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Biochemistry

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

Abstract

이 프로토콜은 세제, 기계적 용해 및 등핵 밀도 구배 원심분리의 조합을 사용하여 포유동물 세포로부터 세포내 단백질 분획을 얻는 방법을 설명합니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 세포 내 분획을 얻기 위해 가용화 세제의 단독 사용에 의존하지 않는다는 것입니다. 이것은 원형질막을 세포의 다른 막 결합 세포 기관으로부터 분리하는 것을 가능하게한다. 이 절차는 재현 가능하고 확장 가능하며 선택적인 방법으로 세포에서 단백질 국소화의 결정을 용이하게 할 것입니다. 이 방법은 인간 단핵구 세포주 U937에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 원형질막 단백질을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 세포주에 최적화되어 있지만, 이 절차는 다른 세포주의 세포하 분획을 위한 적합한 시작점으로서 작용할 수 있다. 절차의 잠재적 함정과 이를 피하는 방법은 다른 세포주에 대해 고려해야 할 수 있는 변경 사항과 마찬가지로 논의됩니다.

Introduction

세포 내 분획은 세포를 용해시키고 여러 가지 방법을 통해 구성 성분으로 분리하는 절차입니다. 이 기술은 연구원들이 포유류 세포에서 단백질 국소화를 결정하거나 다른 방법으로는 검출할 수 없는 저농도 단백질의 농축에 사용할 수 있습니다. 세포 내 분획 방법이 현재 존재하지만 구입할 수있는 상업용 키트와 마찬가지로이 절차가 극복하려고 시도하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 대부분의 세포 분획 방법은 독점적으로 세제 기반1,2이며, 다양한 세포 구성 요소를 가용화하기 위해 증가하는 양의 세제를 포함하는 완충액을 사용합니다. 이 방법은 빠르고 편리하지만 불순한 분획을 초래합니다. 이들은 연구자들이 세포의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 쉽게 분리 할 수 있도록 설계되었지만 동시에 샘플에서 여러 세포 내 분획을 분리 할만큼 복잡하지는 않습니다. 세제에만 의존하면 일반적으로 막으로 둘러싸인 세포 기관과 원형질막이 무차별적으로 가용화되어 이러한 구성 요소의 분리가 어려워집니다. 이러한 키트의 사용으로 인한 추가적인 복잡성은 대부분의 구성 요소가 독점 제형이기 때문에 연구자가 특정 응용 분야에 맞게 키트를 변경/최적화할 수 없다는 것입니다. 마지막으로, 이러한 키트는 엄청나게 비쌀 수 있으며 사용 횟수에 제한이 있어 더 큰 샘플에 적합하지 않습니다.

세제에 의존하지 않는 미토콘드리아 분리용 키트를 사용할 수 있음에도 불구하고 원형질막을 분리하고 표준 분리 프로토콜 3,4보다 훨씬 적은 양의 샘플을 생성하도록 설계되지 않았습니다. 차등 원심분리 방법은 시간이 더 많이 걸리지만 세제 기반 키트1만으로는 얻을 수 없는 뚜렷한 분획을 생성하는 경우가 많습니다. 가용화 세제만 사용하지 않고 분리하면 초원심분리 및 등압 밀도 구배를 사용하여 추가 정제가 가능하여 교차 오염이 줄어듭니다. 이 분획 프로토콜은 세제 및 고속 원심분리 기반 접근법의 조합을 사용하여 U937 단핵구에서 세포 내 분획을 분리하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 포유류 세포의 핵, 세포질, 미토콘드리아 및 원형질막 성분의 분리를 용이하게 할 것이며 분획들 사이의 오염을 최소화 할 것이다.

