o tecido embrião.
    4. Submergir o bloco em xileno e parafina (proporção de 1:1) por 30 min.
    5. Submergir o bloco em parafina I, parafina II, e parafina III por 2h cada vez.
    6. Encha a caixa de incorporação com parafina com antecedência e, em seguida, transfira suavemente e horizontalmente o bloco para o fundo da caixa de incorporação. Após a parafina se solidificar naturalmente, o bloco de parafina solidificada pode ser armazenado a 4 °C.
      NOTAs: A amostra pré-incorporada pode ser usada na crioseção seguindo as seguintes etapas. Depois que os embriões são pré-incorporados com agarose como descrito acima, as amostras são simplesmente incorporadas no Composto OCT. Posteriormente, a criosecção pode ser realizada de acordo com o protocolo de crioseção de rotina. Posteriormente, abordagens regulares de coloração podem ser usadas nas seções.

4. Mancha de hematoxilina-eosina

  1. Prepare seções de embriões de Drosophila . Coloque seções preparadas em um forno a 60 °C por 15 minutos e, em seguida, submerse as seções em xileno 2 vezes por 10 minutos cada. Submergir as seções uma vez em 100% etanol e xileno (proporção de 1:1) por 2 min.
  2. Hidrate as seções em 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, e em água destilada por 3 min.
  3. Manche as seções com solução de hematoxilina por 2 minutos. Mergulhe os slides em solução de álcool ácida de 1% (1 mL de ácido clorídrico, 100 mL de 70% de etanol) rapidamente e lave os slides em água destilada.
  4. Queda nos slides em 50% etanol, 75% etanol, 85% etanol e 95% etanol sequencialmente.
  5. Manche as seções com solução de eosina por 1 min.
  6. Desidratar os slides em 95% de etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II e 100% etanol III por 1 min cada vez.
  7. Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II, e 100% xileno III por 5 min cada vez.
  8. Monte os slides com bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.

5. Coloração periódica ácido-prata methenamina

  1. Desparafinar e hidratar seções de parafina do embrião de Drosophila à água destilada.
  2. Oxidar as seções em ácido periódico de 1% por 15 minutos em temperatura ambiente.
  3. Enxágüe os slides em água destilada 3 vezes por 1 min cada.
  4. Incubar os slides em cerca de 40 mL de solução de trabalho de methenamina prateada recém-filtrada (3% de methenamina, 5% de nitrato de prata, 5% solução de bortrato de sódio) por 1h e 20 minutos a 60 °C. Em seguida, enxágue os slides em água destilada por 1 min.
  5. Tonque os slides em cloreto de ouro de 0,2% por 2 min e enxágue os slides em água destilada por 1 min.
  6. Coloque os slides em 3% de tiossulfato de sódio por 3 minutos e depois enxágue os slides em água destilada por 1 min.
  7. Contratente os slides na hematoxilina por 30 s. Lave os slides em água da torneira por 3-5 min.
  8. Desidratar os slides em 70% de etanol, 80% etanol, 95% de etanol I, 95% de etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I e 100% etanol II por 5 min cada.
  9. Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.
  10. Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.

