Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Summary

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Abstract

Este protocolo descreve um método para obter frações proteicas subcelulares de células de mamíferos usando uma combinação de detergentes, lise mecânica e centrifugação de gradiente de densidade isopícnica. A principal vantagem deste procedimento é que ele não depende do uso exclusivo de detergentes solubilizantes para obter frações subcelulares. Isso torna possível separar a membrana plasmática de outras organelas ligadas à membrana da célula. Este procedimento facilitará a determinação da localização de proteínas em células com um método reprodutível, escalável e seletivo. Este método tem sido usado com sucesso para isolar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriais e da membrana plasmática da linhagem celular de monócitos humanos, U937. Embora otimizado para esta linhagem celular, este procedimento pode servir como um ponto de partida adequado para o fracionamento subcelular de outras linhagens celulares. Possíveis armadilhas do procedimento e como evitá-las são discutidas, assim como alterações que podem precisar ser consideradas para outras linhagens celulares.

Introduction

O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente^1,2,<....

Protocol

1. Prepare tampões e reagentes

1. Prepare soluções frescas de fosfatase e inibidores da protease.
   1. Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM.
      NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear o PMSF, pois é perigoso quando ingerido ou inalado e em contato com a pele ou os olhos. É corrosivo para os olhos e pele.
   2. De acordo com as instruções do fabricante, prepare um coquetel inibidor de protease comercialmente disponível (100x).
   3. Adicione 91,9 mg de ortovanadato de sódio (SOV) a 1 mL de água deionizada para preparar um estoque de 500 mM.
      NOTA: Use equipament....

Results

Um fluxograma esquemático deste procedimento (Figura 1) resume visualmente as etapas que foram tomadas para fracionar com sucesso as células U937⁵ cultivadas em suspensão. As frações coletadas do topo do gradiente de densidade isopícnico em volumes iguais (1 mL) mostram a purificação das frações mitocondrial e de membrana (Figura 2). A utilização de um anticorpo contra VDAC, uma proteína localizada na membrana mitocondrial externa

Discussion

Este método é uma versão modificada de uma abordagem previamente publicada para o fracionamento subcelular sem o uso de centrifugação de alta velocidade¹¹. Este método modificado requer equipamentos mais especializados para alcançar os melhores resultados, mas é mais abrangente e consistentemente reprodutível.

O desenvolvimento do protocolo inicial foi necessário devido à incapacidade de separar amostras mitocondriais e de membrana para a análise da localização proteica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Liquidificador de Bala Homogeneizador de Tecidos	Next Advance	61-BB50-DX
digitonina	Sigma	D141
rotador de ponta a ponta	ThermoFisher
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma	E9884
ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetracético (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexilenoglicol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Detergente não iônico e não desnaturante
KCl	Sigma	P9333
Manitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Tubos Polyclear de Topo Aberto, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol)  Gradiente de densidade médio	Sigma	D1556-250ML
fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF)	Sigma	P7626
, uso geral	Centrífuga	M221-1ML
Rotor de balde oscilante
	Sigma	436143
Desoxicolato de sódio	Sigma	D6750
ortovanadato de sódio (SOV)	Sigma	567540
sonicador	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrífuga	ThermoFisher
Contas de aço inoxidável 3,2 mm	Next Advance	SSB32
Sacarose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			detergente não iônico em tampões de western blotting
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661