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Protocol

1. 완충액 및 시약 준비

  1. 포스파타아제와 프로테아제 억제제의 신선한 용액을 준비하십시오.
    1. 100% 에탄올 1mL에 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 17.4mg을 첨가하여 100mM 스톡을 제조하였다.
      알림: PMSF를 섭취하거나 흡입하거나 피부나 눈에 닿으면 위험하므로 취급할 때는 보호 장비를 착용하십시오. 눈과 피부에 부식성이 있습니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 프로테아제 억제제 칵테일(100x)을 준비합니다.
    3. 91.9mg의 나트륨 오르토바나데이트(SOV)를 1mL의 탈이온수에 첨가하여 500mM 스톡을 제조합니다.
      알림: SOV를 섭취하거나 흡입하거나 눈에 닿으면 위험하므로 취급 시 보호 장비를 착용하십시오. 심한 과다 노출은 사망을 초래할 수 있습니다.
  2. 용해 완충액 A, 세포질 분리 (CI) 완충액, 세포 가용화 (CS) 완충액, 핵 용해 (NL) 완충액, 용해 완충액 B, 세포 균질화 (CH) 완충액, 요오드 산올 희석제 및 세제를 준비합니다.
    1. 8.7g의 염화나트륨 (NaCl)과 50mL의 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (hepes, 1M, pH 7.4)을 950mL의 탈 이온수에 첨가하여 용해 완충액 A (최종 농도 150mM NaCl 및 50mM hepes)를 준비합니다.
    2. 다음과 같이 세제의 저장 용액을 준비하십시오 : 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 1 % SDS)에 0.1g의 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 첨가하고, 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 1 %)에 0.1g의 데 옥시 콜산 나트륨을 첨가하고, 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 250μg / mL)에 2.5mg의 digitonin을 첨가하고, 1mL의 비이온성, 비변성 세제( 재료 표 참조)를 9mL의 용해 완충액 A(최종 농도 10%(v/v))에 추가합니다.
    3. 10μL의 PMSF 스톡 (100 mM), 10 μL의 프로테아제 억제제 (100x), 2 μL의 SOV 스톡 (500 mM) 및 100 μL의 스톡 디토닌 (250 μg / mL)을 878 μL의 용해 완충액 A (1 mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV 및 25 μg / mL digitonin의 최종 농도)에 첨가하여 CI 완충액을 준비합니다. 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    4. 10μL의 PMSF 스톡(100mM), 10μL의 프로테아제 억제제(100x), 2μL의 SOV 스톡(500mM), 100μL의 비이온성, 비변성 세제 스톡( 재료 표 참조)(10%), 및 118μL의 헥실렌 글리콜 스톡(8.44M)을 760μL의 용해 완충액 A(1mM PMSF의 최종 농도, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV, 1 % 비 이온성, 비 변성 세제 및 1 M 헥 실렌 글리콜). 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    5. 10μL의 PMSF 스톡 (100 mM), 10 μL의 프로테아제 억제제 (100x), 2 μL의 SOV 스톡 (500 mM), 50 μL의 나트륨 데옥시콜레이트 스톡 (10%), 100 μL의 SDS 스톡 (1%) 및 118 μL의 헥실렌 글리콜 스톡 (8.44 M)을 710 μL의 용해 완충액 A (1 mM PMSF의 최종 농도, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 (v / v), 0.1 % SDS (w / v) 및 1 M 헥 실렌 글리콜). 핵 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    6. 헤페스 20mL (1M, pH 7.4), 염화칼륨 (KCl) 0.74g, 염화마그네슘 (MgCl2) 0.19g, 에틸렌 디아민테트라 아세트산 2mL (0.5M EDTA), 에틸렌 글리콜 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (0.5M EGTA), 만니톨 38.3g 및 자당 23.9g을 탈이온수 980mL에 첨가하여 용해 완충액 B (최종 농도 20mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mMMgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM 만니톨, 및 70 mM 수크로스).
    7. 988μL의 용해 완충액 B에 10μL의 PMSF 스톡 (100mM) 및 2μL의 SOV 스톡 (500mM)을 첨가함으로써 CH 완충액을 준비한다 (1mM PMSF 및 1mM SOV의 최종 농도; 용해되는 세포의 수를 수용하도록 최종 부피를 조정). 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    8. 88 mL의 탈이온수(최종 농도 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mMMgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM 만니톨, 및 420 mM 수크로오스).
    9. 완충액은 4 ° C에서, 디지토닌은 -20 ° C에서 보관하십시오.

2. 세포질 단백질 분리

참고: 다음 단계는 U937 세포의 성장 및 확장과 세포질 단백질의 추출을 허용합니다. 사용 된 농도에서 digitonin은 원형질막을 방해하지 않고 투과시켜 세포질 단백질의 방출과 다른 세포 단백질의 보유를 허용합니다.