6. Imunohistoquímica

  1. Desparafinar e reidratar seções de parafina de embrião de Drosophila para PBS seguindo o protocolo padrão19.
  2. Trate slides com 0,3% de H2O2 em metanol por 10 minutos à temperatura ambiente e evite a luz.
  3. Pré-aqueça o tampão de recuperação de antígeno apropriado para aproximadamente 100 °C em um recipiente com os slides no vapor vegetal. O recipiente também deve ter uma tampa. Coloque os slides no recipiente. Feche a tampa do vapor.
    1. Mantenha o recipiente no vapor por 20 minutos a partir deste ponto. Observe que a tampa do recipiente de lâmina não deve ser totalmente apertada para que o vapor de água possa entrar durante o processo de vapor.
  4. Deixe que os slides retornem à temperatura ambiente antes de enxágüe-os suavemente em PBS-T (PBS com Interpol-20, pH 7.2) 3 vezes por 5 minutos cada e, em seguida, enxágue os slides em PBS 3 vezes por 1 min cada.
  5. Bloqueie os slides com 1% de albumina de soro bovino (BSA) na PBS por 60 minutos em temperatura ambiente.
  6. Incubar os slides com anticorpo primário (anti-FKBP12 a 1:1000) durante a noite a 4 °C ou em temperatura ambiente por 4h.
  7. Lave os slides em PBS-T 4 vezes por 5 minutos cada.
  8. Aplique os slides com polímero rotulado HRP conjugado com anticorpos secundários (anti-Coelho, 1:5.000) por 90 minutos à temperatura ambiente. Faça isso no escuro para evitar branqueamento de fotos.
  9. Lave os slides em PBS-T 3 vezes por 5 minutos cada.
  10. Incubar os slides com 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetrahidrocloreto (DAB) por 2-10 min até que a cor dos produtos de reação seja apropriada sob microscópio.
  11. Contratente os slides na hematoxilina por 30 s e lave os slides em água destilada 2 vezes por 5 minutos cada.
  12. Desidratar os slides em 50% etanol, 70% etanol, 90% etanol, 95% etanol e 100% etanol por 1 min cada.
  13. Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.
  14. Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.

7. Hibridização in-situ

NOTA: Foram preparadas seções de embrião de drosophila com água tratada de pirocarbonato de diotila (DEPC) de 0,01%. Todos os acessórios utilizados para a hibridização in situ aplicam o tratamento noturno DA DEPC com antecedência.

