Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Abstract

Este protocolo descreve um método para obter frações proteicas subcelulares de células de mamíferos usando uma combinação de detergentes, lise mecânica e centrifugação de gradiente de densidade isopícnica. A principal vantagem deste procedimento é que ele não depende do uso exclusivo de detergentes solubilizantes para obter frações subcelulares. Isso torna possível separar a membrana plasmática de outras organelas ligadas à membrana da célula. Este procedimento facilitará a determinação da localização de proteínas em células com um método reprodutível, escalável e seletivo. Este método tem sido usado com sucesso para isolar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriais e da membrana plasmática da linhagem celular de monócitos humanos, U937. Embora otimizado para esta linhagem celular, este procedimento pode servir como um ponto de partida adequado para o fracionamento subcelular de outras linhagens celulares. Possíveis armadilhas do procedimento e como evitá-las são discutidas, assim como alterações que podem precisar ser consideradas para outras linhagens celulares.

Introduction

O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente1,2, contando com o uso de tampões contendo quantidades crescentes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Embora este método seja rápido e conveniente, resulta em frações impuras. Estes são projetados para permitir que os pesquisadores isolem facilmente um ou dois componentes da célula, mas não são complexos o suficiente para isolar múltiplas frações subcelulares de uma amostra ao mesmo tempo. Depender apenas de detergentes geralmente resulta em organelas fechadas por membrana e a membrana plasmática sendo indiscriminadamente solubilizada, dificultando a separação desses componentes. Uma complicação adicional do uso desses kits é a incapacidade dos pesquisadores de alterá-los / otimizá-los para aplicações específicas, já que a maioria dos componentes são formulações proprietárias. Finalmente, esses kits podem ser proibitivamente caros, com limitações no número de usos que os tornam menos do que ideais para amostras maiores.

Apesar da disponibilidade de kits para o isolamento de mitocôndrias que não dependem de detergentes, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e produzir quantidades significativamente menores de amostra do que os protocolos de isolamento padrão 3,4. Embora os métodos de centrifugação diferenciais sejam mais demorados, eles geralmente resultam em frações distintas que não podem ser obtidas com kits exclusivamente à base de detergente1. A separação sem o uso exclusivo de detergentes solubilizantes também permite uma purificação adicional usando ultracentrifugação e gradientes de densidade isopícnica, resultando em menos contaminação cruzada. Este protocolo de fracionamento demonstra o isolamento de frações subcelulares dos monócitos U937 usando uma combinação de abordagens baseadas em detergente e centrífuga de alta velocidade. Este método facilitará o isolamento dos componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriais e da membrana plasmática de uma célula de mamíferos com contaminação mínima entre as frações.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prepare tampões e reagentes