  1. 세포를 RPMI 1640에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청 및 5%CO2로 배양한다. 세포가 최종 합계 6 x 108 세포로 성장하는지 확인합니다.
    참고: 이 프로토콜에서, 세포는 표준 혈구계 및 현미경을 사용하여 계수되었다.
  2. 배양된 세포를 400×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 버린 후 세포 펠릿을 실온 인산염 완충 식염수(PBS)에 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 부드럽게 피펫하여 덩어리를 분해합니다.
  3. 세포 현탁액을 400 ×g에서 10 분 동안 원 심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 폐기하고 세포 펠릿을 2 × 107 cells/mL의 최종 농도로 빙냉 용해 완충액 A(단계 1.2.1에서 제조)에 재현탁합니다.
  4. 용해 완충액 A (3 × 107 세포)에 현탁된 7.5 mL의 세포를 제거하고, 핵 단백질 추출을 위해 얼음 위에 보관한다(섹션 6). 세포 현탁액을 4°C, 400 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다.
    알림: 4 ° C 또는 얼음에서 모든 후속 단계를 수행하고 모든 버퍼를 미리 냉각하십시오.
  5. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 CI 버퍼에 2 × 107 cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 부드럽게 피펫하여 덩어리를 분해합니다. 세포 현탁액을 4°C에서 20분 동안 끝에서 끝까지 회전시킵니다.
  6. 세포 현탁액을 4°C, 400 × g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포 펠릿을 저장하고 얼음에 보관하십시오. 수집된 상청액을 4°C, 18,000 × g 에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화한다.
    참고: 이 고속 원심분리 단계는 세포질 분획이 세포 기관 및 막 결합 단백질로 오염되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
  7. 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮긴 후 펠릿을 폐기하십시오. 원심분리 후 펠릿이 얻어지지 않을 때까지 2.6단계의 두 원심분리 단계를 반복합니다.
  8. 세포질 분획 인 상청액을 수집하십시오. 단기 보관(1개월)의 경우, 상청액이 4°C에서 저장되는지 확인한다. 장기 보관(>1개월)을 위해 상청액을 1x 환원제가 포함된 1x Laemmli 완충액과 결합하고 95°C에서 7분 동안 가열하고 -20 또는 -80°C에서 보관하십시오.
  9. 용해 완충액 A에 세포 펠릿(단계 2.6에서)을 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 피펫을 부드럽게 사용하여 덩어리를 부수십시오.

3. 세포 균질화

참고: 다음 단계는 미토콘드리아 및 막 단백질 분획의 분리에 필요한 디지토닌 처리된 세포(2.9단계에서)의 기계적 균질화를 허용합니다.

  1. 용해 완충액 A (단계 2.9에서 제조)에서 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 저장하고, 상청액을 버리고 세포 펠릿으로부터 과량의 디지토닌 및 세포질 오염 물질을 제거한다.
    알림: 과도한 세포질 오염 물질을 제거하기 위해 용해 완충액 A에서 반복적인 세척을 수행할 수 있습니다.
  2. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 CH 완충액(단계 1.2.7에서 제조됨)에 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 기계적 용해를 위해 비드 기반 방법을 사용하는 경우 미리 세척된 스테인리스 스틸 3.2mm 비드 30g을 50mL 스커트 튜브에 넣고 15mL의 용해 완충액 B를 채우고 얼음 위에 올려 식힙니다. Dounce 균질화기(꽉 끼는 B 유봉 포함)를 사용하는 경우 적절한 양의 용해 완충액 B를 채우고 유봉을 넣고 얼음 위에 올려 식힙니다.
  4. 인큐베이션 후(단계 3.2), 용해 완충액 B를 비드 튜브(또는 Dounce 균질화기)로부터 버리고, 15mL의 세포 현탁액을 비드 튜브(또는 균질기에 적절한 부피)로 옮깁니다.
  5. 비드 기반 방법을 사용하는 경우 셀 현탁액이 포함된 스커트 비드 튜브를 블렌더 장치에 놓고 속도 8에서 5분 동안 작동하도록 구성합니다. Dounce 균질화기를 사용하는 경우 얼음 위에 보관하고 느리고 균일한 스트로크를 사용하여 유봉으로 40회 패스를 수행합니다(또는 토론 섹션에 자세히 설명된 대로 기계적 세포 용해의 대체 방법을 활용).
    알림: 여기에 사용된 것과 다른 블렌더 장치를 사용하는 경우 속도와 시간을 경험적으로 결정해야 할 수 있습니다.
  6. 균질액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 400× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 저장합니다. 펠릿을 폐기하십시오.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 균질액은 단기간(24시간) 동안 4°C에서 저장될 수 있습니다.