  1. Preparação de Riboprobe
    1. Linearize o DNA do modelo cortando um local de enzima de restrição rio abaixo da inserção clonada usando uma enzima de restrição que cria saliências de 5'. Após a linearização, purifique o DNA do modelo através da extração fenol/clorofórmio e da precipitação subsequente do etanol. Use protocolos padrão.
    2. Adicione 1 μg de DNA de modelo purificado a um tubo de centrífuga livre de RNase. Coloque o tubo de centrífuga no gelo. Adicione água tratada com DEPC suficiente ao volume total de 13 μL.
      1. Em seguida, adicione os seguintes reagentes em ordem: 2 μL de mistura de rotulagem NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição de 10x, 1 μL do inibidor RNase protetor, 2 μL de RNA Polymerase SP6 ou RNA Polymerase T7.
    3. Misture a reação por pipetação e centrífuga em breve. Incubar por 2 h a 37 °C.
      NOTA: Incubações mais longas não aumentam o rendimento do RNA rotulado. Um giro curto (~800 rpm) aplicado no tubo de reação é necessário para ser necessário antes de continuar para o próximo passo. Este giro permitirá que todo o conteúdo, que poderia gerar a partir da incubação, chegue ao fundo do tubo.
    4. Adicione 2 μL de DNase I sem RNase para remover o DNA do modelo e incubar por 15 min a 37 °C.
    5. Adicione 2 μL de 200 mM EDTA (pH 8.0) para parar a reação.
      NOTA: As sondas de RNA com rótulo DIG podem ser armazenadas a -15 a -25 °C em etanol durante um ano.
  2. Pré-hibridização da seção de embriões de Drosophila
    1. Coloque seções de embrião de Drosophila em forno de 42 °C por 48 h.
    2. Desparafinar os slides em 100% de xileno por 10 minutos duas vezes.
    3. Hidrate os slides sequencialmente submersos em 100% etanol, 95% etanol, 90% etanol, 70% etanol e 50% etanol por 5 min.
    4. Incubar os slides em PBS por 5 min 3 vezes para remover a solução fixativa/solução de Bouin do tecido.
    5. Lave os slides com 100 mmol/L glicina/PBS solução 2 vezes por 5 min cada.
    6. Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
    7. Incubar os slides com 0,3% Triton X-100 em PBS por 15 minutos para permeabiliizar as membranas.
    8. Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.
    9. Incubar os slides em 15 μg/mL RNase-free proteinase K por 30 minutos a 37 °C.
    10. Incubar os slides com 4% de paraformaldeído em PBS por 3 minutos para parar a digestão.
    11. Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
    12. Incubar os slides em tampão de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) com anidrido acético de 0,25% (v/v) 2 vezes por 5 min cada.
    13. Adicione água DEPC na câmara de umidade do slide. Adicione 20 μL de solução de pré-hibridização (contendo 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão) nas lâminas. Coloque os slides na câmara de umidade do slide. Incubar os slides a 42 °C por 4 h.
      NOTA: É necessário garantir o aperto da tampa da caixa molhada e que a caixa molhada seja sempre mantida horizontalmente para evitar a volatilização e o desvio do tecido da solução de pré-hibridização e da solução de hibridização seguida.
  3. Hibridização da seção de embriões de Drosophila
    1. Remova a solução de pré-hibridização e lave os slides com 0,2x SSC (cloreto de sódio de 150 mM, citrato de sódio de 15 mM, pH 7.0) 3 vezes por 5 min cada. Limpe o excesso de 0,2x SSC ao redor das amostras de tecido.
    2. Aplique 30 μL de solução de hibridização da sonda (contendo 2-6 ng de sonda RNA com etiqueta de digoxina, diluindo em solução de pré-hibridização) com uma pipeta. Incubar os slides na câmara de umidade de slides a 42 °C por aproximadamente 20 h.
      NOTA: Certifique-se do aperto da tampa como sugestão da última nota. Caso contrário, o secamento causado pelo vazamento de pré-hibridização ou pré-hibridização gerará fundo sujo, incluindo pseudo-positivo em slides.
  4. Hibridização
    1. Remova a solução de hibridização e lave os slides com solução SSC 4 vezes por 15 minutos cada a 37 °C.
    2. Lave os slides em solução SSC 2x com 20 μg/mL de RNase A por 30 min a 37 °C.
    3. Lave os slides em solução SSC de 1x por 15 min a 37 °C.
    4. Lave os slides em solução SSC de 0,5x por 15 min a 37 °C.
    5. Lave os slides em solução SSC de 0,1x por 15 min a 37 °C.
    6. Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.
    7. Lave os slides no tampão de lavagem (100 mM ácido masculino, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Interpol 20, pH 7.5) por 1 min.
    8. Incubar os slides em 100 mL de solução de bloqueio recém-preparada (2% soro de ovelha em tampão de ácido maleico sem Interpol 20) por 30 minutos.
    9. Incubar os slides em 20 mL de solução de anticorpos por 45 minutos.
      1. Centrifugar o anticorpo por 5 min a 10.000 rpm no frasco original antes de cada uso, e encaixe a quantidade necessária cuidadosamente da superfície. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) na solução de bloqueio.
    10. Lave os slides em 100 mL de tampão de lavagem 2 vezes por 15 minutos cada para remover o conjugado de anticorpos desvinculados.
    11. Equilibre os slides em 20 mL de tampão de detecção (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) por 2-5 min.
    12. Incubar os slides com 10 mL de solução de substrato de cores recém-preparada na câmara de umidade de slides. A reação começa em poucos minutos e é completa após 16 h. Não agite ou misture enquanto a cor estiver se desenvolvendo.
    13. Lave os slides com 50 mL de água destilada por 5 minutos para parar a reação.