  1. Prepare soluções frescas de fosfatase e inibidores da protease.
    1. Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM.
      NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear o PMSF, pois é perigoso quando ingerido ou inalado e em contato com a pele ou os olhos. É corrosivo para os olhos e pele.
    2. De acordo com as instruções do fabricante, prepare um coquetel inibidor de protease comercialmente disponível (100x).
    3. Adicione 91,9 mg de ortovanadato de sódio (SOV) a 1 mL de água deionizada para preparar um estoque de 500 mM.
      NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear SOV, pois é perigoso se ingerido, inalado ou em contato com os olhos. A superexposição grave pode resultar em morte.
  2. Prepare o tampão de lise A, o tampão de isolamento citoplasmático (IC), o tampão de solubilização celular (CS), o tampão de lise nuclear (NL), o tampão de lise B, o tampão de homogeneização celular (CH), o diluente de iodixanol e os detergentes.
    1. Adicionar 8,7 g de cloreto de sódio (NaCl) e 50 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES, 1 M, pH 7,4) a 950 mL de água desionizada para preparar o tampão de lise A (concentrações finais de 150 mM de NaCl e 50 mM de HEPES).
    2. Preparar soluções-mãe de detergentes do seguinte modo: adicionar 0,1 g de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10 ml de tampão de lise A (concentração final de 1% SDS), adicionar 0,1 g de desoxicolato de sódio a 10 ml de tampão de lise A (concentração final de 1%), adicionar 2,5 mg de digitonina a 10 ml de tampão de lise A (concentração final de 250 μg/ml), e adicionar 1 ml de detergente não iónico e não desnaturante (ver Tabela de Materiais) a 9 ml de tampão de lise A (concentração final de 10% (v/v)).
    3. Prepare o tampão de IC adicionando 10 μL de estoque de PMSF (100 mM), 10 μL de inibidor de protease (100x), 2 μL de estoque de SOV (500 mM) e 100 μL de digidina de estoque (250 μg/mL) a 878 μL de tampão de lise A (concentrações finais de 1 mM de PMSF, 1x inibidor de protease, 1 mM SOV e 25 μg/mL de digilonina). Mantenha a solução no gelo até a adição ao pellet celular.
    4. Preparar o tampão CS adicionando 10 μL de reserva de PMSF (100 mM), 10 μL de inibidor de protease (100x), 2 μL de reserva de SOV (500 mM), 100 μL de detergente não iónico e não desnaturante (ver o Quadro de Materiais) (10%) e 118 μL de stock de hexilenglicol (8,44 M) a 760 μL de tampão de lise A (concentrações finais de 1 mM de PMSF, 1x inibidor de protease, 1 mM SOV, 1% de detergente não iônico, não desnaturante e 1 M de hexilenoglicol). Mantenha a solução no gelo até a adição ao pellet celular.
    5. Preparar o tampão NL adicionando 10 μL de estoque de PMSF (100 mM), 10 μL de inibidor de protease (100x), 2 μL de estoque de SOV (500 mM), 50 μL de estoque de desoxicolato de sódio (10%), 100 μL de estoque de SDS (1%) e 118 μL de estoque de hexilenoglicol (8,44 M) a 710 μL de tampão de lise A (concentrações finais de 1 mM de PMSF, 1x inibidor de protease, 1 mM SOV, 0,5% de desoxicolato de sódio (v/v), 0,1% SDS (p/v) e 1 M de hexilenoglicol). Mantenha a solução no gelo até a adição ao pellet nuclear.
    6. Adicionar 20 mL de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g de cloreto de potássio (KCl), 0,19 g de cloreto de magnésio (MgCl 2), 2 mL de ácido etilenodiaminotetracético (0,5 M EDTA),2 mL de etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N',N'-tetracético (0,5 M EGTA), 38,3 g de manitol e 23,9 g de sacarose a 980 mL de água desionizada para preparar o tampão de lise B (concentrações finais de 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM manitol e 70 mM de sacarose).
    7. Preparar o tampão CH adicionando 10 μL de estoque de PMSF (100 mM) e 2 μL de estoque de SOV (500 mM) a 988 μL de tampão de lise B (concentrações finais de 1 mM de PMSF e 1 mM SOV; ajustar o volume final para acomodar o número de células que estão sendo lisadas). Mantenha a solução no gelo até a adição ao pellet celular.
    8. Preparar o diluente de iodixanol com adição de 12 mL de HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg de KCl, 114 g de MgCl 2, 1,2 mL de EDTA 0,5 M,1,2 mL de EGTA 0,5 M, 21,3 g de manitol e 14,4 g de sacarose a 88 mL de água deionizada (concentrações finais de 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM manitol e 420 mM de sacarose).
    9. Armazenar tamponamentos a 4 °C e digitonina a -20 °C.

2. Isolamento proteico citosólico

NOTA: As etapas a seguir permitirão o crescimento e a expansão das células U937, seguidas pela extração de proteínas citosólicas. Na concentração utilizada, a digitonina permeabilizará a membrana plasmática sem interrompê-la, permitindo a liberação de proteínas citosólicas e a retenção de outras proteínas celulares.