4. 조잡한 미토콘드리아 및 막 분획의 파편 제거 및 분리

참고: 다음 단계는 균질액을 증가하는 속도로 원심분리하여 세포 파편을 제거할 수 있습니다. 그 다음에는 미토콘드리아 및 막 분획의 분리를 위한 차등 원심분리가 이어집니다.

  1. 균질액(단계 3.6으로부터)을 500 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
  2. 상청액(단계 4.1로부터)을 1,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
  3. 상청액(단계 4.2로부터)을 2,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
  4. 상청액(단계 4.3에서부터)을 4,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 미토콘드리아 분획인 펠릿을 저장합니다.
  5. 상청액(단계 4.4로부터)을 18,000 × g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 조막 분획인 펠릿을 저장합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있으며 펠렛화된 샘플은 단기간(24시간) 동안 4°C에서 보관됩니다.

5. 등핵 밀도 구배 정제

참고: 다음 단계는 isopycnic 밀도 구배 원심분리를 사용하여 미토콘드리아 및 막 분획을 정제합니다.

  1. 1 부 희석제 (단계 1.1.3에서 준비)와 5 부 요오드 (60 % 저장 용액 (w / v))를 혼합하여 요오드 딕산올의 50 % (v / v) 작업 용액을 준비합니다. 10% 작업 용액(v/v)과 50% 작업 용액(v/v)을 적절한 양의 용해 완충액 B와 혼합하여 10%, 50%, 25%, 30% 및 35% 요오드 딕산올 용액(v/v)을 준비합니다.
  2. 미토콘드리아 및 막 펠릿(4.4단계 및 4.5단계)을 각각 200μL의 용해 완충액 B에 재현탁합니다. 재현탁된 펠릿 200μL에 1800μL의 작동 요오딕산올 용액(50%(v/v))을 추가하여 45% 요오드딕사놀(v/v)로 조정합니다.
  3. 다음과 같이 iodixanol 불연속 구배를 만듭니다(초원심분리 튜브의 용량에 맞게 부피 조정): 1mL의 15% 요오드옥산올(v/v)을 8mL의 개방형 벽이 얇은 초원심분리기 튜브의 바닥에 추가하고 1mL의 20% 요오드옥산올(v/v)을 첫 번째 층 아래에 놓고(밑받침 기술에 의해) 25%의 1mL를 밑에 깔고, 1mL의 30 % 및 1 mL의 35 % 요오드 딕산올 (v / v).
    참고: 이 단계에서 2개의 그래디언트가 생성되어야 하며, 1개는 미토콘드리아 분획이고 1개는 막 분획입니다.
  4. 1 그래디언트에서 언더레이 기술을 사용하여 2mL의 미토콘드리아 펠릿(45% 요오드 딕산올(v/v)에 현탁)을 35% 요오드 산올(v/v) 아래의 튜브 바닥에 추가합니다. 다른 그래디언트에서는 언더레이 기술을 사용하여 2mL의 조막 펠릿(45% 요오드옥산올(v/v)에 현탁)을 35% 요오드 산올(v/v) 아래의 튜브 바닥에 추가합니다.
  5. 1mL의 10% 요오드옥산올(v/v)을 15% 층 위에 오버레이하여 각 그래디언트 튜브의 상단에 추가합니다. 0.1% 요오드산올(v/v)을 첨가하여 서로 10g 이내의 튜브의 균형을 맞춥니다.
  6. 밀도 구배 튜브를 4°C에서 100,000×g에서 18시간 동안 돌 립니다. 가속 및 감속을 사용 중인 초원심분리기의 최소값으로 설정해야 합니다.
    참고: 미토콘드리아 구배에서 25%와 30% 요오드산올(v/v) 사이의 계면에 가시적인 밴드가 있습니다. 이것은 순수한 미토콘드리아 분획입니다. 막 구배에서 15% 요오드 딕산올(v/v) 분획에 가시적인 밴드가 있습니다. 이것은 순수한 막 분획입니다. 막 구배에서 25% 및 30% 요오드옥산올(v/v) 분획에 추가 밴드가 있을 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 오염입니다.
  7. 1mL 분취량으로 튜브 상단에서 분획을 수집하되, 눈에 보이는 띠가 포함된 분획의 부피를 최소화하고 각 층이 수집된 후 피펫 팁을 교체하도록 주의하십시오. 또는 얇은 벽 튜브의 측면을 바늘로 뚫고 보이는 밴드를 수집하십시오.
  8. 단백질 분석 및 웨스턴 블롯에 의한 검증이 있을 때까지 단계 2.8에 기재된 바와 같이 샘플을 저장한다.