    14. Seque a amostra durante a noite no escuro.
    15. Desidratar os slides em 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I e 100% etanol II por 3 min cada.
    16. Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 20 min cada.
    17. Monte os slides com bálsamo neutro.
    18. Documente imagens e analise com a microscopia invertida e o software do fabricante. Realizar análise de distribuição utilizando ImageJ de acordo com a densidade de sinal positivo ao longo do eixo longitudinal ou dentro da zona diferencial de embriões.
      NOTA: Durante a incubação com a solução de substrato de cores recém-preparada na etapa 7.4.12, a cor da reação pode ser vista mesmo com um olho nu. Esta observação sobre como o desenvolvimento de cores pode ser inspecionado sob estereoscópio. Uma vez que a cor da reação é razoável e o passo 7.4.13 pode ser realizado para parar a reação.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As figuras descrevem protocolos usados para superar o desafio de anexar embriões de chorão de alta lipídica e de chitina (Tabela 1) à superfície do slide de vidro para exame e experimentação. Utilizando o método de revestimento de slides de gelatina cromada mostrado na Figura 1, aumentamos a fixação de embriões de Drosophila na superfície dos slides, enquanto o método de pré-incorporação de embriões mostrado na Figura 2 permite...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações apresentam-se como arritm...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (#31771377/ 31571273/31371256), o Programa de Cientistas Distintos Estrangeiros do Departamento Nacional de Educação (#MS2014SXSF038), o Fundo Nacional de Pesquisa das Universidades Centrais do Departamento de Educação (#GK201301001 201701005/GERP-17-45) e XZ são apoiados pelo Fundo de Tese de Doutorado Excepcional (#2019TS082/2019TS079), Programa-Chave do Departamento de Educação Provincial de Shaanxi (#20JS138), o Projeto Jovem do Programa de Pesquisa Básica de Ciências Naturais do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (#2020JQ-885).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
-20° C FrigoríficoMeiling Biologia & MédicoDW-YL270Usado para armazenamento regente-80
° C Refrigerador de temperatura ultra baixaThermo Forma 90Series Usado para armazenamento de regentes
ÁgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparação de placas de ágar suco de uva
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de FabRoche11093274910Para a detecção de composto marcado com digoxigenina
Incubadora bioquímicaShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hibridização
Solução de BouinReagente Químico Sinopharm em Pequim69945460Drosophila Centrífuga de Incorporação de Embriões
Eppendorf540BH07808In-situ Tubo
CentrífugaDenvilleC-2170Coleção de Embriões de Drosophila
Reagente Químico Sinopharm de Alum de Cromoem Lâminasrevestimentode 10001018
Banho-maria de temperatura constanteJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCColoração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata
Dako REAL EnVision Sistema de detecçãoDakoK5007Na reação imuno-histoquímica ou reação de hibridização in situ, ele se liga ao anticorpo antígeno primário e o alvo é marcado por coloração.
DIG de hibridização in-situDEPCSigma-AldrichD5758
RNA11093274910Rochecom diagoxigenina-UTP por transcrição in vitro com RNA polimerase SP6 e T7
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Os estoques de Drosophila melanogaster mutante
Forno elétrico de secagem por explosãoTianjin Taiste Instruments101-0ABPara revestimento de lâminas e incorporação de parafina
EosinSigma-Aldrich230251Coloração de Hematoxilina-Eosina
Reagente Químico de Sinopharm de Etanol em Pequim100092680Incorporação de Parafina, Coloração de Hematoxilina-Eosina, Imuno-histoquímica, Hibridização In-situ e Coloração
de Ácido Periódico-Prata MetenaminaReagente químico de gelatinaSinopharm em lâminasde revestimentode 10010328
Cloreto de ouroSigma-Aldrich379948Coloração de metenamina de ácido periódico-prata
HematoxilinaSigma-AldrichH3136Coloração de hematoxilina-eosina
Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza Roche11732668001Para purificação de produtos
de PCRCaixa inteligente de temperatura e umidade constanteNingbo Jiangnan InstrumentsHWSpara manutenção de moscas
LE AgaroseHyAgarose14190108029Reagente químico pré-incorporado de
metanolSinopharm em Pequim10014108Microscópio de coleta de embriões Drosophila
ZEISSObserver.A1Coloração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata
Lâminas de microscópioMeVid Labware ManufacturingP105-2001Lâminas de revestimento
goma neutraSinopharm em Pequim10004160Coloração de hematoxilina-eosina
N-heptanoSinopharm em Pequim40026768Embrião de Drosophila Coleção
Cortador de parafinaHuahai instrumento científicoHH-2508IIIem>In-situ Reagente químico de parafina de hibridização
Sinopharm em Pequim69019461Medidor
pH / mVSartoriusPB-10Para determinar o valor de pH de uma solução
Reagente químico Sinopharmnitrato de pratade coloração de metenamina de ácido periódico-prata
ThermoAFXI-0501-PIn-situ
xilenoSinopharm10023418incorporação de parafina
de de Hibridização de de PequimKit de marcação de RNA Marcação de da de PequimReagente químico deReagente químico< de de incorporação de parafina de na 10018461 de Pequim Medidor de água ultrapuro Reagente químico de de hibridização em Pequim

Referências

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