  1. Culturar as células em RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino a 37 °C e 5% de CO2. Certifique-se de que as células são cultivadas para um total final de 6 x 108 células.
    NOTA: Neste protocolo, as células foram contadas usando um hemocitômetro padrão e microscópio.
  2. Centrifugar as células cultivadas a 400 × g durante 10 min. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente a uma concentração final de 4 × 106 células/mL e pipetar suavemente para quebrar os aglomerados.
  3. Centrifugar a suspensão celular a 400 × g durante 10 minutos para peletizar as células. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de lise gelado A (preparado na etapa 1.2.1) a uma concentração final de 2 × 107 células/mL.
  4. Remover 7,5 ml das células suspensas no tampão de lise A (3 × 107 células) e manter no gelo para extração de proteínas nucleares (secção 6). Centrifugar a suspensão celular a 4 °C, 400 × g durante 10 min para peletizar as células.
    NOTA: Execute todas as etapas subsequentes a 4 °C ou no gelo e pré-resfrie todos os buffers.
  5. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em tampão CI a uma concentração final de 2 × 107 células/mL e pipete suavemente para quebrar os aglomerados. Girar a suspensão da célula de ponta a ponta a 4 °C durante 20 minutos.
  6. Centrifugar a suspensão celular a 4 °C, 400 × g durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo. Salve o pellet da célula e armazene no gelo. Centrifugar o sobrenadante coletado a 4 °C, 18.000 × g por 20 min para pellet detritos celulares.
    NOTA: Esta etapa de centrifugação de alta velocidade é fundamental para prevenir a contaminação da fração citosólica com organelas e proteínas ligadas à membrana.
  7. Descarte o pellet depois de transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo. Repetir ambas as etapas de centrifugação na etapa 2.6 até que nenhum pellet seja obtido após a centrifugação.
  8. Colete o sobrenadante, que é a fração citosólica. Para armazenagem a curto prazo (1 mês), assegurar que o sobrenadante é armazenado a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo (>1 mês), combinar o sobrenadante com 1x tampão Laemmli contendo 1x agente redutor, aquecer a 95 °C durante 7 min e armazenar a -20 ou -80°C.
  9. Ressuspender o pellet celular (a partir do passo 2.6) no tampão de lise A a uma concentração final de 4 × 106 células/ml; pipeta suavemente para quebrar aglomerados.

3. Homogeneização celular

NOTA: As etapas a seguir permitirão a homogeneização mecânica de células tratadas com digitonina (a partir da etapa 2.9), que é necessária para o isolamento das frações proteicas mitocondriais e de membrana.

  1. Centrifugar a suspensão celular no tampão de lise A (preparado no passo 2.9), guardar o pellet e eliminar o sobrenadante para remover o excesso de digidina e contaminantes citosólicos do pellet celular.
    NOTA: Lavagens repetidas no tampão de lise A podem ser realizadas para remover o excesso de contaminantes citosólicos.
  2. Ressuspender o pellet celular em tampão CH gelado (preparado na etapa 1.2.7) a uma concentração final de 4 × 106 células/ml. Incubar a suspensão celular no gelo por 30 min.
  3. Se estiver usando um método à base de contas para lise mecânica, coloque 30 g de contas de aço inoxidável pré-lavado de 3,2 mm em um tubo de contorno de 50 mL, encha com 15 mL de tampão de lise B e coloque no gelo para esfriar. Se estiver usando um homogeneizador Dounce (com um pilão B apertado), preencha com um volume apropriado de tampão de lise B, insira o pilão e coloque no gelo para esfriar.
  4. Após a incubação (etapa 3.2), descarte o tampão de lise B dos tubos de esferas (ou homogeneizador de Dounce) e transfira 15 mL da suspensão celular para o tubo de grânulos (ou um volume apropriado para o homogeneizador).
  5. Se estiver usando o método baseado em contas, coloque os tubos de esferas com rodapé contendo a suspensão celular no dispositivo do liquidificador e configure para funcionar por 5 minutos na velocidade 8. Se estiver usando um homogeneizador Dounce, mantenha-o no gelo e execute 40 passes com o pilão usando traços lentos e uniformes (ou utilize um método alternativo de lise celular mecânica, conforme detalhado na seção de discussão).
    NOTA: Se estiver usando um dispositivo de liquidificador diferente do usado aqui, a velocidade e o tempo podem precisar ser determinados empiricamente.
  6. Transferir o homogeneizado para um tubo de centrifugação limpo e centrifugar-o a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo e salve; descarte o pellet.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e o homogeneizado armazenado a 4 °C para o curto prazo (24 h).