6. 핵 단백질 분리

알림: 이온 및 비이 온성 세제뿐만 아니라 초음파 처리 및 원심 분리와 같은 기술을 사용하여 다음 단계는 모든 세포막을 용해시키고 핵 단백질의 분리를 허용합니다.

  1. 용해 완충액 A에 현탁된 세포의 7.5 mL 분취량을 원심분리하고(단계 2.4에서), 상청액을 버린다. 800μL의 얼음처럼 차가운 CS 완충액(1.2.4단계에서 준비)을 추가하고 피펫팅 및 볼텍싱을 통해 펠릿을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 (또는 4 ° C)에서 30 분 동안 배양하여 핵 단백질을 보호하면서 혈장과 세포 기관 막을 파괴합니다.
  2. 세포 현탁액을 7,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다. 1U/μL 벤조나아제를 함유한 후 800μL의 빙냉 NL 완충액(단계 1.2.5에서 제조됨)을 핵 펠릿에 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 다시 부유시킵니다. 4 ° C에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 회전 장치에서 배양하여 핵막을 파괴합니다.
  3. 벤조나제(6.2단계에서 추가됨)와 함께 핵산을 전단하는 얼음 욕조(3x, 펄스 사이에 5초 일시 중지)에서 냉각된 샘플 튜브를 사용하여 20% 전력으로 5초 동안 초음파 처리합니다.
  4. 4°C에서 10 분 동안 7,800×g에서 초음파 분리합니다. 핵 분획 인 상청액을 수집하고 저장하십시오. 상청액을 수집하는 동안 불용성 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 저장을 위해, 샘플은 단계 2.8에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

7. 단백질 정량화 및 웨스턴 블롯 분석

참고: 다음 단계는 각 분획의 총 단백질을 정량화하고 세포하 분획의 순도를 확인합니다.

  1. 표준 Bradford 분석을 수행하여 각 분획의 총 단백질을 정량화합니다. 예상 단백질 수율은 표 1 을 참조하십시오.
    참고: 비신코닌산(BCA) 분석 또는 280nm에서의 흡광도와 같은 기타 단백질 분석을 사용하여 Bradford 분석 대신 총 단백질을 측정할 수 있습니다.
  2. 분획을 1x 환원제를 함유한 1x Laemmli 완충액과 결합하고 95°C에서 7분 동안 가열합니다. 각 분획 10μg을 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에 넣고 20mA에서 1시간 동안 겔을 실행합니다.
  3. 100V에서 30분 동안 표준 면역블롯 전달을 수행하여 분해된 단백질을 폴리비닐디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 실온에서 30분 동안 0.1%의 비이온성 세제(v/v)를 함유한 1x 트리스 완충 식염수(TBS)에 5% 우유로 차단합니다.
  4. 적절한 1차 항체를 추가하여 각 세포하 분획에 특이적인 하우스키핑 단백질을 검출하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 실온에서 10분 동안 비이온성 세제(v/v) 0.1%가 포함된 1x TBS에 5% 우유로 멤브레인을 세척합니다.
    참고: 이 프로토콜의 경우 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH, 1:10000), 히스톤 H3(1:2000), 전압 의존성 음이온 채널(VDAC, 1:1000) 및 Na,K+-ATPase에 대한 항체를 각각 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 분획에 사용했습니다.
  5. 적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 접합 2 차 항체를 멤브레인에 첨가하고 (제조업체의 지침에 따라 희석) 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 실온에서 10분 동안 비이온성 세제(v/v) 0.1%가 포함된 1x TBS에 5% 우유로 멤브레인을 세척합니다. 표준 화학 발광을 사용하여 블롯을 개발하십시오.