4. Remoção de detritos e isolamento de frações mitocondriais e de membrana brutas

NOTA: As etapas a seguir permitirão a remoção de detritos celulares centrifugando o homogeneizado em velocidades crescentes. Isto é seguido por centrifugação diferencial para o isolamento de frações mitocondriais e de membrana brutas.

  1. Centrifugar o homogeneizado (a partir do passo 3.6) a 500 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo e descarte qualquer pelota.
  2. Centrifugar o sobrenadante (a partir do passo 4.1) a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo e descarte qualquer pelota.
  3. Centrifugar o sobrenadante (a partir do passo 4.2) a 2 000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo e descarte qualquer pelota.
  4. Centrifugar o sobrenadante (a partir do passo 4.3) a 4.000 × g durante 20 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo e salve o pellet, que é a fração mitocondrial bruta.
  5. Centrifugar o sobrenadante (a partir do passo 4.4) a 18.000 × g durante 1 h a 4 °C. Descarte o sobrenadante e salve o pellet, que é a fração de membrana bruta.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras peletizadas armazenadas a 4 °C a curto prazo (24 h).

5. Purificação do gradiente de densidade isopícnica

NOTA: As etapas a seguir utilizam a centrifugação por gradiente de densidade isopínica para purificar as frações mitocondriais e de membrana brutas.

  1. Preparar uma solução de trabalho a 50% (v/v) de iodixanol misturando 1 parte de diluente (preparado no passo 1.1.3) a 5 partes de iodixanol ( solução de reserva a 60% (p/v)). Preparar soluções de iodixanol a 10%, 15%, 20%, 25%, 30% e 35% (v/v) misturando solução de trabalho a 50% (v/v) com tampão de lise B em quantidades apropriadas.
  2. Ressuspender os pellets brutos mitocondriais e de membrana (a partir das etapas 4.4 e 4.5) cada um em 200 μL de tampão de lise B. Ajustar a 45% de iodixanol (v/v) adicionando 1800 μL de solução de iodixanol de trabalho (50% (v/v)) a 200 μL do pellet ressuspenso.
  3. Criar um gradiente descontínuo de iodixanol da seguinte forma (ajustar os volumes conforme apropriado para a capacidade do tubo ultracentrífugo): Adicionar 1 mL de iodixanol a 15% (v/v) ao fundo de um tubo ultracentrífugo de 8 mL, aberto, de paredes finas, colocar 1 mL de iodixanol a 20% (v/v) abaixo da primeira camada (pela técnica de underlaying), seguido de underlay 1 mL de 25%, 1 mL de 30% e 1 mL de iodixanol a 35% (v/v).
    NOTA: Deve haver 2 gradientes criados nesta etapa, 1 para a fração mitocondrial e 1 para a fração membrana.
  4. Em 1 gradiente, adicionar os 2 mL do pellet mitocondrial bruto (suspenso em iodixanol a 45% (v/v)) utilizando a técnica de underlay ao fundo do tubo abaixo do iodixanol a 35% (v/v). No outro gradiente, adicionar os 2 mL do pellet de membrana bruta (suspenso em iodixanol (v/v) a 45%) usando a técnica de underlay ao fundo do tubo abaixo do iodixanol a 35% (v/v).
  5. Adicione 1 mL de iodixanol a 10% (v/v) ao topo de cada tubo gradiente, sobrepondo-o sobre a camada de 15%. Equilibrar os tubos a 0,1 g um do outro pela adição de 10% de iodixanol (v/v).
  6. Gire os tubos de gradiente de densidade a 4 °C durante 18 h a 100.000 × g. Certifique-se de definir a aceleração e a desaceleração para os valores mínimos para a ultracentrífuga que está sendo usada.
    NOTA: No gradiente mitocondrial, haverá uma faixa visível na interface entre 25% e 30% de iodixanol (v/v). Esta é a fração mitocondrial pura. No gradiente de membrana, haverá uma faixa visível na fração iodixanol (v/v) a 15%. Esta é a fração de membrana pura. Pode haver bandas adicionais nas frações de iodixanol (v/v) a 25% e 30% no gradiente de membrana. Esta é a contaminação mitocondrial.
  7. Coletar frações do topo do tubo em alíquotas de 1 mL, tendo o cuidado de minimizar o volume da fração contendo as bandas visíveis e alterando a ponta da pipeta após cada camada ser coletada. Alternativamente, perfure o lado do tubo de paredes finas com uma agulha e colete as bandas visíveis.
  8. Conservar as amostras conforme descrito na etapa 2.8 até à verificação por ensaio proteico e western blot.

6. Isolamento das proteínas nucleares

NOTA: Usando detergentes iônicos e não iônicos, bem como técnicas como sonicação e centrifugação, as etapas a seguir irão solubilizar todas as membranas celulares e permitir o isolamento de proteínas nucleares.

  1. Centrifugar a alíquota de 7,5 mL de células suspensas no tampão de lise A (a partir da etapa 2.4) e descartar o sobrenadante. Adicionar 800 μL de tampão CS gelado (preparado no passo 1.2.4) e ressuspender o pellet por pipetagem e vórtice. Incubar as amostras no gelo (ou a 4 °C) durante 30 minutos para perturbar as membranas plasmáticas e organelas, protegendo as proteínas nucleares.
  2. Centrifugar a suspensão celular a 7.000 × g durante 10 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante. Adicionar 800 μL de tampão NL gelado (preparado na fase 1.2.5) ao pellet nuclear após a inclusão de 1U/μL benzonase. Ressuspeite o pellet pipetando suavemente. Incubar num rotador de ponta a ponta durante 30 minutos a 4 °C para perturbar a membrana nuclear.
  3. Sonicate por 5 s a 20% de potência com tubos de amostra resfriados em um banho de gelo (3x, com pausas de 5 s entre pulsos), que juntamente com a benzonase (adicionada na etapa 6.2), irá cisalhar os ácidos nucleicos.
  4. Centrifugar o sonicato a 7.800 × g durante 10 min a 4 °C. Colete e salve o sobrenadante, que é a fração nuclear. Certifique-se de não perturbar o pellet insolúvel durante a coleta do sobrenadante. Para armazenagem, as amostras podem ser preparadas conforme descrito na etapa 2.8.

7. Quantificação de proteínas e análise de western blot

NOTA: As etapas a seguir quantificarão a proteína total em cada fração e confirmarão a pureza das frações subcelulares.