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Representative Results

이 절차의 개략적인 순서도(그림 1)는 현탁액에서 성장한 U9375 세포를 성공적으로 분획하기 위해 취한 단계를 시각적으로 요약합니다. 동일한 부피(1mL)의 등핵 밀도 구배의 상단에서 수집된 분획은 미토콘드리아 및 막 분획의 정제를 보여줍니다(그림 2). 외부 미토콘드리아 막6에 국한된 단백질인 VDAC에 대한 항체를 활용하면 미토콘드리아 분획이 25% 및 30% 요오드딕산올(v/v) 분획으로 이동했음을 보여줍니다(그림 2A). 원형질막7에서 주로 발견되는 통합 막 이종이량체의 일부인 Na,K+-ATPase α1 서브유닛에 대한 항체를 사용하여 순수한 미토콘드리아 분획으로부터 막 오염의 분리를 보여줍니다(그림 2A). 순수한 막 분획은 가장 밀도가 낮은 분획인 10% 및 15% 요오드 딕산올(v/v)로 이동했습니다(그림 2B). 막 분획의 미토콘드리아 오염은 구배에 의해 분리되었다.

추가 국소화 마커 (7.4 단계에서 참조)로 수행 된 웨스턴 블롯8은 세포질 및 핵 분획의 순도를 보여 주며 미토콘드리아 및 막 샘플이 세포의 다른 부분의 단백질에 의한 오염이 없음을 추가로 확인합니다 (그림 3). 일반적으로 세포9의 세포질에 국한된 GAPDH에 대한 항체를 사용하여, 이 단백질은 세포질 분획에서만 발견되고(도 3A, Lane 1, 첫 번째 패널), 추출된 핵 단백질, 밀도-정제된 미토콘드리아 또는 막 분획(도 3A; 레인 2, 3 및 4; 첫 번째 패널). 핵에서 발견되고 염색질 구조10에 관여하는 단백질인 히스톤 H3에 대한 프로빙은 세포질 분획에서 약간의 검출과 미토콘드리아 또는 막 분획에서 교차 오염이 없는 성공적인 핵 추출을 보여줍니다(그림 3A, Lane 2, 두 번째 패널).

모든 분획에서 VDAC에 대한 프로빙은 순수한 미토콘드리아 분획에서 이 단백질의 존재를 보여주며(그림 3A, Lane 3, 세 번째 패널), 다른 분획에는 교차 오염이 존재하지 않음을 보여줍니다(그림 3A; 레인 1, 2 및 4; 세 번째 패널). Na / K-ATPase α1 서브 유닛에 대한 프로빙은 유사하게이 단백질이 순수한 막 분획에만 위치한다는 것을 보여줍니다 (그림 3A, 레인 4, 네 번째 패널). 이들 분획을 농도계로 분석하여 재현성 및 통계적 유의성을 확인하였다(도 3B-E). 성공적인 분획 결과(그림 3)와 달리 이 방법을 부적절하게 실행(또는 모든 권장 단계를 준수하지 않음)하면 세포 구성 요소가 교차 오염될 수 있습니다(그림 4). 세포질 분획 (그림 4, 레인 1, 두 번째 패널)에서 고농도의 히스톤 H3는 세포질 분획을 적절하게 명확히하지 못하여 발생할 수 있습니다 (2.6 단계에서 참조). 이는 충분한 정화 원심 분리기 스핀이 수행되지 않거나 세포질 분획이 신속하게 명확하지 않은 경우 발생할 수 있습니다. 세포질 분획이 충분히 빨리 명확하지 않으면 세포 조각이 용해되어 세포질 분획이 오염 될 수 있습니다.

등핵 밀도 정제 단계를 수행하지 않으면 밀도 정제 전에 샘플이 얼마나 이질적인지에 따라 막 분획이 오염됩니다(그림 4, Lane 4, 모든 패널). 프로토콜의 모든 단계에 대한 적절한 준수는 세포 내 분획의 원하는 분리를 얻는 데 중요합니다. Bradford 분석을 사용하여 정량화하면 각 분획에 대한 단백질 수율을 결정할 수 있습니다. 분획당 예상 단백질 수율은 표 1에 보고되어 있다. 여러 가지 이유로 웨스턴 블롯을 수행하기 전에 단백질 정량 분석을 수행하는 것이 유용합니다. 첫째, 분획이 실제로 단백질을 함유하고 있음을 확인합니다. 둘째, 단백질 양에 따라 SDS-PAGE 겔을 로딩 할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질 수율이 예상과 유사하다고 가정하면(표 1), 절차의 적절한 실행을 확인합니다.