  1. Realize um ensaio de Bradford padrão para quantificar a proteína total em cada fração. Consulte a Tabela 1 para obter os rendimentos esperados de proteínas.
    NOTA: Outros ensaios proteicos, como o ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) ou a absorbância a 280 nm, podem ser utilizados para medir a proteína total em vez de um ensaio de Bradford.
  2. Combinar fracções com 1x tampão Laemmli contendo 1x agente redutor e aquecer a 95 °C durante 7 min. Carregar 10 μg de cada fração em um gel padrão de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e executar o gel a 20 mA por 1 h.
  3. Transfira as proteínas resolvidas para uma membrana de polivinildifluoreto (PVDF) realizando uma transferência padrão de immunoblot a 100 V por 30 min. Bloquear a membrana de PVDF com 5% de leite em 1x solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de detergente não iônico (v/v) por 30 min à temperatura ambiente.
  4. Adicione os anticorpos primários apropriados para detectar proteínas de limpeza específicas para cada fração subcelular e incube durante a noite a 4 °C. Lave a membrana com 5% de leite em 1x TBS contendo 0,1% do detergente não iônico (v/v) por 10 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Para este protocolo, anticorpos contra gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, 1:10000), histona H3 (1:2000), canal ânion voltagem-dependente (VDAC, 1:1000) e Na,K+-ATPase foram utilizados para frações citosólicas, nucleares, mitocondriais e de membrana, respectivamente.
  5. Adicionar os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) apropriados à membrana (diluir de acordo com as instruções do fabricante) e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Lave a membrana com 5% de leite em 1x TBS contendo 0,1% do detergente não iônico (v/v) por 10 min à temperatura ambiente. Desenvolva a mancha usando quimioluminescência padrão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um fluxograma esquemático deste procedimento (Figura 1) resume visualmente as etapas que foram tomadas para fracionar com sucesso as células U9375 cultivadas em suspensão. As frações coletadas do topo do gradiente de densidade isopícnico em volumes iguais (1 mL) mostram a purificação das frações mitocondrial e de membrana (Figura 2). A utilização de um anticorpo contra VDAC, uma proteína localizada na membrana mitocondrial externa6, mostra que a fração mitocondrial migrou para as frações de iodixanol (v/v) de 25% e 30% (Figura 2A). O uso de um anticorpo contra a subunidade Na,K+-ATPase α1, parte de um heterodímero de membrana integral encontrado principalmente na membrana plasmática7, mostra a separação da contaminação da membrana da fração mitocondrial pura (Figura 2A). A fração de membrana pura migrou para as frações menos densas, iodixanol (v/v) a 10% e 15% (Figura 2B). A contaminação mitocondrial da fração de membrana foi separada pelo gradiente.

Um western blot8 realizado com os marcadores de localização adicionais (referenciados na etapa 7.4) mostra a pureza das frações citosólica e nuclear, além de verificar que as amostras mitocondriais e de membrana estão livres de contaminação por proteínas de outras partes da célula (Figura 3). O uso de um anticorpo contra o GAPDH, normalmente localizado no citoplasma da célula9, mostra que essa proteína só é encontrada na fração citosólica (Figura 3A, Faixa 1, primeiro painel), e que nenhuma contaminação é observada nas proteínas nucleares extraídas, nas mitocôndrias purificadas pela densidade ou nas frações de membrana (Figura 3A; Faixas 2, 3 e 4; primeiro painel). A sondagem para histona H3, uma proteína encontrada no núcleo e envolvida na estrutura da cromatina10, mostra uma extração nuclear bem-sucedida (Figura 3A, Faixa 2, segundo painel), com alguma detecção mínima na fração citoplasmática e nenhuma contaminação cruzada nas frações mitocondrial ou de membrana.

A sondagem para VDAC em todas as frações mostra a presença dessa proteína na fração mitocondrial pura (Figura 3A, Faixa 3, terceiro painel), e que não existe contaminação cruzada nas demais frações (Figura 3A; Faixas 1, 2 e 4; terceiro painel). A sondagem para a subunidade Na/K-ATPase α1 também mostra que essa proteína está localizada apenas na fração de membrana pura (Figura 3A, Pista 4, quarto painel). Essas frações foram analisadas por densitometria para confirmar a reprodutibilidade e significância estatística (Figura 3B-E). Em contraste com os resultados do fracionamento bem-sucedido (Figura 3), a execução inadequada desse método (ou a não adesão a todas as etapas recomendadas) pode resultar em contaminação cruzada dos componentes celulares (Figura 4). Uma alta concentração de histona H3 na fração citosólica (Figura 4, Faixa 1, segundo painel) pode resultar de uma falha no esclarecimento adequado da fração citosólica (referenciada na etapa 2.6). Isso pode ocorrer se não forem realizados giros de centrífuga de clarificação suficientes ou se a fração citosólica não for esclarecida rapidamente. Se a fração citosólica não for esclarecida com rapidez suficiente, pode resultar em lise dos fragmentos celulares, levando à contaminação da fração citosólica.

A falha em executar a etapa de purificação da densidade isopicênica resultará na contaminação da fração de membrana (Figura 4, Faixa 4, todos os painéis), dependendo de quão heterogênea a amostra é antes da purificação da densidade. A adesão adequada a todas as etapas do protocolo é fundamental para a obtenção da separação desejada das frações subcelulares. Quando quantificado usando um ensaio de Bradford, o rendimento de proteína para cada fração pode ser determinado. O rendimento esperado de proteína por fração é relatado na Tabela 1. É útil realizar um ensaio de quantificação de proteínas antes de realizar western blots por várias razões. Primeiro, confirma que as frações realmente contêm proteínas; em segundo lugar, permite o carregamento de géis SDS-PAGE com base na quantidade de proteína; e, por fim, supondo que os rendimentos proteicos sejam semelhantes aos esperados (Tabela 1), confirma a boa execução do procedimento.

Figure 1
Figura 1: Diagrama do procedimento de fracionamento celular. Uma visão geral do protocolo de fracionamento celular representado como um fluxograma. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; CS = solubilização celular; NL = lise nuclear. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Purificação da densidade isopínica das frações mitocondriais e de membrana brutas . (A) Mancha ocidental representativa de todas as frações coletadas após a purificação do gradiente de densidade da fração mitocondrial bruta. (B) Mancha ocidental representativa de todas as frações coletadas após purificação do gradiente de densidade da fração de membrana bruta. Ambas as purificações do gradiente de densidade mostram migração do marcador mitocondrial, VDAC, para as frações de iodixanol (v/v) a 25% e 30% e migração do marcador de membrana, Na,K+ ATPase, para as frações de iodixanol (v/v) a 10% e 15%. Abreviação: VDAC = canal de ânion dependente de tensão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Isolamento bem-sucedido das frações citosólicas, nucleares, mitocondriais e de membrana U937. (A) Manchas ocidentais representativas de frações celulares isoladas de uma cultura de células U937 com esta técnica e sondadas para marcadores de citoplasma (GAPDH, primeiro painel), núcleo (Histona H3, segundo painel), mitocôndrias (VDAC, terceiro painel) e membrana (Na,K+ ATPase α1, quarto painel). (B-E) Densitometria de Western Blots de frações celulares isoladas de culturas celulares U937 com esta técnica. Os resultados são de 3 experimentos independentes. As barras de erro representam o desvio padrão. ANOVA unidirecional. p<0,001. Abreviaturas: GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; VDAC = canal de ânion dependente de tensão; cyto = citosólico; nuc = nuclear; mito = mitocondrial; mem = membrana. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Fracionamento incompleto dos componentes da célula U937. Manchas ocidentais representativas de frações celulares isoladas de uma cultura de células U937 mostrando contaminação da fração citosólica com histona H3 (Lane 1, segundo painel) devido à clarificação inadequada desta fração e uma fração de membrana bruta que não foi submetida à purificação do gradiente de densidade isopínica (Lane 4, todos os painéis). Abreviaturas: cyto = citosólico; nuc = nuclear; mito = mitocondrial; mem = membrana. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fração Rendimento (μg/mL) Desvio padrão Volume aproximado
Citoplasma 1500 146 5 mL
Núcleo 1200 172 500 μL
Mitocôndria 400 66 500 μL
Membrana 200 23 500 μL

Tabela 1: Rendimento proteico para cada fração subcelular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este método é uma versão modificada de uma abordagem previamente publicada para o fracionamento subcelular sem o uso de centrifugação de alta velocidade11. Este método modificado requer equipamentos mais especializados para alcançar os melhores resultados, mas é mais abrangente e consistentemente reprodutível.