Figure 1
그림 1: 세포 분획 절차의 다이어그램. 순서도로 표현된 세포 분획 프로토콜의 개요. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; CS = 세포 가용화; NL = 핵 용해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 미숙 미토콘드리아 및 막 분획의 등핵 밀도 정제. (A) 조 미토콘드리아 분획의 밀도 구배 정제 후 수집된 모든 분획의 대표적인 웨스턴 블롯. (b) 조막 분획의 밀도 구배 정제 후 수집된 모든 분획의 대표적인 웨스턴 블롯. 두 밀도 구배 정제 모두 25% 및 30% 요오드 딕산올(v/v) 분획에 대한 미토콘드리아 마커 VDAC의 이동과 10% 및 15% 요오드 딕산올(v/v) 분획에 대한 막 마커 Na, K+ ATPase의 이동을 보여줍니다. 약어: VDAC = 전압 의존 음이온 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: U937 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 분획의 성공적인 분리. (A) 이 기술을 사용하여 U937 세포 배양에서 분리하고 세포질(GAPDH, 첫 번째 패널), 핵(히스톤 H3, 두 번째 패널), 미토콘드리아(VDAC, 세 번째 패널) 및 막(Na,K+ ATPase α1, 네 번째 패널)의 마커를 조사한 대표적인 세포 분획의 웨스턴 블롯. (B-E) 이 기술을 사용하여 U937 세포 배양에서 분리 된 세포 분획의 웨스턴 블롯의 농도계. 결과는 3 개의 독립적 인 실험에서 나온 것입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 단방향 분산 분석. 피<0.001. 약어 : GAPDH = 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; VDAC = 전압 의존형 음이온 채널; 세포 = 세포질; 핵 = 핵; 미토 = 미토콘드리아; 멤 = 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: U937 세포 성분의 불완전한 분획. 이 분획의 부적절한 정화로 인한 히스톤 H3 (레인 1, 제 2 패널) 및 등핵 밀도 구배 정제를 거치지 않은 조막 분획으로 인한 히스톤 H3에 의한 세포질 분획의 오염을 보여주는 U937 세포 배양물로부터 단리된 세포 분획의 대표적인 웨스턴 블롯 (레인 4, 모든 패널). 약어 : 세포 = 세포질; 핵 = 핵; 미토 = 미토콘드리아; 멤 = 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분수 수율 (μg / mL) 표준 편차 대략적인 볼륨
세포질 1500 146 5 밀리리터
핵 1200 172 500 μL
미토콘드리아 400 66 500 μL
양피지 200 23 500 μL

표 1: 각 세포하 분획에 대한 단백질 수율.

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Discussion

이 방법은 고속 원심분리(11)를 사용하지 않고 세포내 분획화에 대한 이전에 공개된 접근법의 수정된 버전이다. 이 수정된 방법은 최상의 결과를 얻기 위해 보다 전문화된 장비가 필요하지만 더 포괄적이고 일관되게 재현할 수 있습니다.

초기 프로토콜의 개발은 괴사12 동안 단백질 국소화 분석을 위해 미토콘드리아 및 막 샘플을 분리 할 수 없기 때문에 필요했습니다. 대부분의 시판되는 키트에서 발견되는 독점적인 세제 기반 방법을 사용하려는 시도는 세포 내의 원형질막과 모든 막으로 둘러싸인 소기관을 포함하는 균질한 혼합물을 초래했습니다. 이러한 키트의 다른 제한 사항으로는 절차를 변경할 수 없음, 샘플당 비용, 부피 제한 및 처리할 수 있는 샘플 수가 있습니다. 여기에 제시된 절차는 모든 규모로 변경 될 수 있고, 더 적은 수의 분획을 분리하도록 변경 될 수 있으며, 값 비싼 시약을 사용하지 않고 수행 할 수 있습니다. 분획 수율은 더 많은 세포를 활용하여 증가시킬 수 있습니다. 단계는 수행중인 연구에 맞게 조정할 수 있습니다. 메서드의 실행은 유연합니다. 예를 들어, 연구자가 특정 세포 내 분획을 검사하지 않는 경우 절차 과정에서 해당 샘플을 분리 할 필요가 없습니다. 마찬가지로, 연구자가 단백질의 인산화 상태를 연구 할 계획이 없거나 (오르토 바나 데이트 나트륨) 단백질 변성 (헥 실렌 글리콜)에 관심이없는 경우 특정 억제제 또는 시약의 첨가를 생략 할 수 있습니다.

밀도 구배 용액으로 요오드 딕산 올을 사용하는 것은 선택 사항입니다. 그러나 이 시약은 웨스턴 블로팅을 통한 샘플의 후속 검사를 방해하지 않습니다. 미토콘드리아 또는 막을 회수하기 위해 희석 및 원심 분리를 통해 샘플에서 iodaxanol을 제거하는 것도 가능하지만 최종 수율에 영향을 미칩니다. 다른 대안적인 밀도 구배 용액이 사용될 수 있으며, 이는 슈크로스를 포함한다. 최적의 결과와 순수 분획을 얻으려면 고려해야 할 몇 가지 요소와 세심한 주의가 필요한 프로토콜의 특정 중요 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 U937 세포의 분획에 최적화되어 있으며 프로토콜의 특정 지점에서 권장되는 세포 농도는 이 세포주에 따라 다릅니다. 이러한 값은 경험적으로 결정되었으며 특히 프로토콜을 실행할 때 차선의 결과가 얻어지는 경우 다른 유형의 셀에 대해 조정해야 할 가능성이 큽니다.

세포질 샘플의 정화는 다른 세포 내 분획의 단백질에 의한 교차 오염을 초래할 수 있는 깨지지 않은 세포와 파편을 제거하기 위해 가능한 한 빨리 이루어져야 합니다(그림 4, 레인 1, 두 번째 패널). 균질화는 모든 형태의 기계적 용해로 수행 할 수 있지만 여기에 제시된 결과는 비드 기반 방법 및 블렌더 장치를 사용하여 얻은 것입니다. 대안적인 수동 형태의 균질화(Dounce 균질화기 또는 작은 게이지 바늘을 통한 통과)도 활용할 수 있지만 절차를 수행하는 개인에 의한 기술의 가변성으로 인해 재현성 문제가 발생할 수 있습니다. 이 그룹의 관심은 주로 순환하는 백혈구에 있으며, 이것이 U937 세포가이 절차에 사용되는 이유입니다. 그러나, 이 절차는 변경이 거의 필요하지 않은 다른 현탁 세포주에 적용될 수 있다. 다른 부유 세포주를 수용하기 위해 조정이 필요할 수 있는 부분에는 절차 전반에 걸쳐 사용되는 세포 농도와 세포질 분획을 추출하는 데 사용되는 디지토닌 농도가 포함됩니다.

부착성 세포주에 최적화되어 있지는 않지만, 이 절차는 부착성 세포를 수용하기 위해 조정될 수 있는 출발점이 될 수 있다. 이러한 조정에는 세포 농도, 디지토닌 농도 및 균질화 시간이 포함됩니다. 또한, 부착 세포는 표면적에 의해 제한되는 반면 부유 세포는 부피에 의해 제한됩니다. 이것은 부유 세포의 확장을 더 간단하게 만듭니다. 부착 세포를 확장하려면 표면적이 큰 조직 배양 플레이트(>500cm2)를 사용해야 합니다. 이 절차는 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 분획을 매우 순도로 분리할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 세포내 분획입니다. 이 절차의 가장 큰 장점 중 하나는 막 분획에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이것은 독점적으로 세제 기반 절차에서는 불가능합니다. 이 절차에는 세제가 사용되지만 투과화에 사용되지만 원형질막 (digitonin)을 파괴하지 않고 미토콘드리아 및 막 분획을 분리 한 후 핵 분획을 얻는 데 사용됩니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작업은 NIH R15-HL135675-01 및 NIH 2 R15-HL135675-02에서 TJL로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

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References

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  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
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Tags

생화학 이슈 174 세포 분획 핵 미토콘드리아 막 세포질 세포 소기관 초 원심 분리 밀도 구배 U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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