O desenvolvimento do protocolo inicial foi necessário devido à incapacidade de separar amostras mitocondriais e de membrana para a análise da localização proteica durante a necroptose12. As tentativas de usar os métodos exclusivamente à base de detergente encontrados na maioria dos kits comercialmente disponíveis resultaram em uma mistura homogênea contendo a membrana plasmática e todas as organelas fechadas por membrana na célula. Outras limitações desses kits incluem a incapacidade de fazer alterações no procedimento, o custo por amostra, as restrições de volume e o número de amostras que podem ser processadas. O procedimento aqui apresentado pode ser alterado para qualquer escala, alterado para isolar menos frações e pode ser realizado sem o uso de reagentes caros. Os rendimentos de frações podem ser aumentados utilizando mais células; as etapas podem ser adaptadas à pesquisa que está sendo realizada; e a execução do método é flexível. Por exemplo, se os pesquisadores não estão examinando uma fração subcelular específica, eles não precisam isolar essa amostra no decorrer do procedimento. Da mesma forma, a adição de inibidores ou reagentes específicos pode ser omitida se o pesquisador não planeja estudar o estado de fosforilação das proteínas (ortovanadato de sódio) ou não estiver preocupado com a desnaturação de proteínas (hexilenoglicol).

O uso de iodixanol como solução de gradiente de densidade é opcional; no entanto, este reagente não interfere com o exame subsequente das amostras através de western blotting. Também é possível remover o iodaxanol das amostras por diluição e centrifugação para recuperar as mitocôndrias ou membrana, embora isso afete o rendimento final. Outras soluções alternativas de gradiente de densidade podem ser usadas, incluindo sacarose. Para obter resultados ótimos e frações puras, existem vários fatores a serem considerados e etapas críticas específicas no protocolo que precisam de atenção cuidadosa. Este protocolo é otimizado para o fracionamento de células U937, e a concentração de células recomendadas em pontos específicos do protocolo são específicas para esta linhagem celular. Esses valores foram determinados empiricamente e provavelmente precisarão ser ajustados para diferentes tipos de células, particularmente, se resultados subótimos forem obtidos ao executar o protocolo.

O esclarecimento da amostra citoplasmática deve ocorrer o mais rápido possível para remover células ininterruptas e detritos que possam resultar em contaminação cruzada por proteínas de outras frações subcelulares (Figura 4, Faixa 1, segundo painel). A homogeneização pode ser realizada com qualquer forma de lise mecânica, embora os resultados aqui apresentados tenham sido obtidos usando um método baseado em contas e um dispositivo de liquidificador. Formas manuais alternativas de homogeneização (um homogeneizador Dounce ou passagem por uma agulha de pequeno calibre) também podem ser utilizadas, mas podem resultar em problemas de reprodutibilidade devido à variabilidade da técnica pelo indivíduo que realiza o procedimento. O interesse deste grupo é principalmente em leucócitos circulantes, razão pela qual as células U937 são usadas neste procedimento. No entanto, este procedimento pode ser aplicado a outras linhagens de células de suspensão com provavelmente pouca necessidade de alteração. As porções que podem precisar ser ajustadas para acomodar outra linhagem celular em suspensão incluem as concentrações celulares usadas durante todo o procedimento, bem como a concentração de digitonina usada para extrair a fração citosólica.

Embora não seja otimizado para linhagens celulares aderentes, esse procedimento pode servir como ponto de partida para que ajustes possam ser feitos para acomodar células aderentes. Esses ajustes incluem concentração celular, concentração de digitonina e tempo de homogeneização. Além disso, as células aderentes são limitadas pela área de superfície, enquanto as células de suspensão são limitadas pelo volume; isso torna a ampliação das células de suspensão mais simples. Para ampliar as células aderentes, placas de cultura de tecidos com uma grande área de superfície (>500 cm2) devem ser utilizadas. Este procedimento é um fracionamento subcelular reprodutível e custo-efetivo com a capacidade de separar frações citosólicas, nucleares, mitocondriais e de membrana com grande pureza. Uma das maiores vantagens deste procedimento é a separação da mitocôndria da fração membrana. Isto não é possível em procedimentos exclusivamente à base de detergentes. Embora os detergentes sejam utilizados neste procedimento, eles são usados para permeabilizar, mas não romper a membrana plasmática (digitonina) e para obter a fração nuclear após o isolamento das frações mitocondrial e membrana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R15-HL135675-01 e NIH 2 R15-HL135675-02 para T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Bioquímica Edição 174 Fracionamento celular Nuclear Mitocôndrias Membrana Citoplasma Organelas Ultracentrifugação Gradiente de Densidade U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter